RNA結(jié)合基序蛋白25作用的研究進展

趙可心，丁 虹，劉 述，張小衛(wèi)

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

RNA結(jié)合蛋白(RNA binding proteins，RBPs)通常被認(rèn)為是通過一個或多個球狀RNA結(jié)合域(RNA-binding domain)結(jié)合RNA并改變結(jié)合RNA結(jié)構(gòu)或功能的蛋白質(zhì)。RBPs在RNA加工和代謝中起著至關(guān)重要的作用，包括mRNA前體剪接，聚腺苷酸化，mRNA定位、轉(zhuǎn)運和翻譯，mRNA穩(wěn)定性控制和各種類型RNA的編輯[1]。這些年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并研究了數(shù)百種類似的RBPs。RBM25則屬于RBPs家族的一員，是一種新型的全局性剪接因子。已有大量研究表明RBM25與多種疾病相關(guān)，包括心血管疾病與腫瘤，但關(guān)于RBM25的系統(tǒng)研究并不多。本文將主要對RNA結(jié)合基序蛋白25的基本結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)控作用機制與研究進展進行綜述。

1 RBM25的基本結(jié)構(gòu)與功能

1.1 RBM25的基本結(jié)構(gòu)RBM25在真核生物細(xì)胞譜系中的表達(dá)廣泛且較為保守，它含有843個氨基酸，由3個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成：①與RNA結(jié)合的N末端有一個富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域(P)和RNA識別基序(RNA recognition motif，RRM)結(jié)構(gòu)域，②富含精氨酸和谷氨酰胺/精氨酸和天門冬酰胺二肽重復(fù)序列構(gòu)(rich in arginine and glutamine/arginine and asparagine dipeptide repeats，RE/RD-rich)的中央結(jié)構(gòu)域，③與RNA結(jié)合的C末端的脯氨酸-色氨酸-異亮氨酸結(jié)構(gòu)域(the proline-tryptophan-isoleucine domain，PWI)結(jié)構(gòu)域[2]。

RBPs成員擁有共同的RD/RE-rich結(jié)構(gòu)域及PWI結(jié)構(gòu)域。RD/RE-rich結(jié)構(gòu)域有利于將RBM25定位于富含剪接因子的核小體周圍，并與剪接因子如SRm160/300、UsnRNAs相互作用組裝剪接體復(fù)合物并調(diào)控剪接[2]；而且，這種富含RD/RE的基序?qū)τ跇?gòu)建和選擇性剪接所需的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形成是非常重要的[3]。晶體結(jié)構(gòu)解析顯示，PWI結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)主要是由一個高度保守的四股螺旋束組成，它是一類具有結(jié)合DNA和RNA 雙重能力的新型核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，對單鏈和雙鏈的核酸均具有相似的親和力[4]。

1.2 RBM25的功能選擇性剪接是基因表達(dá)的普遍調(diào)節(jié)機制，其允許從單個基因產(chǎn)生一個以上的獨特mRNA種類，從而產(chǎn)生許多蛋白質(zhì)異構(gòu)體，通常具有不同的生物功能。

RBM25是公認(rèn)的在整個真核細(xì)胞系中都高度保守的剪接因子[4]。高通量測序顯示，RBM25促進了整個人類基因組中至少20%的選擇性剪接[5]。同時，人們對剪接事件的轉(zhuǎn)錄組范圍分析表明，RBM25不僅調(diào)節(jié)了整個人類基因組中大部分外顯子的剪接，它還通過充當(dāng)pre-mRNA剪接的調(diào)節(jié)劑來影響總體轉(zhuǎn)錄水平，從而影響更為廣泛的基因表達(dá)程序，進而影響細(xì)胞代謝中涉及的途徑。而且，RBM25 還可以作為剪接因子通過與剪接過程中外顯子識別相關(guān)的因子相互作用，即RBM25與富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2(serine and arginine rich splicing factor 2，SRSF2)的RS區(qū)域特異結(jié)合能夠促進選擇性弱持續(xù)外顯子的剪接保留。此外，對蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，RBM25通過其各個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與剪接體的核心元件以及替代剪接調(diào)節(jié)劑相互作用[5]。以上這些結(jié)果均說明RBM25是一個全方位性的可變剪接因子。

2 RBM25的調(diào)控作用機制

2.1 RBM25與snRNP和LUC7L3RBM25是一個調(diào)控Pre-mRNA剪接的剪接因子，mRNA前體的剪接發(fā)生在剪接體中，該剪接體通過添加小核糖核核蛋白(small nuclear ribonucleoproteins，snRNP)顆粒和許多輔助的非snRNP剪接因子進行逐步組裝，而內(nèi)含子的切除和外顯子的結(jié)合取決于剪接機制對5′剪接位點(5′ss)和3′剪接位點(3′ss)的識別和使用[6]。在mRNA前體剪接的早期，內(nèi)含子的5′ss序列被核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)及其相關(guān)蛋白結(jié)合，形成U1 snRNP[7]；想要形成一個完整組裝的剪接體，U1 snRNA堿基配對識別5′ss并被U1 snRNP穩(wěn)定是這個過程中至關(guān)重要的一環(huán)。

Fig 1 Schematic diagram of RNA-binding motif protein 25P:The N-terminal bound to RNA has a proline-rich domain;RRM:RNA recognition motif domain;RE/RD-rich:rich in arginine and glutamine/arginine and asparagine dipeptide repeats;PWI:the proline-tryptophan-isoleucine domain binding to the C-terminal of RNA.

LUC7L3(LUC7 like 3 pre-mRNA splicing factor)被稱為對酸中毒和缺氧敏感的剪接因子，是酵母U1 snRNP的相關(guān)因子。LUC7L3具有兩個鋅指結(jié)構(gòu)：第一個鋅指結(jié)構(gòu)交聯(lián)pre-mRNA，是LUC7L3剪接活性所必需的；LUC7L3可通過其第二個鋅指結(jié)構(gòu)充當(dāng)pre-mRNA和U1 snRNP之間的橋梁。RBM25與LUC7L3的人類同源物選擇性相關(guān)，并且RBM25的作用是由LUC7L3介導(dǎo)的，RBM25選擇性地與LUC7L3結(jié)合，并通過與外顯子剪接順式元件CGGGCA的相互作用穩(wěn)定Pre-mRNA-U1 snRNP，從而激活5′ss，最終完成剪接過程[8]。

2.2 RBM25與SCN5ASCN5A是編碼心臟鈉通道(Nav1.5)的α亞基，該亞基負(fù)責(zé)產(chǎn)生激發(fā)在心肌細(xì)胞中傳播正常的內(nèi)向鈉電流(INa)功能[9]。掃描整個SCN5A mRNA序列顯示：在檢測到SCN5A剪接變異體的地方，只有一個RBM25的單一結(jié)合位點；并且發(fā)現(xiàn)剪接因子RBM25的順式元件CGGGCA在SCN5A變體E28C和E28D的剪接位點附近。通過凝膠遷移率遷移分析表明：RMB25與SCN5A第28外顯子的規(guī)范序列CGGGCA特異性結(jié)合，導(dǎo)致SCN5A mRNA異常剪接，產(chǎn)生E28C和E28D兩個截短的轉(zhuǎn)錄物變體，從而激活了UPR(未折疊蛋白反應(yīng))，并且這種激活進一步降低了SCN5A的全長mRNA轉(zhuǎn)錄豐度，全長SCN5A mRNA和蛋白質(zhì)減少，從而導(dǎo)致Na+電流減少。證實了剪接調(diào)節(jié)因子RMB25的上調(diào)與下調(diào)是引起SCN5A mRNA異常剪接的必要條件[10]。

2.3 RBM25與Bcl-2眾所周知，程序性細(xì)胞死亡(稱為凋亡)在發(fā)育和疾病的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。B淋巴細(xì)胞瘤(B-cell lymphoma，Bcl)蛋白可以是促凋亡的，也可以是抗凋亡的，這具體取決于Bcl-2同源性(BCL-2 homology，BH)結(jié)構(gòu)域的存在[11]。Bcl-2家族成員Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bcl-x)是具有多個BH結(jié)構(gòu)域的一種線粒體跨膜蛋白，它可以調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性并響應(yīng)于不同的刺激后將細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，具有調(diào)節(jié)內(nèi)在凋亡通路的功能[12]。Bcl-x基因由3個外顯子組成，其中，Bcl-x外顯子2的可變剪接事件產(chǎn)生了兩種拮抗細(xì)胞存活的Bcl-x亞型：抗凋亡的長亞型(Bcl-xL)和促凋亡的短亞型(Bcl-xS)，有多種剪接因子和信號通路會影響B(tài)cl-xL /Bcl-xS剪接比，包括富含絲氨酸/精氨酸的蛋白質(zhì)，異質(zhì)核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs)，轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子[13]。

有研究表明，RBM25表達(dá)增加與細(xì)胞凋亡增加相關(guān)。RBM25通過與位于外顯子2內(nèi)的CGGGCA序列與Bcl-x RNA特異性結(jié)合，并以劑量依賴的方式促進促凋亡Bcl-xS 5′ss的選擇能力，導(dǎo)致Bcl-xS與Bcl-xL的比率增加，最終促進細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。

2.4 RBM25與p53和circAMOTL1L-miR-193a-5p-Pcdha通路p53蛋白(protein p53,p53)，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)和微小RNA(micro RNA，miRNA)是激活癌癥轉(zhuǎn)移中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)程序的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。研究顯示，人類前列腺癌(prostatic cancer，PCa)中類血管動蛋白1(angiomotin like 1，Amotl1)衍生的circRNA被稱為circAMOTL1L，而circAMOTL1L的降低通過下調(diào)E-鈣黏著蛋白和上調(diào)波形蛋白促進PCa細(xì)胞的遷移和侵襲，從而導(dǎo)致EMT和PCa的發(fā)展，而circAMOTL1L充當(dāng)海綿結(jié)合PCa細(xì)胞中的miR-193a-5p，從而減輕了對Pcdha的miR-193a-5p的抑制基因簇(鈣粘蛋白超家族成員的子集)，因此由circAMOTL1L下調(diào)介導(dǎo)的circAMOTL1L-miR-193a-5p-Pcdha調(diào)節(jié)途徑的失調(diào)有助于體內(nèi)PCa的生長。此外，該研究表明RBM25能夠直接綁定到circAMOTL1L并誘導(dǎo)其生物發(fā)生，而p53則通過RBM25基因的直接激活來調(diào)節(jié)EMT[14]。

3 RBM25在心血管疾病中的研究進展

3.1 RBM25與心力衰竭心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)發(fā)病率高,治愈率低,死亡率大,現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅人類健康疾病[15]。心力衰竭(heart failure，HF)是心血管疾病中一種常見的、進展性的、復(fù)雜的臨床綜合征，是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，并且是全球范圍內(nèi)死亡的主要原因，給社會和個人帶來了極大的健康威脅和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。然而，導(dǎo)致HF發(fā)病率和死亡率高的主要原因之一是與之相關(guān)的心律失常[16]。

電壓門控鈉通道負(fù)責(zé)可興奮細(xì)胞(如神經(jīng)元、肌肉和肌細(xì)胞)中動作電位的起始和傳播。心臟鈉離子通道通過響應(yīng)膜去極化而迅速激活，并通過膜向內(nèi)傳導(dǎo)鈉離子，從而產(chǎn)生心臟動作電位的上升,動作電位上升的速率依賴于電壓門控鈉通道的快速激活，控制著動作電位通過心臟組織傳播的速率和均勻性[17]。電壓門控NaV1.5是心肌細(xì)胞表達(dá)的主要鈉通道，突變或病理生理條件導(dǎo)致的NaV1.5功能障礙會導(dǎo)致危及生命的心律失常[18]。SCN5A編碼的鈉通道的活性決定了心臟的去極化和電傳導(dǎo)，而編碼傳導(dǎo)Na+電流(INa+)的離子通道的SCN5A基因突變可能導(dǎo)致心律失常[9]。SCN5A的遺傳變異與許多遺傳性心臟通道疾病有關(guān)，包括Brugada綜合征(BrS)、長QT綜合征(LQT3)和心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)功能障礙[9]。在一個小鼠模型中，SCN5A基因的一個等位基因被截斷變異體所取代導(dǎo)致胚胎致死，顯示心臟Na+電流減少大于80%，胞胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞傳導(dǎo)速度顯著降低[12]，這表明SCN5A即使是細(xì)微的變化也可能導(dǎo)致心臟病的發(fā)生。

選擇性剪接在心臟代償性反應(yīng)中起主要作用,剪接因子序列的改變或突變引起基因產(chǎn)物的錯誤剪接,是導(dǎo)致多種人類疾病的根本原因[19]。有文獻表明，剪接因子RBM25的順式元件CGGGCA在SCN5A變體E28C和E28D的剪接位點附近，并通過qRT-PCR在人HF組織中證實了剪接因子RBM25和LUC7L3的上調(diào)。與正常人心臟組織相比，在心衰組織中RBM25和LUC7L3表達(dá)分別增高了1.1和0.6倍，而全長SCN5A的mRNA和蛋白的表達(dá)降低了0.6倍。為了進一步探索RBM25調(diào)控可變剪接的內(nèi)在機制，該研究小組發(fā)現(xiàn)：AngⅡ(血管緊張素2)和缺氧是HF常見的上游信號，可導(dǎo)致LUC7L3和RBM25增加，進而導(dǎo)致RBM25與SCN5A mRNA的結(jié)合增加，SCN5A mRNA發(fā)生異常剪接，SCN5A剪接變異體增加，產(chǎn)生兩個轉(zhuǎn)錄物變異體(E28C和E28D)，這兩個變異體編碼在結(jié)構(gòu)域Ⅳ成孔段之前被截斷的心臟Na+通道，從而激活了UPR，并且這種激活進一步降低了全長SCN5A的mRNA轉(zhuǎn)錄豐度，全長SCN5A mRNA和蛋白質(zhì)減少，從而導(dǎo)致Na+電流減少[10]。

總而言之，HF與Pre-mRNA剪接因子的失調(diào)有關(guān)，其中剪接因子RBM25/LUC7L3復(fù)合物介導(dǎo)異常SCN5A mRNA的調(diào)控，進而導(dǎo)致變異的鈉通道不能發(fā)揮正常的生理作用，從而導(dǎo)致電流減少引起心律失常，最終引發(fā)HF。

3.2 RBM25與心肌病心肌病是異質(zhì)性的心肌病變，表現(xiàn)為心肌結(jié)構(gòu)和功能的異常，心肌病最終會導(dǎo)致HF甚至死亡。導(dǎo)致持續(xù)性室性快速心律失常的肥厚型心肌病(HCM)是年輕患者猝死的最常見原因[16]。有研究者測試了肥厚型心肌病(HCM)中SCN5A的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：① HCM中的剪接因子RBM25和Luc7A被上調(diào)；② HCM中心臟Na+通道SCN5A pre-mRNA存在異常剪接，變異體E28C和E28D的表達(dá)水平顯著增加；③ HCM中的UPR(未折疊蛋白反應(yīng))成分PERK(蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶)被上調(diào)。這表明了人類HCM鈉通道全長mRNA的減少部分是由于異常的SCN5A mRNA剪接和UPR的激活所致，而SCN5A的減少可能會導(dǎo)致HCM患者的心律失常風(fēng)險[20]。與此同時，剪接調(diào)節(jié)因子RMB25的上調(diào)與下調(diào)又是引起SCN5A mRNA異常剪接的必要條件。

4 RBM25在腫瘤中的研究進展

4.1 RBM25與結(jié)腸直癌結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是威脅人們生命健康的主要癌癥之一，造成了嚴(yán)重的社會負(fù)擔(dān)。預(yù)計到2030年，全球CRC的負(fù)擔(dān)將增加60%，達(dá)到220萬新發(fā)病例和110萬死亡病例[21]。左側(cè)和右側(cè)結(jié)腸癌(LC、RC)的分子特征和預(yù)后差異很大，因此需要使用不同的策略進行治療。有研究小組分析了DESF(差異表達(dá)的剪接因子)與DEAS(差異表達(dá)的可變剪接)之間的相關(guān)性，并對顯著相關(guān)的區(qū)域構(gòu)建了一個相關(guān)網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RBM25是相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中的樞紐SF(剪接因子)，并且與218個DEAS中的121個顯著相關(guān)，這表明了RBM25是LC和RC中不同可變剪接事件的關(guān)鍵決定因素。接著，該研究小組又分析了RBM25在結(jié)腸癌中的臨床意義，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中RBM25的表達(dá)明顯高于鄰近組織。但是，生存分析表明，RBM25高表達(dá)和低表達(dá)的患者的總生存率無明顯差異[22]。

隨后有研究小組通過蛋白質(zhì)組分析揭示了RBM25是結(jié)直腸癌的腫瘤生物標(biāo)志物[23]。

4.2 RBM25與前列腺癌PCa是全世界男性中最常見的癌癥之一。PCa轉(zhuǎn)移與EMT過程密切相關(guān)，這一過程可使上皮細(xì)胞喪失粘附相鄰細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白并獲得間質(zhì)表型的能力[24]。p53、cirRNA和miRNA是激活癌癥轉(zhuǎn)移中EMT程序的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。有研究顯示，人類PCa中Amotl1衍生的circAMOTL1L被下調(diào)，而降低的circAMOTL1L通過下調(diào)E-鈣黏著蛋白和增加波形蛋白表達(dá)促進PCa細(xì)胞遷移和侵襲，從而導(dǎo)致EMT和PCa進程。在這個進程中RBM25負(fù)責(zé)直接與circAMOTL1L結(jié)合并誘導(dǎo)其生物發(fā)生，而p53則通過RBM25介導(dǎo)circAMOTL1L來調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)[14]。

4.3 RBM25與急性髓細(xì)胞性白血病急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloic leukemia，AML)是一種侵襲性血液病，AML構(gòu)成了一種發(fā)展停滯狀態(tài)，其中類似于正常髓系祖細(xì)胞的白血病母細(xì)胞無法分化，因此在骨髓和周圍器官中積累。最近的癌癥基因組測序研究揭示了包括AML在內(nèi)的許多癌癥的遺傳學(xué)，發(fā)現(xiàn)除了編碼表觀遺傳調(diào)控因子、轉(zhuǎn)錄因子和生長調(diào)控因子的基因外，剪接因子基因經(jīng)常在人AML中發(fā)生突變[25]。

最近有研究小組為尋找AML中潛在的剪接調(diào)節(jié)劑中的新型腫瘤抑制因子和致癌基因做了一系列相關(guān)實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RBM25作為潛在的腫瘤抑制因子，它的損失不僅導(dǎo)致大量白血病細(xì)胞而且使具有白血病干細(xì)胞器特性的細(xì)胞的凋亡減少以及增殖增加，最終促進了白血病的發(fā)生。從分子上講，RBM25控制許多關(guān)鍵的Pre-mRNA的剪接，包括編碼凋亡調(diào)節(jié)因子BCL-X和癌基因MYC抑制劑BIN1。RBM25通過抑制BIN1(+12)亞型的表達(dá)來限制癌基因MYC活性，從而控制癌基因MYC轉(zhuǎn)錄活性,最終起到抑癌的作用[26]。

5 討論與展望

綜上所述，RBM25作為一個新型全方位性剪切因子，對mRNA剪接體的可變剪接和組裝的調(diào)控過程起著重要作用。RBM25參與細(xì)胞凋亡、離子通道電流、細(xì)胞因子活性改變過程中關(guān)鍵基因的剪接，與心血管疾病與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。RBM25在心力衰竭、心肌病和不同種類癌癥中表達(dá)升高，提示RBM25可能是臨床診斷中潛在的生物標(biāo)志物。

在HF中，充血性HF為最終的結(jié)局，其特征為心肌細(xì)胞凋亡、炎癥和瘢痕形成，最終導(dǎo)致心肌收縮力喪失，而心肌細(xì)胞凋亡在其中起著關(guān)鍵的作用。這表明，心肌細(xì)胞凋亡可能是HF發(fā)生的直接原因。已有文獻表明：在心衰組織中發(fā)現(xiàn)RBM25高表達(dá)；同時也有文獻表明：RBM25通過調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞中的BCL-X亞型的比例來促進細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，并未有研究闡明RBM25在HF發(fā)生與發(fā)展過程是否對心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響。所以探尋RBM25介導(dǎo)的Pre-mRNA可變剪接在心力衰竭中引起心肌細(xì)胞凋亡的分子機制,將為臨床治療HF患者提供有效治療的靶點。

RBM25在不同種類癌癥中表達(dá)升高，在體外和體內(nèi)繼續(xù)研究 RBM25在致癌或抑癌中的更多調(diào)控機制十分重要。RBM25作為一種生物信號，不斷深入研究其參與的信號通路與轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有利于提高醫(yī)療水平的精準(zhǔn)化。