人參皂苷Rb1通過調控Nrf2/ARE信號通路抗氧糖剝奪/復氧后神經細胞焦亡的研究

王睿智，陳志文，邵 樂，史孟嬌，龔子崴，佘 顏，鄧常清

(湖南中醫藥大學1.醫學院血管生物學實驗室，湖南 長沙 410208；2.第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

炎癥反應貫穿于腦缺血/再灌注神經損傷的全過程，是腦缺血/再灌注治療的主要干預環節[1]。細胞焦亡是近年來發現的一種依賴于炎癥反應的細胞程序性死亡方式，包括經典焦亡途徑和非經典焦亡途徑。經典細胞焦亡途徑依賴于半胱天冬蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteases-1，Caspase-1)的活化，主要存在于非感染性炎癥類疾病中，如腦缺血/再灌注[2-3]。氧化應激損傷是激活經典細胞焦亡的主要途徑，同時也是腦缺血/再灌注損傷的重要機制[4]。因此，通過調控氧化應激途徑抑制神經細胞焦亡，可能是防治腦缺血/再灌注后炎性損傷的重要途徑。

人參皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，GRb1)是五加科植物人參、三七中的主要活性成分。研究表明，人參皂苷Rb1具有多種藥理作用，包括抑制興奮性毒性、氧化應激和神經炎癥、維持神經遞質平衡、抗凋亡和線粒體穩定等作用[5]。由于人參皂苷Rb1抗腦缺血/再灌注損傷的作用機制(如抗氧化應激、抗炎癥反應)與細胞焦亡相關調控因素密切相關[6]，因而推測人參皂苷Rb1也可通過調控氧化應激和炎癥反應，從而抑制腦缺血/再灌注后神經細胞焦亡，發揮腦保護作用。

本研究選用形態、生理生化功能均與正常神經細胞較為相似的人神經母細胞瘤細胞(human neuroblastoma cells，SH-SY5Y cells)進行研究，建立氧糖剝奪/復氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型模擬體內腦缺血/再灌注損傷，從核因子E2相關轉錄因子2/抗氧化反應原件(nuclear factor-E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE)介導的抗氧化信號通路探究人參皂苷Rb1抗SH-SY5Y細胞損傷的作用機制，進一步明確人參皂苷Rb1抗OGD/R后SH-SY5Y細胞焦亡與調控Nrf2/ARE抗氧化信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 SH-SY5Y細胞(編號SCSP-5014)購自上海中科院細胞庫。

1.1.2主要試劑 人參皂苷Rb1標準品(純度≥98%，批號18082204)購自成都普菲德公司；GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒(批號GIEL0185890)購自上海吉凱基因公司；乳酸脫氫酶檢測試劑盒(批號C0017)、Hoechst/PI雙染試劑盒(批號C1056)購自上海碧云天公司；兔抗人caspase-1多克隆抗體(批號22915-1-AP)、兔抗人Nrf2多克隆抗體(批號16396-1-AP)、兔抗人血紅素氧合酶-1(HemeOxy-genase-1，HO-1)多克隆抗體(批號10701-1-AP)購自美國Proteintech公司；兔抗人磷酸化Nrf2單克隆抗體(批號Ab76026)購自英國Abcam公司。FITC標記的山羊抗兔IgG(批號SAO0003-2)、TRITC標記的山羊抗兔IgG (批號SA00007-2)購自美國Proteintech公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體(批號TA-09)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(批號ZB-2301)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG (批號ZB-2305)購自北京中杉金橋公司。

1.1.3主要儀器 三氣培養箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；多功能酶標儀購自美國Perkinelmer公司；熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；ChemiDoc XRS高靈敏度化學發光成像系統購自美國Bio-Rad Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1野生型SH-SY5Y細胞的培養及處理 將野生型SH-SY5Y細胞常規培養于細胞培養箱中(5% CO2，21% O2，74% N2)。取第2-5代細胞進行實驗。細胞生長融合后，將細胞分為空白對照(Control)組、OGD/R組、不同濃度人參皂苷Rb1(0.01、0.1、1、10、20 mg·L-1)組。在建立OGD/R模型前12 h，Control和OGD/R組加入含10% FBS的DMEM完全培養基，各藥物組加入以DMEM完全培養基配制的不同濃度藥物，培養12 h。

1.2.2si-Nrf2-SH-SY5Y細胞系構建及處理 將野生型SH-SY5Y細胞常規培養于細胞培養箱中(5% CO2，21% O2，74% N2)。取第2-5代細胞進行實驗。細胞生長融合后，將3種GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒(si-Nrf2 RNA 53-1、si-Nrf2 RNA 54-1、si-Nrf2 RNA 55-1)和空載慢病毒(si-con RNA)按照MOI(Multiplicity of infection)=20的轉染滴度分別轉染入野生型SH-SY5Y細胞中。3 d后加入含5 mg·L-1嘌呤霉素的DMEM完全培養基進行多克隆穩轉細胞株的篩選，通過在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光(si-RNA)的表達比率來判斷轉染效率(轉染效率=綠色熒光細胞數/白光細胞數)。直至上述各種RNA干擾慢病毒轉染SH-SY5Y細胞效率達80%后換用含2.5 mg·L-1嘌呤霉素的DMEM完全培養基篩選。篩選培養7 d后，以Western blot方法檢測GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒和空載慢病毒轉染后SH-SY5Y細胞Nrf2蛋白的表達，以此評價GV493-NFE2L2基因RNA干擾慢病毒沉默Nrf2效果，建立穩定的si-con-SH-SY5Y細胞和si-Nrf2-SH-SY5Y細胞。

si-Nrf2-SH-SY5Y細胞系構建后，將細胞分為si-con-SH-SY5Y細胞(空載慢病毒)對照組、si-con-SH-SY5Y細胞模型組、si-con-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組、si-Nrf2-SH-SY5Y細胞(沉默Nrf2慢病毒)模型組、si-Nrf2-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組。在建立OGD/R模型前12 h，si-con-SH-SY5Y細胞對照組、si-con-SH-SY5Y細胞模型組和si-Nrf2-SH-SY5Y細胞模型組加入含10% FBS的DMEM完全培養基，各藥物組加入以DMEM完全培養基配制的1 mg·L-1人參皂苷Rb1，培養12 h。

1.2.3OGD/R模型建立 將模型組和藥物組細胞置于三氣培養箱中(5% CO2，1% O2，94% N2)缺糖缺氧培養4 h，然后換成DMEM完全培養基常規培養進行復糖復氧，3 h后終止培養并進行檢測。

1.2.4CCK-8法檢測細胞存活率 將SH-SY5Y細胞接種于96孔細胞培養板中。細胞處理完畢后每孔加入CCK-8檢測液(每100 μL DMEM完全培養基中加入10 μL CCK-8原液)，反應2 h后檢測450 nm的吸光度(A)值，并計算細胞存活率：細胞存活率/%=(實驗孔A值-背景孔A值)/(正常對照孔A值-背景孔A值)×100%。

1.2.5測定LDH漏出率 將SH-SY5Y細胞接種于96孔細胞培養板中。細胞處理完畢后，每孔收集100 μL培養基，1 000 r·min-1離心10 min，取上清作為細胞培養上清液。再向培養板中加入與原培養基等體積的新培養基后置于-80 ℃冷凍約30 min，隨后37 ℃溫育15 min，將細胞凍融液1 000 r·min-1離心10 min，取上清，即為細胞凍融液。分別取SH-SY5Y細胞培養上清液和細胞凍融液100 μL，加入60 μL LDH檢測工作液，混勻，室溫(24-26)℃，避光孵育，計算培養上清液和細胞凍融液中的LDH活性，再計算細胞LDH漏出率：LDH漏出率=[培養上清液LDH活性/(培養上清液LDH活性+細胞凍融液LDH活性)]。

1.2.6Hoechst/PI染色法檢測細胞膜損傷 將SH-SY5Y細胞接種于24孔細胞培養板中。細胞處理完畢后，在SH-SY5Y細胞加入染色液(1 mL細胞染色緩沖液中加入5 μL Hoechst染色液和5 μL PI染色液)，4 ℃孵育30 min，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(PI)和藍色熒光(Hoechst)表達強度及定位。

1.2.7免疫熒光法檢測焦亡蛋白caspase-1的表達 將SH-SY5Y細胞接種于24孔細胞培養板中。細胞處理完畢后，將SH-SY5Y細胞置于4%多聚甲醛中固定爬片15 min，PBST清洗，再用PBST稀釋的1 %牛血清白蛋白封閉液封閉1 h。加入PBST稀釋的caspase-1一抗(1 ∶50稀釋)，4 ℃孵育過夜。每孔加入PBS稀釋的TRITC標記的熒光二抗(1 ∶50稀釋)，室溫避光孵育1 h，DAPI染液染核，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(caspase-1)和綠色熒光(si-RNA)的表達強度及定位。

1.2.8免疫熒光法檢測Nrf2蛋白活化 將SH-SY5Y細胞接種于24孔細胞培養板中。細胞處理完畢后，將SH-SY5Y細胞置于4%多聚甲醛中固定爬片15 min，PBST清洗，再用PBST稀釋的1 %牛血清白蛋白封閉液封閉1 h,加入PBST稀釋的磷酸化Nrf2一抗(1 ∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。每孔加入PBS稀釋的TRITC標記熒光二抗(1 ∶50稀釋)，室溫避光孵育1 h，DAPI染液染核，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光(activated Nrf2)和綠色熒光(si-RNA)的表達強度及定位，檢測Nrf2蛋白活化水平。

1.2.9Western blot檢測Nrf2、HO-1、caspase-1蛋白表達 將SH-SY5Y細胞接種于75 cm2培養皿中。細胞處理完畢后，將SH-SY5Y細胞加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1離心10 min后收集細胞，加入150 μL蛋白裂解液提取細胞總蛋白。BCA 法測定各樣本蛋白濃度，并將各樣本蛋白濃度調整為3 g·L-1。蛋白樣品煮沸變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h。加入PBS稀釋的Nrf2、HO-1、caspase-1一抗(1 ∶1 000稀釋)及β-actin一抗(1 ∶1 500稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST清洗，加入TBST稀釋的二抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST清洗，加入ECL顯影液顯影，凝膠成像儀照相，Image圖像分析軟件測定各目的條帶的積分光密度(IOD)，分別以Nrf2、HO-1、caspase-1的IOD與β-actin的IOD的比值對目的蛋白的表達進行相對定量。

2 結果

2.1 不同濃度人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細胞存活率的影響野生型SH-SY5Y細胞OGD/R后，細胞存活率下降(P<0.01)。與模型組比較，各濃度人參皂苷Rb1組均可使細胞存活率提升(P<0.01)。人參皂苷Rb1(0.01、0.1、1 mg·L-1)組之間呈現量效關系，以人參皂苷Rb1(1 mg·L-1)組作用最強(P<0.05，P<0.01),見Fig1。

Fig 1 Comparison of cell survival rate in each group (n=8)**P<0.01 vs Control group;##P<0.01 vs OGD/R group;△P<0.05,△△P<0.01 vs GRb1(1 mg·L-1)group.

2.2 si-Nrf2 RNA-SH-SY5Y細胞系的構建選取3種GV493-NFE2L2慢病毒(si-Nrf2 RNA 53-1、si-Nrf2RNA 54-1、si-Nrf2RNA 55-1)干擾SH-SY5Y細胞，評價GV493-NFE2L2慢病毒下調Nrf2的效果。與si-RNA比較，si-Nrf2 RNA 53-1、54-1、55-1均可使SH-SY5Y細胞Nrf2蛋白表達水平下降(P<0.01)，且以si-Nrf2 RNA 55-1的作用最強，本研究采用si-Nrf2 RNA 55-1干擾細胞構建Nrf2低表達SH-SY5Y細胞(si-Nrf2-SH-SY5Y)進行實驗,見Fig2。

2.3 人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細胞存活率的影響si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R后，細胞存活率降低(P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細胞OGD/R后細胞存活率下降(P<0.05)。

與si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R組比較，si-con-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組存活率增加(P<0.05)。與si-con-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y人參皂苷Rb1組細胞存活率降低(P<0.01),見Fig3。

Fig 2 Comparison of Nrf2 protein expression in each group (n=3)**P<0.01 vs si-con group.

Fig 3 Comparison of cell survival rate in each group (n=8)**P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y control group;#P<0.05 vs si-con-SH-SY5Y OGD/R group;△△P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y GRb1 group.

2.4 人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細胞焦亡的影響si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R后，LDH漏出率(Fig4A)、Hoechst/PI熒光強度(Fig4B)和焦亡蛋白caspase-1表達(Fig4C、4D)增加(P<0.05,P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細胞OGD/R后LDH漏出率、Hoechst/PI熒光強度和焦亡蛋白caspase-1的表達增加(P<0.05，P<0.01)。

與si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R組比較，si-con-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組LDH漏出率、Hoechst/PI熒光強度和焦亡蛋白caspase-1的表達降低(P<0.05，P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組LDH漏出率、Hoechst/PI熒光強度和焦亡蛋白caspase-1的表達均升高(P<0.01)。

2.5 人參皂苷Rb1對OGD/R后SH-SY5Y細胞Nrf2/ARE信號通路的影響si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R后，活化Nrf2蛋白(磷酸化Nrf2蛋白)熒光表達(Fig5A)、全細胞Nrf2(Fig5B)和HO-1(Fig5C)蛋白表達增加(P<0.05，P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細胞OGD/R組活化Nrf2蛋白熒光表達和全細胞Nrf2蛋白表達水平降低(P<0.05，P<0.01)。

Fig 4 Effect of ginsenoside Rb1 on Pyroptosis of SH-SY5Y cells after OGD/R(A)Comparison of LDH release rate in each group (n=8).(B)Comparison of double-fluorescent staining with PI (red),and Hoechst (green)in each group (n=5).(C)Comparison of double-fluorescent staining with caspase-1 (red)siRNA (green)and DAPI (blue)in each group (n=5).(D)Comparison of protein levels of caspase-1 in each group (n=3).*P<0.05,**P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y control group;#P<0.05,##P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y OGD/R group;△△P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y GRb1group.

Fig 5 Effect of ginsenoside Rb1 on Nrf2 /ARE signaling pathway in SH-SY5Y cells after OGD/R(A)Comparison of double-fluorescent staining with activated Nrf2 (red),siRNA (green)and DAPI (blue)in each group (n=5).(B)Comparison of protein levels of Nrf2in each group (n=3).(C)Comparison of protein levels of HO-1 in each group(n=3).*P<0.01,**P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y control group;#P<0.05,##P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y OGD/R group;△△P<0.01 vs si-con-SH-SY5Y GRb1 group.

與si-con-SH-SY5Y細胞OGD/R組比較，si-con-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組的活化Nrf2蛋白熒光表達和全細胞Nrf2蛋白表達增加(P<0.05，P<0.01)。與si-con-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組比較，si-Nrf2-SH-SY5Y細胞人參皂苷Rb1組的活化Nrf2蛋白熒光表達、全細胞Nrf2和HO-1蛋白表達降低(P<0.01)。

3 討論

炎癥反應是腦缺血/再灌注一系列損傷級聯反應中的重要機制，阻斷炎癥反應是改善缺血/再灌注腦損傷的理想策略。細胞焦亡是一種典型依賴于炎癥的程序性細胞死亡方式，caspase-1介導的經典細胞焦亡途徑參與了腦缺血/再灌注損傷的過程[3]。細胞焦亡時，質膜破裂形成小孔，有利于能夠穿透細胞膜的細胞染料穿過焦亡細胞，嵌入細胞核DNA，使其染色陽性。PI是一種可以嵌合到雙鏈DNA和RNA的堿基對中并與之結合的熒光染料，無堿基特異性，僅能通過受損的細胞膜顯示紅光。焦亡細胞的胞膜完整性消失，細胞滲透性腫脹，胞內物質流出，如LDH和炎性細胞因子釋放。caspase-1為經典焦亡途徑的關鍵分子，其活化反映了焦亡發生。因此，Hoechst/PI染色、LDH漏出及caspase-1的活化廣泛用于檢測焦亡的發生[7]。

Nrf2/ARE抗氧化信號通路是機體重要的內源性抗氧化機制，在生理狀態下，Nrf2與胞質伴侶蛋白Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Kelch-like ECH2 associated protein-1，Keap-1)結合，且被泛素蛋白酶迅速降解，處于相對抑制狀態并被錨定在胞質中。當機體受到氧自由基和內源性毒素等攻擊時，Nrf2與Keap-l解偶聯，轉位進入細胞核，與ARE相結合，從而啟動下游抗氧化基因和一系列II相解毒酶如血紅素氧合酶-1(hemeOxy-genase-1，HO-1)、谷胱甘肽-S-轉移酶(glutathione S-transferase，GST)和醌氧化還原酶1(NADPH quinine oxidoreductase，NQO1)等的表達。研究表明Nrf2是Nrf2/ARE抗氧化信號通路的關鍵因子，對細胞焦亡發揮著重要的負調控作用[8-9]。

本研究結果表明在氧糖剝奪/復氧后細胞存活率下降，LDH漏出率、Hoechst/PI熒光表達、焦亡蛋白caspase-1的表達均增高，這提示細胞焦亡參與了氧糖剝奪/復氧后細胞的損傷。進一步應用siRNA 干擾技術成功構建siRNA Nrf2的SH-SY5Y細胞模型。研究結果發現氧糖剝奪/復氧后，Nrf2/ARE抗氧化信號通路關鍵分子Nrf2和HO-1的表達明顯增加，表明氧糖剝奪/復氧的刺激激活了細胞內Nrf2/ARE信號通路。當Nrf2基因沉默后，細胞焦亡以及細胞損傷顯著加重，表明沉黙Nrf2基因后增強細胞焦亡，促進細胞損傷。這提示Nrf2作為Nrf2/ARE抗氧化信號通路的關鍵因子，可通過負調控氧糖剝奪/復氧后細胞焦亡，從而抑制細胞的損傷。

人參皂苷Rb1是人參二醇系皂苷，屬于達瑪烷型三萜皂苷類化合物，其主要分布在五加科人參屬植物中，如三七、人參等。目前研究發現人參皂苷Rb1在中樞神經系統疾病中有著較強的藥理活性，能夠通過多環節、多途徑、多靶點的作用方式抗腦缺血/再灌注損傷。其中，抗炎癥反應與抗氧化應激是人參皂苷Rb1發揮對腦缺血/再灌注損傷后神經功能保護作用的重要機制[10-12]。本研究結果發現人參皂苷Rb1能夠提高氧糖剝奪/復氧后細胞存活率，降低細胞LDH漏出率、Hoechst/PI熒光表達、焦亡蛋白caspase-1的表達，表明人參皂苷Rb1具有抗細胞焦亡的效應。人參皂苷Rb1能上調全細胞Nrf2蛋白和活化Nrf2蛋白表達，維持HO-1的高表達水平，表明人參皂苷Rb1可激活細胞Nrf2/ARE信號通路。當Nrf2基因沉默后，人參皂苷Rb1對Nrf2/HO-1信號通路的激活作用減弱，且人參皂苷Rb1抗細胞損傷和細胞焦亡的效應減弱。這一結果提示人參皂苷Rb1可能是通過調控Nrf2/ARE抗氧化信號通路，而發揮抗細胞焦亡的作用。

綜上所述，本研究結果表明細胞焦亡參與了氧糖剝奪/復氧后細胞損傷，人參皂苷Rb1可通過抑制OGD/R后細胞焦亡，從而發揮對細胞保護作用。其作用機制與調控Nrf2/ARE抗氧化信號通路密切相關。