神經調節蛋白1，3和4促膠質瘤細胞遷移比較研究

喬新宇，易三軍，趙煒疆

(1.江南大學無錫醫學院,江蘇 無錫 214122;2.汕頭大學醫學院神經科學中心,廣東 汕頭 515041)

膠質瘤是中樞神經系統發病率最高的神經系統原發惡性腫瘤[1]。雖然目前已有手術切除、放化療及神經導航等治療手段，但因膠質瘤細胞增殖迅速、多呈浸潤性生長、腫瘤組織有較高的侵襲能力，且與正常組織界限不清，膠質瘤的治療效果仍不理想[2]。闡明神經膠質瘤發病和調控機制，尋找潛在的可延緩膠質瘤浸潤、轉移的藥物已刻不容緩。

細胞因子在腫瘤轉移浸潤中的調節作用研究比較廣泛。神經調節蛋白(neuregulin，NRG)是一類調節細胞生長和分化的多肽類神經生長因子，屬于類表皮生長因子(epidermal growth factor-like，EGF-like)超家族。神經調節蛋白主要有1-4四種亞型，即NRG1、NRG2、NRG3和NRG4，因通過不同實驗分離、純化和克隆，故有不同命名。NRG受體為ErbB酪氨酸激酶型受體，主要包括ErbB4 /ErbB4同二聚體、ErbB3 /ErbB2和ErbB4 /ErbB2異二聚體。NRG可直接與ErbB3或ErbB4結合，誘導ErbB3或ErbB4與ErbB2形成異二聚體，活化受體酪氨酸激酶，進而激活多種下游信號轉導途徑，調控組織細胞的增殖和分化[3]。NRG1表達與神經系統功能密切相關，且在神經系統腫瘤如膠質瘤細胞存活、遷移中發揮作用[4]，故我們推測NRG其他亞型NRG3、NRG4也可能在膠質瘤細胞遷移中發揮作用，但迄今為止有關NRG3和NRG4的在膠質瘤病理生理中的作用研究較少。本研究比較分析NRG1、NRG3和NRG4對膠質瘤細胞遷移的影響，并通過GEPIA數據庫分析來明確可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞和試劑 U251和U-87MG細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；SHG44細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；RPMI 1640細胞基礎培養基購自美國Gibco公司；0.25% 胰蛋白酶-EDTA購自北京索萊寶公司；青霉素-鏈霉素混合液購自北京索萊寶公司；人源重組神經調節蛋白1β(recombinant human neuregulin 1β，rNRG1β)購自美國Thermo Scientific公司；人源重組神經調節蛋白3β(recombinant human neuregulin 3β，rNRG3β)和人源重組神經調節蛋白4β(recombinant human neuregulin 4β，rNRG4β)均購自北京義翹神州公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京中杉金橋公司；乙醇購自汕頭西隴化工股份有限公司。

1.1.2儀器 高壓滅菌鍋(SX-500，日本Tomy公司)；細胞培養箱(HERA cell 240，德國Thermo-Scientific公司)；超凈工作臺(KSP Class II，德國Thermo-Scientific公司)；臺式高速離心機(Allergra X-22R，美國Beckman Coulter公司)；電子天平(BSA223S-CW，北京賽多利斯公司)；PH儀雷磁(PHS-3E，上海精科公司)；倒置相差顯微鏡(BX51，日本奧林巴斯公司)；臺式冷凍離心機(5415R，德國Eppendorf公司)；電子恒溫水浴鍋(HH-11-12，汕頭市醫用設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 SHG44和U251細胞培養于胎牛血清 ∶培養基=10 ∶100 DMEM培養基中；U-87MG細胞培養于胎牛血清 ∶培養基=10 ∶100 RPMI 1640培養基中培養，培養溫度37 ℃。

1.2.2細胞劃痕實驗 培養人U-87MG、U251和SHG44細胞至其密度接近90%后，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化液消化處理，待顯微鏡下細胞明顯皺縮時加入含血清培養液終止消化并吹打細胞使之形成均勻懸液，以900 r·min-1離心3 min。棄去上層液體后加新鮮無血清培養基重懸制備成細胞懸浮液，并用血球計數板計數。細胞懸浮液以無血清培養基稀釋。于96孔板中每孔加液100 μL，過夜培養。用無RNA 酶槍頭尖沿直尺在培養板細胞中央進行細胞劃痕。使用無血清培養基清洗后，分別加入含有0、2、5和10 nmol·L-1重組NRG蛋白(rNRG1β、-3β和-4β)的無血清培養基100 μL，每個處理組設置3次重復孔。處理完成后在倒置顯微鏡下進行拍照觀察保存，此時記為0 h。根據不同細胞系的生長速度不同，在0-48 h選擇相應時間點進行觀察。U-87MG細胞的觀察時間點為0、6、12和24 h；U251細胞的觀察時間點為0、12、24和48 h；SHG44細胞的觀察時間點為0、24和48 h。

1.2.3愈合率計算 愈合率/%=(初始劃痕面積-最終劃痕面積)/初始劃痕面積 × 100%。

1.2.4GEPIA數據庫分析 使用GEPIA數據庫分析低級別膠質瘤(low-grade glioma，LGG)和膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)樣本中NRG1、NRG3和NRG4及其受體ErbB2、ErbB3、ErbB4表達水平，結果繪制箱型圖。

1.2.5統計學分析 使用ImageJ軟件分析劃痕愈合率，使用GraphPad prism 9.0軟件處理與統計實驗數據，并進行繪圖。多組數據間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組比較用Tukey檢驗。

2 結果

2.1 rNRG1β對不同膠質瘤細胞遷移的影響rNRG1β對U-87MG、U251細胞和SHG44細胞的遷移率的影響在各時間點均呈現劑量依賴性(Fig1)。

Fig 1 Effect of rNRG1β on migration of different glioma cells Optical microscope image of wound closure after cell scratch in response to rNRG1β treatment in U-87 MG (A),U251 (B),and SHG44 (C)cells (magnification ×100).*P<0.05,**P<0.01 vs control group

U-87MG劃傷后給予rNRG1β處理6 h，與溶劑對照組相比，僅有10 nmol·L-1組的劃痕間距明顯減小(P<0.01)，劃痕愈合速度約為20%；處理12 h時間點，與溶劑對照組相比，各組遷移率均明顯增加，呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(P<0.01)。24 h時間點，各組均可見細胞劃痕消失，愈合完成，表明膠質母細胞瘤來源的U-87MG細胞有較強遷移能力。

U251劃傷后給予rNRG1β處理12 h，與溶劑對照組相比，實驗組的劃痕間距均顯著性減小(各劑量組P<0.01)，遷移速度呈劑量依賴性；處理24 h時間點，與溶劑對照組相比，各組遷移率均顯著增加，呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著，且2 nmol·L-1組和5 nmol·L-1組的遷移率相近(各劑量組P<0.01)。處理48 h時間點，趨勢與處理24 h的趨勢相似，10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(各劑量組P<0.01)。

SHG44劃傷后給予rNRG1β處理24 h，與溶劑對照組相比，5 nmol·L-1和10 nmol·L-1組的劃痕間距均顯著性減小(P<0.05)，可見遷移速度呈劑量依賴性；處理48 h時間點，與溶劑對照組相比，各組遷移率呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率最高(各劑量組P<0.01)。

2.2 rNRG3β對不同膠質瘤細胞遷移的影響rNRG3β對U-87MG細胞遷移率未見影響(Fig2A)，對SHG44細胞、U251細胞遷移率的影響在各時間點均呈現劑量依賴性(Fig2B，C)。

U-87MG劃傷后給予rNRG3β處理6 h和12 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異；處理24 h時間點，各組均可見細胞劃痕消失，愈合完成，表明膠質母細胞瘤來源的U-87MG細胞遷移能力較強。

U-251劃傷后給予rNRG3β處理12 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異。處理24 h和48時間點，與溶劑對照組相比，各組遷移率均顯著增加(各劑量組P<0.01)，呈劑量依賴性，以5 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著，10 nmol·L-1組遷移率較5 nmol·L-1組減小(各時間點P<0.01)。

SHG44劃傷后給予rNRG3β處理24 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異；處理48 h時間點，與溶劑對照組相比，各組遷移率呈劑量依賴性，以10 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(P<0.01)。

2.3 rNRG4β對不同膠質瘤細胞遷移的影響rNRG4β對U-87MG、U251細胞和SHG44細胞的遷移率的影響在各時間點均呈現劑量依賴性(Fig3)。

Fig 2 Effect of rNRG3β on migration of different glioma cellsOptical microscope image of wound closure after cell scratch in response to rNRG3β treatment in U-87 MG (A),U251 (B),and SHG44 (C)cells (magnification ×100).*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 3 Effect of rNRG4β on migration of different glioma cells Optical microscope image of wound closure after cell scratch in response to rNRG4β treatment in U-87 MG (A),U251 (B),and SHG44 (C)cells (magnification × 100).*P<0.05,**P<0.01 vs control group

U-87MG劃傷后給予rNRG4β處理6 h，未見實驗組與對照組間呈顯著性差異；處理12 h時間點，5 nmol·L-1組具有顯著的促進遷移率增加作用，而10 nmol·L-1則起抑制作用(與對照組相比，兩組均為P<0.01)。處理24 h時間點，各組均可見細胞劃痕消失，愈合完成，表明膠質母細胞瘤來源的U-87MG細胞遷移能力較強。

U-251劃傷后給予rNRG4β處理12 h，僅見10 nmol·L-1組與對照組間呈顯著性差異(P<0.01)。處理24 h時間點，僅見5 nmol·L-1組和10 nmol·L-1組與對照組間呈差異顯著性(兩組P<0.01)，處理48 h時間點，與溶劑對照組相比，各組遷移率均明顯增加，呈劑量依賴性，以5 nmol·L-1組遷移率增加最為顯著(P<0.01)，10 nmol·L-1組遷移率較5 nmol·L-1組減小。

SHG44劃傷后給予rNRG4β處理24 h，未見實驗組與對照組間呈差異顯著性；處理48 h時間點，與溶劑對照組相比，各組遷移率呈劑量依賴性，5 nmol·L-1組和10 nmol·L-1組遷移率增加明顯(兩組P<0.01)。

2.4 低級別膠質瘤(low-grade glioma，LGG)和膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)樣本的NRG1、NRG3和NRG4及其受體ErbB2、ErbB3、ErbB4表達情況GEPIA數據庫分析表明，在LGG樣本中，NRG1、NRG3和NRG4表達水平均低于正常對照組，僅NRG1和NRG4表達差異較為明顯(P<0.05)；ErbB2、ErbB3、ErbB4表達水平均高于正常對照組。在GBM樣本中，NRG1、NRG4以及受體ErbB3、ErbB4表達水平均低于正常對照組，NRG1、NRG3和NRG4表達差異較為明顯(P<0.05)，但ErbB2表達水平高于正常對照組,差異有明顯性(P<0.05)(Fig4)。

3 討論

膠質瘤，尤其是膠質母細胞瘤細胞多具有較強侵襲性和遷移性，是手術難以徹底根除的主要原因[5]。以往研究表明，NRG1可增強膠質瘤細胞的運動性和遷移性[6]。本實驗進一步證實rNRG1β可增強不同惡性程度膠質瘤細胞的遷移率，且其促進作用在濃度0至10 nmol·L-1之間呈劑量依賴性。我們在此基礎上進一步檢測了NRG家族其他兩個重要亞型NRG3和NRG4對膠質瘤細胞遷移的影響。結果表明rNRG3β和rNRG4β對U-87MG細胞遷移無明顯影響，僅在高劑量時對U251細胞和SHG44細胞的遷移有一定促進作用。以上結果結合GEPIA數據分析結果，提示不同惡性程度的膠質瘤細胞在NRG亞型及其受體的表達水平和分布上存在一定程度差異。

NRG1所結合的受體類型具有多樣性，已有文獻報道U-87MG可表達少量的ErbB2受體，U251細胞可表達ErbB2和ErbB3受體[7]。游離型NRG1首先與ErbB3和ErbB4受體結合，從而進一步激活其與ErbB2受體形成的異二聚體ErbB3/ErbB2、ErbB4/ErbB2，或同二聚體ErbB4/ErbB4[8]。與NRG1相比，NRG3僅結合并激活ErbB4受體[9]，NRG4僅對ErbB4受體有低親和力，不與ErbB2和ErbB3受體結合[10]。由GEPIA結果可知，LGG和GBM中ErbB2表達均高于正常對照組，故rNRG1β的促遷移效果相對明顯。ErbB2水平增高可增加膠質瘤細胞對NRG1敏感性，尤其是癌旁神經組織表達有更高水平NRG1，可進一步促進膠質瘤細胞向正常組織遷移[11]。LGG中ErbB4表達水平有升高趨勢，GBM中表達則呈下降趨勢，可部分解釋rNRG3β和rNRG4β對U251細胞和SHG44細胞遷移有促進作用，而對U-87 MG細胞遷移影響不明顯。因此，可進一步探究三種不同惡性程度的膠質瘤細胞NRG各亞型和受體以及NRG/ErbB信號通路下游信號分子的表達差異，從而進一步明確其對不同惡性程度膠質瘤細胞遷移的差異化影響。

GEPIA數據庫分析表明，正常腦組織中NRG1,NRG3和NRG4表達水平均高于膠質瘤組織，提示癌旁腦組織神經元可釋放多種NRG亞型，以彌散或血流運輸方式進入腫瘤實質，促進膠質瘤細胞存活和遷移，進而侵襲周圍健康腦組織[12]。已報道NRG可與ErbB4 /ErbB4、ErbB2/ErbB3和ErbB2/ErbB4受體結合，激活MAPK以及PI3K/Akt途徑，參與細胞增殖和遷移調控[13]。ErbB受體抑制劑可以拮抗該作用，抑制腫瘤細胞遷移。已有臨床研究證實，ErbB3單克隆抗體GSK2849330可通過抑制ErbB3/ErbB2信號通路治療肺部浸潤性黏液腺癌，具有一定的實用價值[14]。新近研究發現，ErbB2受體拮抗劑阿法替尼可通過抑制NRG3/ErbB4信號通路，抑制犬膠質瘤細胞增殖[15]。因此，NRG作為細胞外基質的成分影響腫瘤細胞的遷移[16]，其受體ErbB2、ErbB3和ErbB4有望成為膠質瘤治療靶點(Fig5)。

Fig 4 GEPIA-based analysis of gene expression level of NRG1,NRG3,and NRG4,and ErbB2,ErbB3 and ErbB4 in low-grade glioma (LGG)and glioblastoma multiforme (GBM)tissue samples in comparison to those in normal control*P<0.05 vs control group

Fig 5 Neuron-derived NRGs on glioma cell migration and mechanisms underlying therapeutic effects of ErbB receptor antagonists

此外，我們以往研究表明NRG1可誘導多種膠質瘤細胞中細胞黏附分子CHL1蛋白表達水平增加[17]，而CHL1在體外和體內均能促進人類神經膠質瘤細胞的增殖、轉移和遷移[18]，而NRG3、4是否具有相似作用尚需進一步探究。