跨膜蛋白173對TGF-β1活化的肝星狀細胞增殖與凋亡的影響及機制研究

潘林鑫，李 玉，徐 濤，錢 成

(安徽醫科大學 1.生命科學學院，2.藥學院，3.科研實驗中心，4.炎癥免疫性疾病安徽省實驗室，安徽 合肥 230032)

肝炎是一種常見的消化系統疾病，其種類繁多、病因復雜、發病率高，且隨著病情的發展，肝臟細胞遭到持續地破壞，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分過度異常地沉積，導致肝臟結構發生病理性改變，損害肝臟代謝功能，進一步發展成為肝纖維化，甚至肝癌，嚴重威脅著人類的生命健康[1-2]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是ECM的主要來源，其持續增殖與活化是肝臟炎性損傷和纖維化的關鍵環節[3-4]，在肝細胞癌的發病機制中也扮演著重要角色[5]。TMEM173是一種存在于宿主細胞內質網膜上的跨膜蛋白，人源的TMEM173由379個氨基酸組成，其N端(1～137AA)為4次跨膜結構域，C端包含一個CTD結構域，可以結合胞質中細菌分泌的重要第二信使環二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDNs)，激活TBK1和IRF3抗病毒細胞信號通路，誘導抗感染的固有免疫反應[6-7]。有研究表明TMEM173與非酒精性脂肪肝和肝細胞癌的發生發展密切相關，且在HSC活化過程中扮演著重要角色[8-9]，本研究通過構建pEGFP-C2-TMEM173表達載體和設計合成TMEM173-siRNA來調節TMEM173在活化LX-2細胞中的表達變化，旨在研究TMEM173對HSC活化過程中細胞增殖和凋亡的調控作用，為進一步探究其在肝炎和纖維化中的功能奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株和細胞pEGFP-C2載體、DH5α感受態菌株、LX-2細胞株由校實驗中心實驗室保存。

1.2 主要試劑引物合成自安徽通用生物有限公司；T4 DNA連接酶(B110041)購于生工生物公司；DMEM培養基(SH30081.01)購于澳洲HyClone公司；胎牛血清(FB25015)購于美國CLARK公司；Lipo8000脂質體(C0533)、細胞裂解液(P0013B)、PMSF蛋白酶抑制劑(ST506)、一抗稀釋液(P0023A)、總RNA抽提試劑盒(R0028)購于上海碧云天公司；Evo M-MLV反轉錄試劑預混液(AG11706)、SYBR Green熒光定量PCR預混液(AG11701)購于中國AG生物公司；Opti-MEM轉染液(31985070)購于美國Invitrogen公司；細胞凋亡試劑盒(559763)購于美國BD公司；PVDF膜購于美國Millipore公司；各抗體購于美國Proteintech公司。

1.3 主要儀器AL600RGB凝膠成像系統購自美國GE公司；Axio Observer 3倒置熒光顯微鏡購自德國卡爾蔡司公司、MoFlo XDP超速流式細胞分選儀購自美國Beckman公司；CytoFlex流式細胞分析儀購自美國Beckman公司。

1.4 質粒構建設計并合成引物序列：上游引物：5′-CCGGAATTCCGGATGCCCCACTCCAGCCT-3′；下游引物：5′-CGGGATCCCGTCAAGAGAAATCCGTGC-3′，以含人TMEM173全長cDNA序列的質粒為模板，PCR擴增出TMEM173的CDS序列，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并利用膠回收試劑盒進行回收，得到其PCR純化產物，利用限制性內切酶EcoR I和BamH I對TMEM173的PCR純化產物和pEGFP-C2空載體分別進行雙酶切，用T4 DNA連接酶將二者的酶切產物進行連接，并將連接產物轉化于DH5α感受態細胞中，37 ℃培養至單克隆生成，分別挑取數個單克隆進行擴大培養，并抽提菌液中的質粒進行雙酶切鑒定(EcoR I和BamH I)，選擇鑒定正確的重組質粒送公司進行測序。

1.5 細胞培養復蘇LX-2細胞，并用完全培養基(10% FBS+90% DMEM高糖+青鏈霉素)在5%CO2的恒溫培養箱中進行培養，根據細胞狀態及時更換完全培養基，待細胞密度達到90%以上時即可進行傳代，并取適量細胞重新接種至新的培養瓶中，用于后續的轉染實驗。

1.6 轉染本研究采用脂質體(Lipo8000)轉染法，以十二孔板為例，步驟如下：先后將pEGFP-C2-TMEM173、TMEM173-siRNA及其對照(各1 μg)和Lipo8000(1.6 μL)加入到50 μL Opti-MEM轉染液中，輕輕充分混勻后，將溶液加入待轉染的LX-2細胞中，繼續培養24-48 h，用于后續實驗。

1.7 QPCR檢測收集實驗處理后的各組細胞，用TRIzol法提取細胞的總RNA，逆轉錄得到cDNA，設計并合成引物，引物序列見Tab 1。將cDNA模板、引物和SYBR?Green supermix核酸染料按一定比例加入反應體系中，并利用RT-PCR儀中進行擴增，并分析結果。

Tab 1 Primer sequence

1.8 Western blot轉染約24 h后，收集LX-2細胞進行裂解(4 ℃)，30 min后收集裂解液進行高速冷凍離心并收集上清液，蛋白定量后取出適量上清液，加入等量2× SDS上樣緩沖液充分混勻后沸水浴5 min，冰浴后取適量蛋白樣品先后進行 SDS-PAGE電泳(100 V，2 h)和恒流濕轉(200 mA，1 h)，取出PVDF膜室溫封閉1 h，TBST溶液洗膜后加入一抗 (1 ∶500)進行孵育(4 ℃過夜)，TBST洗膜后加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)進行孵育(室溫1 h)，TBST溶液洗膜后用ECL化學發光液進行顯色，在蛋白成像儀上進行顯影和拍攝。

1.9 免疫熒光轉染約24 h后，取出LX-2細胞爬片，用預冷的PBS清洗3次后進行細胞固定(-20 ℃預冷甲醇2 min+70%乙醇5 min)，由于GFP能夠自發綠色熒光，因此無需進行一抗和二抗孵育，固定后用PBS清洗3次后進行細胞核染色(0.15 g·L-1DAPI，2 min)，棄DAPI溶液后用PBS清洗3次后，用熒光封片膠將蓋玻片封于載玻片上，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.10 MTT細胞增殖轉染約24 h后棄去各組細胞的培養基，更換為無血清培養液，然后每孔加入20 μL的MTT (5 g·L-1)，37 ℃繼續孵育4 h后，棄上清并每孔加150 μL DMSO溶解細胞內結晶，室溫振蕩溶解10 min后于492 nm波長處測吸光度(A值)。

1.11 EdU細胞增殖轉染約24 h后加入EdU工作液至終濃度為10 μmol·L-1，37 ℃繼續孵育4 h后去除培養液，并加入4%的多聚甲醛室溫固定15 min，洗滌液洗滌細胞3次后加入含0.3% Triton X-100的PBS進行室溫透化15 min，洗滌液洗滌細胞3次后加入Click反應液室溫避光孵育30 min，然后使用Hoechst 33342進行細胞核染色，并在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.12 細胞周期轉染約24 h后，用不含EDTA的胰酶消化并收集實驗處理后的各組細胞(濃度大約為1×109·L-1)，預冷的PBS洗滌細胞2次后加入100 μL預冷的結合緩沖液重懸細胞，依此加入5 μL PE Annexin V 和5 μL 7-AAD后輕輕混懸細胞，于室溫(25 ℃)避光條件下反應15 min，然后加入400 μL結合緩沖液，4 ℃避光保存，在24 h內用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 pEGFP-C2-TMEM173真核表達載體的構建與熒光表達對pEGFP-C2-TMEM173的連接產物進行轉化，并挑取4個單克隆擴大培養后進行質粒抽提，然后進行雙酶切(EcoR I和BamH I)鑒定，并對酶切產物進行瓊脂糖電泳，結果如Fig1A顯示，有2個質粒酶切后出現了兩條亮帶，與DNA Marker橫向比較，發現其中一條大小約為4 700 bp，與pEGFP-C2空載體酶切產物的大小一致，另一條大小分別約為1 140 bp，與TMEM173目的片段大小一致，表明各重組質粒連接成功，選取其中一個陽性克隆送生物公司進行DNA測序，并將測序結果與TMEM173的CDS序列進行比較分析，結果發現二者的堿基序列完全一致。將pEGFP-C2-TMEM173瞬時轉染至LX-2細胞中，約24 h后在熒光顯微鏡下觀察TMEM173的過表達情況，結果如Fig1B所示，具有綠色熒光的細胞即為表達成功的細胞。進一步利用激光共聚焦技術對TMEM173的細胞亞定位進行了觀察，結果如Fig1C所示，pEGFP-C2-TMEM173過表達后主要定位在細胞質中。綜上表明pEGFP-C2-TMEM173真核表達載體成功構建并表達。

Fig 1 Restriction enzyme identification and fluorescent expression of pEGFP-C2-TMEM173A:The restriction enzyme identification of pEGFP-C2-TMEM173,M:DNA marker;1-4:the enzyme digestion products of pEGFP-C2-TMEM173;5:the enzyme digestion products of pEGFP-C2.B:Fluorescent expression of pEGFP-C2-TMEM173 after transfection for 24 hours.C:Subcellular localization of pEGFP-C2-TMEM173,GFP showed the green fluorescence localization of GFP-TMEM173 in LX-2;DAPI staining showed the nucleus;MERGE showed the superposition of GFP and DAPI.

2.2 TMEM173過表達和沉默效果檢測分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時轉染至LX-2細胞中，約24 h后收集各組細胞提取總RNA和總蛋白，并檢測TMEM173的過表達和沉默效果。QPCR結果如Fig2A、B所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細胞中TMEM173的mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組則明顯降低(P<0.05)。另外，Western blot結果如Fig2C、D所示，當用TMEM173抗體進行免疫印跡時，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組在約64 ku的位置還出現了明顯的蛋白條帶，即為GFP-TMEM173融合蛋白(27 ku+37 ku)的表達；反之，TMEM173 -siRNA組細胞中的TMEM173的蛋白表達水平則明顯降低(P<0.05)，表明TMEM173在LX-2細胞中能夠成功過表達和沉默。

Fig 2 Effect of TMEM173 overexpression and silencingA and C:The QPCR and Western blot results of TMEM173 overexpression in LX-2 cells,1:Untransfected LX-2 cells;2:LX-2 cells transfected with pEGFP-C2;3:LX-2 cells transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B and D:The QPCR and Western blot results of TMEM173 silencing in LX-2 cells,4:Untransfected LX-2 cells;5:LX-2 cells transfected with NC-siRNA;6:LX-2 cells transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

2.3 TGF-β1誘導LX-2細胞活化α-SMA表達量的增加是HSC活化的主要標志，分別在LX-2細胞中按時間和濃度梯度加入TGF-β1進行刺激，分別收集各組細胞提取總RNA和總蛋白進行QPCR和WB檢測。結果顯示，當TGF-β1誘導12 h后，α-SMA的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高，且隨著誘導時間的遞增呈上升趨勢，存在一定的時間依耐性，見Fig3A；當TGF-β1誘導濃度為10 μg·L-1時，α-SMA的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高，且隨著誘導濃度的遞增呈上升趨勢，同樣存在一定的濃度依耐性，見Fig3B。綜上表明10 μg·L-1的TGF-β1誘導12 h后即可使LX-2細胞活化。

Fig 3 Activation of LX-2 cells induced by TGF-β 1A:The mRNA and protein expression levels of α-SMA were detected after LX-2 cells were induced by TGF-β1 in time gradient.B:The mRNA and protein expression levels of α-SMA were detected after LX-2 cells were induced by TGF-β1 in concentration gradient.*P<0.05 vs control group.

2.4 TMEM173過表達和沉默對活化LX-2細胞增殖的影響在TGF-β1誘導LX-2細胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時轉染至LX-2細胞中，約24 h后分別用MTT和EdU法檢測各組細胞的增殖情況，結果如Tab 2和Fig4所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細胞的增殖率明顯升高(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組細胞的增殖率則明顯降低(P<0.05)。表明TMEM173過表達能夠明顯促進活化LX-2細胞的增殖，而其沉默則能發揮明顯的抑制增殖作用。

2.5 TMEM173過表達和沉默對活化LX-2細胞凋亡的影響在TGF-β1誘導LX-2細胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時轉染至LX-2細胞中，約24 h后收集各組細胞，分別進行PE Annexin V和7-AAD染色，然后利用流式細胞術檢測各組細胞的凋亡情況，結果如Tab 3和Fig5所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組細胞的凋亡率則明顯升高(P<0.05)。表明TMEM173過表達能夠明顯抑制活化LX-2細胞的增殖，而其沉默則能發揮明顯的促進凋亡作用。

Tab 2 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on proliferation of activated LX-2 cells

Tab 3 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on apoptosis of activated LX-2 cells

Fig 4 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on proliferation of activated LX-2 cellsA:Effect of TMEM173 overexpression on the proliferation of activated LX-2 cells,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on the proliferation of activated LX-2 cells,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

Fig 5 Effects of TMEM173 overexpression and silencing on apoptosis of activated LX-2 cellsA:Effect of TMEM173 overexpression on apoptosis of activated LX-2 cells,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on apoptosis of activated LX-2 cells,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

2.6 TMEM173對活化LX-2細胞的增殖和凋亡相關通路蛋白表達的影響在TGF-β1誘導LX-2細胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時轉染至LX-2細胞中，約24 h后收集各組細胞提取總蛋白，定量分析后進行Western blot檢測，分別用PCNA、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP等抗體進行免疫印跡，結果如Fig6所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2-TMEM173組細胞中PCNA和Bcl-2的蛋白表達水平明顯上調(P<0.05)，且Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP則明顯下調(P<0.05)；反之，TMEM173 -siRNA組細胞中PCNA和Bcl-2的蛋白表達水平明顯下調(P<0.05)，且Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP則明顯上調(P<0.05)，表明TMEM173的表達變化對增殖和凋亡相關通路蛋白具有調控作用，進而發揮其促增殖和抑凋亡的作用。

Fig 6 Effect of TMEM173 on expression of proliferation and apoptosis related pathway proteins in activated LX-2 cellsA:Effect of TMEM173 overexpression on the expression of proliferation and apoptosis related pathway proteins in activated LX-2 cells,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on the expression of proliferation and apoptosis related pathway proteins in activated LX-2 cells,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

2.7 TMEM173對cGAS-STING通路活化的影響在TGF-β1誘導LX-2細胞12 h后，分別將pEGFP-C2-TMEM173(pEGFP-C2為對照)和TMEM173-siRNA(NC-siRNA為對照)瞬時轉染至LX-2細胞中，約24 h后收集各組細胞提取總蛋白，定量分析后進行Western blot檢測，分別用TBK1和IRF3抗體進行免疫印跡，結果如Fig7所示，與空白組和對照組相比，pEGFP-C2 -TMEM173組細胞中TBK1和IRF3的蛋白表達水平明顯上調(P<0.05)，反之，TMEM173-siRNA組細胞中TBK1和IRF3的蛋白表達水平明顯下調(P<0.05)。表明TMEM173的表達變化對cGAS-STING通路的活化具有調控作用。

Fig 7 Effect of TMEM173 on activation of cGAS-STING pathwayA:Effect of TMEM173 overexpression on activation of cGAS-STING pathway,1:Blank group without transfection;2:Control group transfected with pEGFP-C2;3:Overexpression group transfected with pEGFP-C2-TMEM173.B:Effect of TMEM173 silencing on activation of cGAS-STING pathway,4:Blank group without transfection;5:Control group transfected with NC-siRNA;6:Silencing group transfected with TMEM173-siRNA.*P<0.05 vs control group.

3 討論

HSC占肝臟固有細胞總數的15%，占非實質細胞的30%左右。HSC是細胞外基質的主要來源，各種致纖維化因素均把其作為最終靶細胞，當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，其被激活并轉化為肌成纖維細胞樣細胞，其表型便由靜止型轉變為激活型。激活的肝星狀細胞通過增生和分泌細胞外基質參與肝纖維化的形成和肝內結構的重建，最終奠定了肝纖維化的病理學基礎。本研究涉及的LX-2細胞是最常見的HSC體外細胞模型之一，其保留著活化HSC的關鍵特征，如細胞因子信號傳導、神經元基因表達、維甲酸代謝和纖維形成等，廣泛應用于肝炎及纖維化的體外研究[10-11]。

TMEM173又稱為STING、MPYS或ERIS，其具有高度的保守性，在不同真核細胞和無脊椎動物中都存在同源物，人源與鼠源的TMEM173的相似性高達81%[12]。TMEM173高表達于一些免疫細胞來源的細胞系，提示其可能在免疫系統中具有重要功能。而且TMEM173本身還可以作為受體，直接結合細菌分泌的重要第二信使——環二核苷酸(cyclic dinucleotides，CDNs)，誘導抗感染的固有免疫反應[13-14]。有研究表明TMEM173在非酒精性脂肪肝患者肝組織中表達水平明顯增加，DMXAA誘導能夠促進巨噬細胞介導的小鼠肝臟炎癥和纖維化因子的表達，并增強HSC的活化[9]。

本研究旨在探索TMEM173對活化LX-2的細胞增殖和凋亡的調控功能。TGF-β1是肝實質細胞受損后釋放的強效致纖維化因子，是啟動鄰近靜息態HSC活化的重要初始信號之一，因此，在本研究中我們首先利用TGF-β1刺激LX-2建立人肝星狀細胞體外活化模型。然后我們通過改變活化LX-2細胞中TMEM173的表達水平來研究其對細胞增殖和凋亡的影響，一方面利用基因重組技術構建真核表達質粒pEGFP-C2-TMEM173來提高LX-2細胞中TMEM173的表達水平，另一方面設計并合成TMEM173-siRNA來降低TMEM173的表達水平，且QPCR和Western blot結果顯示二者能夠達到TMEM173預期的過表達和沉默效果。緊接著我們分別在活化的LX-2細胞中過表達和沉默了TMEM173，并分別利用MTT和FCM技術檢測了其增殖和凋亡情況，結果發現TMEM173過表達能夠明顯促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，而沉默TMEM173則能夠得到相反的結果。

為探索TMEM173促增殖、抑凋亡的分子機制，我們進一步細胞增殖和凋亡標志蛋白的表達水平進行了檢測。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是一類只存在于增殖細胞中的階段性表達的蛋白質，其濃度在細胞周期中呈周期性變化，檢測其表達水平可以作為評價細胞增殖狀態的重要指標[15]，本研究發現TMEM173過表達后能夠明顯提高PCNA的蛋白表達水平，而其沉默后又明顯降低PCNA的蛋白表達水平，進一步確定了TMEM173調控細胞增殖的功能。Bcl-2家族蛋白是在細胞凋亡過程中起關鍵性作用的一類蛋白，主要包括抗凋亡蛋白(如Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w 等)和促凋亡蛋白(如Bax、Bak、Bid 等)，它們可通過調節線粒體中細胞色素C(cyt-c)釋放來調控細胞凋亡，cyt-c的釋放是線粒體凋亡途徑激活的顯著特征，其被釋放到細胞質中后能夠與凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)結合，導致caspase-3激活而引起細胞凋亡，而活化的caspase-3能夠水解PAPR，后者被認為是凋亡的標志物。本研究發現TMEM173過表達后能夠明顯提高Bcl-2的蛋白表達水平，而明顯降低Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表達水平，且TMEM173沉默也能夠得到相反的結果，進一步表明了TMEM173能夠有效調控細胞凋亡，其作用機制可能與改變 Bax /Bcl-2 及 cleaved caspase-3 的蛋白表達有關。接下來本研究還對cGAS-STING通路中關鍵蛋白TBK1和IRF3的表達水平進行了檢測，結果發現TMEM173過表達能夠明顯上調它們的表達水平，意味著其調控HSC細胞增殖可能與cGAS-STING通路的活化有著密切關系。

綜上表明，TMEM173在活化肝星狀細胞的增殖與凋亡過程中扮演著積極的角色，很可能成為肝炎和肝纖維化基因治療的潛在靶點。接下來我們將分別建立肝炎和肝纖維化的細胞和動物模型，進一步研究TMEM173對肝星狀細胞中炎癥因子、纖維化因子分泌和表達的影響，以及對相關信號通路的調控功能，深入探索TMEM173參與肝炎和肝纖維化發生發展的具體機制。