益心泰有效組分對慢性心衰兔心肌組織CaN的影響

魏佳明，李玉瑩，李佳玲，李 卉，匡 琳，郭志華，李 雅

(湖南中醫藥大學 湖南 長沙 410208)

慢性心力衰竭 (chronic heart failure，CHF)是心室充盈或射血能力受損的一組復雜綜合征，是世界范圍內的公共衛生問題，造成了嚴重的醫療負擔[1]。因此，對其進行積極干預尤為重要。心肌重構是心衰臨床進展的關鍵機制。近年來大量研究顯示，鈣調神經磷酸酶 (calcineurin，CaN)在心肌重構過程中扮演著重要角色[2]。前期研究表明，益心泰具有抗心衰作用及改善心室重構功能，其機制可能與調節CaN活性有關[3]。中藥藥效組分制劑為現代中藥研究的一大熱點，藥效組分包括由化合物和單體組成的化學成分，以及由蛋白質、核酸、多糖等共同組成的信息成分。通過研究中藥復方有效組分對疾病的影響，有助于打開復方有效的密碼，構建中藥組效關系，保持其治療多基因調控的某些復雜疾病與需長期用藥的慢性疾病的獨特優勢，其療效值得更深入的研究開發和應用。因此，本研究以慢性心衰兔模型作為研究對象，觀察兔心肌組織形態學及心功能指標的變化，并檢測心肌細胞Ca2+濃度，心肌組織CaN活性、mRNA及蛋白表達水平，深入研究益心泰有效組分 (effective components of Yi-xin-tai，ECYXT)對慢性心衰兔的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物體質量(1.5-2.0)kg的普通級健康新西蘭兔120只，♀♂各半。購自湖南太平生物科技有限公司，動物許可證編號：SCXK (湘)2015-0004，合格證號：NO.43608300000615，自由進食水，光/暗周期12 h/12 h (光照時間6 ∶00-18 ∶00)，室溫23 ℃左右，濕度52%-60%。該實驗得到湖南中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會批準 (LL2018010801)。

1.2 實驗藥物益心泰有效組分：黃芪、紅花、丹參、澤瀉、豬苓等購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，按照3 ∶1 ∶1.5 ∶1 ∶1配比，采用系統溶劑法與大孔樹脂吸附法相結合，對益心泰復方中4個不同極性部位的藥效組分進行分離，根據最佳工藝條件，分離得到益心泰有效組分提取液，冷凍干燥得提取物 (含總皂苷372.4 mg·g-1、總黃酮98.3 mg·g-1、總多糖445.8 mg·g-1)，益心泰有效組分低、中、高劑量組濃度分別為每日2.1、4.2、8.4 g·kg-1，給藥前予以蒸餾水稀釋后灌胃；氯沙坦鉀：50 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，H20000371；丙基硫氧嘧啶：50 mg/片，蘇州東瑞制藥有限公司，H32020795；烏拉坦：Sigma，94300；生理鹽水：500 ml/瓶，四川科倫藥業股份有限公司，H51021158；青霉素：160萬U/支，山東瑞陽制藥有限公司，H37021949。

1.3 實驗試劑與儀器多聚甲醛(Sigma,16005)；蘇木精(Sigma,H9627)；伊紅(Sigma,E4009)；石蠟 (河南天孚化工有限公司)；組織鈣調神經磷酸酶活性酶連續循環比色法定量試劑盒(赫澎生物,HPBIO-JM6321)；RIPA裂解液 (北京索萊寶生物科技有限公司)；PMSF (北京索萊寶生物科技有限公司)；BSA蛋白定量試劑盒 (北京索萊寶生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒 (TaKaRa,RR047A)；Trizol (Invitrogen,15596-026)；SYBR Premix EX Taq TM II (Takara,DRR820A)；RM2235石蠟輪轉切片機 (Leica公司)；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡 (OLYMPUS公司)；Fluo3/AM (碧云天,S1056)；Pluronic-F127 (Sigma,P2443)；Sequoia 512超聲心動圖機 (西門子公司)；MK3酶標儀 (Thermo公司)；DYY-7C型電泳儀 (北京市六一儀器廠)；SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統 (Bio-Rad公司)；iQ5 PCR儀 (Bio-Rad)。

1.4 動物分組及模型制備參考文獻[4-5]，以腹主動脈縮窄法+丙基硫氧嘧啶灌胃制作兔慢性心衰模型。隨機選擇實驗兔20只作為假手術組，其余100只為模型兔。將兔固定于手術臺上，用20%烏拉坦5 mL·kg-1腹腔麻醉。麻醉后在右側腎動脈分支上方分離腹主動脈，用4號手術線結扎，使腹主動脈縮窄50%左右；假手術組只開放腹主動脈，不結扎。兔腹腔注射青霉素10萬U后關腹縫合。術后用開口器和灌胃管對兔行丙基硫氧嘧啶 (PTU)灌胃。假手術組給予生理鹽水。灌胃量為兔每日攝食量的0.2%，每日1次，持續6周。造模后d 1，模型兔比較于假手術組出現精神萎靡，抓起反抗降低，心率和呼吸頻率升高，耳溫和尿量均減少及水腫表現 (Tab 1)；同時IVS、LVPW、LVIDs、LVIDd等心臟結構性指標也明顯升高，提示了心臟病理性重構的存在；而LVEF、LVFS、E/A比值等心臟收縮功能指標都明顯的下降，提示了模型兔心功能下降 (Tab 2)。綜上，表明家兔慢性心力衰竭的模型復制成功。將造模成功的模型兔按完全隨機設計方法分為HF模型組(17只)、益心泰有效組分低劑量組(17只)、中劑量組(16只)、高劑量組(16只)和氯沙坦鉀組(16只)，合假手術組(20只)，一共6組。

Tab 1 Hair color,mental state,heart rate,respiratory rate,ear temperature,urine volume,edema of rabbits in sham operation group and model group

Tab 2 Ultrasonic examination results of rabbit heart in sham operation group and model group

1.5 干預方法于造模后第1周開始灌胃，根據成人體表面積換算法，結合臨床用藥經驗和既往實驗研究，確定益心泰有效組分低、中、高劑量組分別為每日2.1、4.2和8.4 g·kg-1，氯沙坦鉀組 (制成氯沙坦鉀懸液)2.75 mg·kg-1，假手術組與HF模型組灌服同等容積的蒸餾水，各組灌胃量均為每次10 mL·kg-1，均每日1次，連續4周。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1一般情況 觀察兔毛色、精神狀態、心率、呼吸頻率、耳溫、尿量、水腫等一般情況。

1.6.2心臟超聲檢測 麻醉滿意后將兔平臥位固定，運用西門子Sequoia 512超聲心動圖機，探頭頻率3-8 MHz，于心前區取左室長軸最大直徑處，M型超聲標記室間隔和左室后壁收縮末與舒張末期心內膜位置，隨機軟件自動計算兔LVEF、LVFS、IVS、LVPW、E/A比值及LVIDs、LVIDd等指標，取5個心動周期讀數平均值。

1.6.3心肌組織形態學檢查 4%多聚甲醛固定組織，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片 (厚4-5 μm)，烤片，HE染色，光鏡觀察并采圖。

1.6.4心肌細胞[Ca2+]i濃度 采用熒光負載法測定。酶解法分離心肌細胞，離心后棄上清，細胞沉淀重懸于Joklik培養基，并放入培養瓶中，清洗細胞3次以無菌D’-Hanks液，添加Fluo3/AM (終濃度為4 μmol·L-1)和Pluronic-F127 (終濃度為0.05 %)，輕輕震蕩孵育45 min，37 ℃，去除負載液，啟動共聚焦掃描顯微鏡，488 nm激光掃描，計算、統計、分析數據，計算公式為[Ca2+]i=Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/f=Fmax)，其中Kd為解離常數，F為樣品的熒光強度值。

③泄流渠進出水口確定。泄流渠進出水口的布置應有利于進水和出水的銜接，盡量消除回流、渦流的不利影響。泄流渠進口可建成逆坡，防止劇烈沖刷。進出水口方向與主渠道的交角不宜太大。進出水口的高程根據上游庫容、上游水位上升趨勢、壩體潰決方式、下游防洪標準、泄流渠長度和坡度以及現場施工能力等因素設計選擇。

1.6.5心肌組織CaN活性測定 采用酶學比色法。先將試劑盒板條于室溫平衡20 min，設置標準品孔、空白孔和檢測孔，分別置不同濃度標準品于標準品空中。空白孔不加。在檢測孔中加入10 μL樣品和40 μL稀釋液，在檢測孔與標準品孔分別加入100 μL辣根過氧化物酶標記抗體。于37 ℃下孵育1 h，去液體后，將洗滌溶液添加到每個孔中，靜置1 min以去除洗滌溶液。反復洗滌5次，加入底物A和B各50 μL到每個孔中，在室溫條件下孵育15 min，檢測OD值，計算和統計分析。

1.6.6CaN蛋白檢測 采用Western blot法測定，液氮研磨心肌組織后，加入裂解液并置于冰上20 min使其充分裂解后，在4 ℃和12 000 r·min-1離心15 min后，保留上清，用BCA法定量蛋白，制備SDS-PAGE濃縮膠與分離膠，上樣，電泳，轉膜，封閉，配一抗，一抗(1 ∶500)，二抗 (1 ∶2 000)，顯影成像，利用Quantity-One圖像分析軟件分析各樣品目的條帶的灰度值，以看家基因GAPDH為內對照，CaN蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值之比(以假手術組作為基礎數值)即是目的蛋白的相對表達量。

1.6.7CaN mRNA檢測 RT-PCR法測定心肌組織CaN mRNA水平，用TRIzol法提取總RNA，測OD值，檢驗RNA純度和濃度。逆轉錄合成cDNA:配置逆轉錄反應體系 (20 μL)，用去離子水1 ∶3稀釋后貯存于-20 ℃冰箱備用。引物設計與合成:CaN：F:5′-ACGGCAGACCCTACAAAG-3′；R:5′-CCCTCAAAGCCTCCATCC-3。PCR反應體系：配置逆轉錄反應體系(20 μL)，置于PCR儀中，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，步驟2-4循環40次，72 ℃ 10 min。PCR產物長度391 bp。

1.7 統計學分析不同資料采用不同的統計方法，所有數據均用SPSS 21.0統計處理，計量資料均以處理。多組間比較采用ANOVA法分析，以LSD法進行兩組間療效比較。

2 結果

2.1 各組一般情況比較造模過程中，模型兔共死亡18只，16只死于腹瀉，2只死因不明。所有死亡兔進行解剖均可見不同程度的胸腔、腹腔積液及肝脾腫大。用藥后，益心泰有效組分低、中、高劑量組及氯沙坦鉀組以上情況逐漸較前好轉，但是HF模型組沒有明顯的改變，并且其中部分實驗兔較前嚴重。整個用藥過程中HF模型組死亡3只(均死于腹瀉)，低、中劑量組各死亡2只兔(全部死于腹瀉)，高劑量組、氯沙坦鉀組各死亡1只兔(均因腹瀉死亡)，假手術組無兔死亡。在癥狀改善方面，效果最優的為中、高劑量組和氯沙坦鉀組，明顯強于低劑量組，而HF模型組無改善且較前嚴重。

2.2 ECYXT對慢性心衰兔心臟超聲指標的影響益心泰有效組分低、中、高劑量組與氯沙坦鉀組LVEF、LVFS和E/A比值與HF模型組相比均明顯提高，差異有顯著性(P<0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組LVEF、LVFS和E/A比值均明顯升高，差異有顯著性 (P<0.01)，而3組之間差異無顯著性 (P>0.05)(Tab 3)。

Tab 3 Effects of ECYXT on echocardiographic indexes of CHF rabbits

低劑量組與HF模型組IVS差異無顯著性(P>0.05)，而中、高劑量組與氯沙坦鉀組IVS均明顯低于HF模型組(P<0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組IVS均明顯降低 (P<0.01)，而3組之間差異無顯著性(P>0.05)(Tab 3)。

與HF模型組比較，低、中、高劑量組與氯沙坦鉀組LVPW均明顯降低 (P<0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組、氯沙坦鉀組LVPW均明顯降低(P<0.01)，而3組之間差異無顯著性(P>0.05)(Tab 3)。

與HF模型組比較，低、中、高劑量組與氯沙坦鉀組LVIDs均明顯降(P<0.01)。與低劑量組比較，中劑量組和氯沙坦鉀組LVIDs差異無顯著性(P>0.05)，而高劑量組LVIDs明顯低于低劑量組(P<0.01)。而中、高劑量組與氯沙坦鉀組LVIDs差異均無顯著性(P>0.05)(Tab 3)。

低、中、高劑量組與氯沙坦鉀組LVIDd均明顯低于HF模型組(P<0.01)。與低劑量組比較，中劑量組LVIDd差異無顯著性 (P>0.05)，而高劑量組和氯沙坦鉀組LVIDd明顯降低(P<0.01)。而中、高劑量組與氯沙坦鉀組差異均無顯著性(P>0.05)(Tab 3)。

2.3 ECYXT對慢性心衰兔心臟組織形態學的影響HF模型組表現為心肌細胞水腫、壞死，胞核皺縮，間質增寬，少量炎細胞浸潤，心肌纖維排列紊亂，部分斷裂。各治療組心肌細胞損傷均較HF模型組有不同程度減輕。低劑量組心肌細胞排列紊亂，纖維斷裂，間質增寬，少許炎細胞浸潤。中劑量組心肌纖維排列基本正常，少量纖維斷裂，心肌細胞輕度水腫，間質增寬，少量炎細胞浸潤。高劑量組心肌纖維排列正常，無斷裂，無水腫，間質少許炎細胞浸潤。氯沙坦鉀組：心肌纖維排列正常，無水腫，間質少量炎細胞浸潤。假手術組：心肌纖維排列正常，無斷裂和水腫，細胞間質無炎細胞浸潤 (Fig1)。

Fig 1 Effect of ECYXT on pathological changes of myocardial tissues in CHF rabbits (HE×400)A:HF model group;B:Low dose group of ECYXT;C:Medium dose group of ECYXT;D:High dose group of ECYXT;E:Losartan potassium group;F:Sham operation group.

2.4 ECYXT對慢性心衰兔心肌細胞[Ca2+]i及心肌組織CaN活性濃度的影響與HF模型組比較，各用藥組心肌細胞[Ca2+]i濃度明顯降低 (P<0.01)。并且中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌細胞[Ca2+]i濃度均低于低劑量組 (P<0.01)。而中、高劑量組與氯沙坦鉀組3者之間心肌細胞[Ca2+]i濃度差異均無顯著性 (P>0.05)(Tab 4)。

與HF模型組比較，各用藥組心肌組織CaN活性明顯降低，與HF模型組比較，差異有顯著性 (P<0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織CaN活性均明顯降低 (P<0.01)。而中、高劑量組與氯沙坦鉀組心肌組織CaN活性差異均無顯著性 (P>0.05)(Tab 4)。

2.5 ECYXT對慢性心衰兔心肌組織CaN蛋白及mRNA表達的影響與HF模型組比較，各用藥組CaN蛋白表達均降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織CaN蛋白表達均明顯降低(P<0.01)。而中、高劑量組與氯沙坦鉀組心肌組織CaN蛋白表達差異均無顯著性(P>0.05)(Fig2,Tab 5)。

Tab 4 Effects of ECYXT on [Ca2+]i concentration and CaN activity of myocardial tissues in CHF rabbits

Fig 2 Effects of ECYXT on expression of CaN protein of myocardial tissues in CHF rabbitsA:Sham operation group;B:HF model group;C:Low dose group of ECYXT;D:Medium dose group of ECYXT;E:High dose group of ECYXT;F:Losartan potassium group.

與HF模型組比較，各用藥組CaN mRNA水平均降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與低劑量組比較，中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織CaN mRNA水平均明顯降低 (P<0.01)。而中、高劑量組與氯沙坦鉀組心肌組織CaN mRNA水平差異均無顯著性(P>0.05)(Tab 5)。

Tab 5 Effects of ECYXT on level of CaN mRNA and protein expression of myocardial tissues in CHF rabbits

3 討論

慢性心力衰竭是多種心血管疾病的終末期表現和最主要的死因，主要表現為呼吸困難、體力活動受限和體液潴留，已成為嚴重影響人民生命健康的公共衛生問題。目前對于心衰的治療目標在改善患者癥狀的基礎上，更注重提高患者生活質量，遏止心肌重構的進一步發展。近年來，中醫藥治療CHF在延緩癥狀、提高患者的生活質量、增延壽命、減少不良反應等方面表現出一定療效。同時，對心衰進行原創中藥研究契合國家中醫藥發展戰略需求導向。

益心泰為臨床科研方，由黃芪、紅花、丹參、澤瀉、豬苓等藥伍用而成，功在益氣活血利水。本方以補氣、活血、利水為主，制方特點重在君以黃芪補心、肺、脾之氣。臣以丹參、紅花活血化瘀，行血中之滯。佐用澤瀉、豬苓利水消腫。因方中紅花、丹參歸心經，故不再配用使藥。經過二十余年的臨床用藥證明其具有抗心室重構作用，且安全、有效，無不良反應，值得臨床推廣應用。現代研究表明，益心泰能降低慢性心衰兔LVPW、IVS、LVIDs、LVIDd，升高LVEF、LVFS、E/A比值，降低血清BNP水平，說明益心泰可以改善心肌重構，提高心功能[3]。同時其還可以降低腎髓質水通道蛋白及其mRNA表達量，增加尿量，發揮利水作用，從而改善慢性心力衰竭[6]。益心泰還可降低慢性心衰大鼠心肌細胞內[Ca2+]i含量、Ca2+-ATP酶活性，上調SERCA2a蛋白表達，抑制鈣超載[7]。研究表明，黃芪多糖能通過抑制Ca2+-NFATc3-CaMKII信號通路，進而起到改善心衰的效果[8]。丹參多酚可以直接對心肌細胞發揮保護作用[9]。紅花提取物可抑制H9C2細胞中的BAD和Bax兩個促凋亡基因表達，有效抑制AngII誘導的細胞凋亡[10]。

本研究采用腹主動脈縮窄法+丙基硫氧嘧啶灌胃制作兔慢性心衰模型，深入探討益心泰有效組分對慢性心衰兔心肌組織CaN的影響。CaN作為一種絲/蘇氨酸磷酸酶，可通過影響細胞重構、功能重構及心肌細胞凋亡等多方面干涉心肌重構。研究表明，CaN介導的信號通路激活與心肌細胞內Ca2+升高密切相關，當心肌細胞內Ca2+濃度增加時可激活CaN，進一步啟動向核內傳遞的信號通路，經過一系列反應促進心肌肥厚表型的再表達。與此同時，也可導致細胞膜表面的鈣處理蛋白功能失常，其中心肌肌漿網鈣泵的失常可以直接影響心肌舒縮作用于功能重構[1]。此外，活化的CaN能促進凋亡蛋白Bad表達，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達，加速細胞凋亡。由于以上種種原因，通過降低細胞內Ca2+含量進而抑制CaN活化成為改善心肌重構、提高心功能的有效舉措。研究選用氯沙坦鉀作為陽性對照藥，氯沙坦能下調心衰時心肌細胞內鈣離子濃度[11-12]，且可以改善心肌重構。心衰時腎素-血管緊張素(RAS)系統被激活，RAS的主要活性肽血管緊張素Ⅱ可通過與1型AngⅡ受體結合，引起細胞鈣超載進而啟動細胞凋亡，及促進心肌肥大和炎癥反應，導致心肌重構。研究表明，氯沙坦對心衰時心功能、心臟重構的逆轉作用可能與其阻斷AngⅡ與AT1R[13-14]、抑制炎癥反應[15]及恢復肌漿網和肌纖維功能有關[16]。本研究結果顯示，與假手術組比較，HF模型組的LVEF、LVFS、E/A值均明顯降低(P<0.01)，心肌細胞內Ca2+濃度，CaN活性、mRNA及蛋白表達明顯升高 (P<0.01)，提示HF兔心功能下降。與HF模型組相比，各給藥組LVEF、LVFS、E/A均有明顯升高(P<0.01)，心肌細胞內Ca2+濃度與心肌組織CaN活性、mRNA及蛋白表達明顯降低 (P<0.01)，說明益心泰有效組分能下調心肌細胞內Ca2+濃度與心肌組織CaN活性、mRNA及蛋白表達，提高心功能。且發現各治療組均能不同程度減輕心肌細胞水腫、壞死、細胞核皺縮，減少纖維斷裂及炎性細胞浸潤，從病理形態學的角度說明益心泰有效組分能改善心肌細胞損傷程度。進一步研究不同劑量的區別，筆者對益心泰有效組分各劑量組進行比較發現，中、高劑量組和氯沙坦鉀組LVEF、LVFS和E/A比值均明顯高于低劑量組 (P<0.01)，且心肌細胞內Ca2+濃度與心肌組織CaN活性、mRNA及蛋白表達均明顯低于低劑量組 (P<0.01)，說明益心泰有效組分中、高劑量治療HF療效明顯優于低劑量。以上結果表明益心泰有效組分能通過降低心肌細胞內Ca2+含量，進而抑制心肌組織CaN活性，抑制心肌組織CaN mRNA及蛋白的表達，改善心肌重構，改善心衰。Yang等[17]在研究芪參顆粒對結扎左冠狀動脈前降支大鼠心衰模型的作用機理時，發現芪參顆粒可抑制胞內高Ca2+濃度激活的關鍵酶CaN活性及抑制CaN蛋白的表達。Wang等[18]的研究發現CaN抑制劑環孢素A可阻斷由苯腎上腺素誘導的新生大鼠心肌細胞內Ca2+升高引起的CaN活性提高及CaN蛋白質水平上調。本研究結果中，益心泰有效組分對心肌細胞內Ca2+濃度與心肌組織CaN活性及CaN蛋白表達的調節作用與以上研究結果具有一致性。

綜上，本研究通過觀察益心泰有效組分對慢性心力衰竭兔模型進行干預，比較各組兔心肌組織組織形態學，心功能指標，心肌細胞內Ca2+濃度，心肌組織CaN活性、CaN mRNA及蛋白表達，結果表明益心泰有效組分能提高心功能，其機制可能是通過抑制CaN活性，抑制CaN mRNA及其蛋白表達，改善心肌重構，進而改善心衰。且不同劑量均能改善心肌重構，防治心衰的進展，但低劑量效果欠佳，而中、高劑量效果明顯。