4-羥基芝麻素通過抑制p38MAPK/NLRP3信號通路減輕BV2小膠質細胞神經炎癥損傷

張 慶，倪 林，黃貞偉，張小琴，林 埔

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建農林大學植物保護學院，福建 福州 350002)

4-羥基芝麻素(4-hydroxysesamin)屬于雙四氫呋喃木脂素類成分，存在于葉下珠、黃荊、香樟等中藥中。以芝麻素為代表的雙四氫呋喃類成分具有抗腫瘤、抗腦卒中等作用[1-2]，但有關4-羥基芝麻素對神經炎癥反應的抑制作用及可能機制未見報道。因此，本實驗以課題組前期從香樟中獲得的4-羥基芝麻素為研究對象[3]，采用LPS誘導的BV2小膠質細胞神經炎癥模型，探討其對小膠質細胞神經炎癥反應是否具有保護作用及可能作用機制，從而為從中藥中尋找神經保護類藥物提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑4-羥基芝麻素(由福建農林大學植物保護學院倪林副教授提供，純度>98%)；脂多糖(Sigma，批號：L2630)；caspase-1 p20(SANTA CRUZ公司，批號：SC-398715)；IL-18(ab207323)、NLRP3(ab263899)均購自abcam公司；p38(8690S)、Phospho-p38(4511S)、COX-2(12282)、兔二抗(7074)均購自CST公司；鼠二抗(北京全式金生物技術有限公司，批號：HS101-01)。

1.2 主要儀器光學顯微鏡(Thermo Fisher公司)；酶標儀(TECAN公司)；7900H熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；電泳儀、化學發光成像儀(BIO-RAD公司)。

1.3 藥物制備精密稱取4-羥基芝麻素適量，溶于含20% DMSO的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為100 mmol·L-1的母液備用。

1.4 細胞培養復蘇BV2小膠質細胞(中國典型培養物保存中心)，培養于DMEM完全培養基中每天換液、隔天傳代，供后續實驗使用。

1.5 MTT法檢測BV2小膠質細胞存活率將BV2小膠質細胞分為正常對照組(C)、LPS模型組(100 ng·L-1)、4-羥基芝麻素低劑量組(10 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-L)、4-羥基芝麻素中劑量組(20 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-M)、4-羥基芝麻素高劑量組(40 μmol·L-1，4-hydroxysesamin-H)。采用MTT法檢測細胞存活率。

1.6 ELISA法檢測BV2小膠質細胞中IL-6、IL-1β的含量將BV2小膠質細胞接種于6孔板中，分組同“1.5”。采用ELISA法檢測細胞上清中IL-6、IL-1β的含量。

1.7 Western blot法檢測BV2小膠質細胞中p38MAPK/NLRP3通路相關蛋白表達水平BV2小膠質細胞種板、造模和給藥同“1.6”。蛋白經電泳、轉膜、封閉后，加入一抗(COX-2、p38、p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、β-actin)和相應二抗，再置于凝膠成像系統中顯影，最后使用Image Lab軟件分析圖像。

2 結果

2.1 4-羥基芝麻素對BV2小膠質細胞存活率的影響結果表明，與正常對照組相比，BV2小膠質細胞存活率在LPS(100 ng·L-1)干預12 h的條件下無明顯變化；與LPS組相比，4-羥基芝麻素(10、20、40 μmol·L-1)對細胞存活率無顯著影響。

2.2 4-羥基芝麻素對LPS誘導的BV2小膠質細胞IL-6、IL-1β分泌水平的影響Tab 1結果表明，與正常對照組比較，LPS干預12 h后，BV2小膠質細胞上清中IL-6、IL-1β的水平明顯上升(P<0.01)；與LPS模型組比較，隨著4-羥基芝麻素濃度的增大，BV2小膠質細胞上清中IL-6、IL-1β的含量明顯下降(P<0.05或P<0.01)。

Tab 1 Effect of 4-hydroxysesamin on levels of IL-6,IL-1β in LPS-induced BV2 microglial cells n=3)

2.3 4-羥基芝麻素抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞中p38MAPK/NLRP3通路的激活Tab 2結果表明，與正常對照組比較，LPS干預12 h后，BV2小膠質細胞中p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、COX-2蛋白表達均明顯上升(P<0.05或P<0.01)；與LPS模型組比較，隨著4-羥基芝麻素濃度的增大，BV2小膠質細胞中p-p38、NLRP3、caspase-1 p20、IL-18、COX-2的蛋白表達水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

Tab 2 Effect of 4-hydroxysesamin on protein expression of p38MAPK/NLRP3 signaling pathway related proteins in LPS-induced BV2 microglial cells n=3)

3 討論

神經炎癥反應是中樞神經系統的一種免疫應答反應，在缺血性腦卒中、神經退行性疾病中發揮著重要的調節作用。當中樞神經系統發生炎癥反應時，小膠質細胞被迅速激活、發生增殖并遷移至損傷部位，釋放大量炎癥介質及細胞毒素，如IL-6、TNF-α等[4]。促炎介質的過度產生會進一步加重炎癥浸潤和免疫反應，導致神經元損傷。因此，抑制小膠質細胞過度活化所導致的神經炎癥反應，對保護神經元、恢復神經功能具有重要作用。本實驗結果表明，4-羥基芝麻素可明顯抑制LPS誘導的BV2小膠質細胞中IL-6的分泌，以及COX-2蛋白水平的表達。

NLRP3炎癥小體是一種大分子量的胞質蛋白復合體，由NLRP3、ASC和效應蛋白pro-caspase-1組成。缺血性腦卒中發生后，無活性的NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18發生轉錄，實現NLRP3、ASC和pro-caspase-1的組裝，進而催化IL-1β和IL-18的成熟和分泌，促進炎癥反應，加重缺血性腦卒中損傷[5]。p38MAPK信號通路可以通過促進炎癥細胞因子和趨化因子的產生，進而促進NLRP3炎癥小體的激活[6]。實驗結果表明，4-羥基芝麻素可明顯抑制p38蛋白磷酸化，降低NLRP3、caspase-1 p20的蛋白表達，進而減少IL-18、IL-1β的釋放。

綜上可見，4-羥基芝麻素可能通過抑制p38MAPK/NLRP3信號通路，降低促炎性蛋白酶COX-2的表達，抑制炎癥因子IL-6的釋放，進而發揮抑制BV2小膠質細胞神經炎癥反應的作用。