白毛藤多糖通過調控miR-1270/CCNG2通路抑制肺癌細胞增殖、促進細胞凋亡的機制

王婷婷 鄭學香 曾真 李婷婷

(湖北民族大學附屬荊門市第一人民醫院體檢科，湖北 荊門 448000)

肺癌是全球癌癥死亡的最主要原因。近年來，盡管肺癌的早期診斷和靶向治療技術不斷發展，但整體5年生存率仍然很低〔1〕。因此，開發新的有效的肺癌治療方法迫在眉睫。順鉑是治療肺癌的有效藥物，但由于順鉑耐藥性的出現導致肺癌患者預后不良〔2〕。最近，天然化合物的抗腫瘤作用引起了研究者的關注〔3〕。白毛藤為茄科植物白英的全草，具有清熱利濕，祛風解毒之功效。研究發現，白毛藤多糖對乳腺癌〔4〕、胰腺癌〔5〕等惡性腫瘤具有抑制作用，但白毛藤多糖在肺癌中的作用鮮有報道。miR-1270是一種致癌基因，研究發現，miR-1270在膀胱癌等惡性腫瘤中表達上調，干擾其表達可抑制癌細胞的增殖，促進細胞凋亡〔6〕。細胞周期蛋白(CCN)G2是一種抑癌基因，研究發現，CCNG2在結腸癌組織中表達下調，過表達CCNG2抑制結直腸癌細胞的增殖〔7〕。有研究〔8〕報道，桑色素通過調控miR-135b/CCNG2表達抑制肺癌細胞的活力、克隆形成及遷移能力。但白毛藤多糖和miR-1270對肺癌細胞增殖、凋亡的影響及miR-1270和CCNG2的靶向關系，且白毛藤多糖是否通過調控miR-1270/CCNG2通路影響肺癌細胞的增殖和凋亡目前還尚未可知。本研究旨在揭示白毛藤多糖調控miR-1270/CCNG2通路對肺癌細胞增殖和凋亡的影響和機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人肺癌細胞株A549購于美國ATCC；DMEM培養液購于Gibco公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購于Invitrogen公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購于碧云天公司；TRIzol試劑、膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒和Western印跡相關試劑購于北京索萊寶公司；miRNA抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、anti-miR-1270、pcDNA、pcDNA-CCNG2、miR-NC、miR-1270、野生型(WT)-CCNG2和突變型(MUT)-CCNG2構建和測序及PCR引物由北京華大基因公司提供；細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、p21抗體、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl相關X蛋白(Bax)抗體和CCNG2抗體及二抗均購于Abcam公司。

1.2細胞培養和轉染 人肺癌細胞株A549培養于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基液中，置于37℃、含5% CO2、濕度飽和的細胞培養箱中進行培養。將對數生長期的A549細胞按每孔2×105個細胞的密度接種于6孔板，利用LipofectamineTM2000將anti-miR-NC、anti-miR-1270、pcDNA和pcDNA-CCNG2分別轉染A549細胞，培養48 h后檢測轉染效果，隨后進行后續實驗。

1.3實驗分組 A549細胞分組如下：對照組(DMSO處理A549細胞)、白毛藤多糖組(分別用終濃度為0.4、0.8和1.6 mg/ml的白毛藤多糖處理A549細胞48 h)、anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-1270組(轉染anti-miR-1270)、pcDNA組(轉染pcDNA)和pcDNA-CCNG2組(轉染pcDNA-CCNG2)、白毛藤多糖+miR-NC組(轉染miR-NC后用1.6 mg/ml的白毛藤多糖處理48 h)和白毛藤多糖+miR-1270組(轉染miR-1270后用1.6 mg/ml的白毛藤多糖處理48 h)。

1.4MTT實驗 取按照1.3分組進行相應處理的各組對數期細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml，按照每孔100 μl接種于96孔板，培養48 h后，加入20 μl的MTT溶液繼續培養4 h，棄去培養液，加入150 μl的二甲基亞砜，振蕩10 min，當結晶溶解后，用酶標儀測定各孔490 nm波長處的吸光度值(A值)。根據A值計算細胞抑制率(IR)，IR(%)=(對照組A-實驗組A)/(對照組A-空白組A)×100。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 分別收集按照1.3分組處理至規定時間的A549細胞，離心后棄去上清液，用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸A549細胞后，再次離心棄去上清液。用適量的1×結合緩沖液重懸A549細胞，使其濃度約1×105個/ml，每管加入100 μl細胞懸液，加入5 μl的Annexin V-FITC，混勻后，再加入10 μl的PI，室溫避光孵育15 min后，加入400 μl的1×結合緩沖液混勻后，用流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。

1.6qRT-PCR檢測 利用TRIzol試劑分別提取各組A549細胞的總RNA，檢測其濃度和純度。利用逆轉錄酶合成cDNA后，進行qRT-PCR擴增。分別以U6和GAPDH為內源性參照，用2-ΔΔCt法計算miR-1270和CCNG2 mRNA的相對表達量。實驗用引物序列：miR-1270上游引物5′-CTGGAGATATGGAAGAGCTGTGT-3′，下游引物5′-TGCAAAGAGCCACATAGAAGAT-3′，U6上游引物5′-GATTTCTCCCTCATCGCTTACAG-3′，下游引物5′-CTGCTTCATGA-TCGTTGTTGCTTG-3′，CCNG2上游引物5′-CTTTGGGCATTATTAGGA-3′，下游引物5′-GAGGAGGAAACAGTAGCAG-3′，GAPDH上游引物為5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAA-C-3′，下游引物為5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′。

1.7Western印跡檢測 利用RIPA裂解液裂提取各組A549細胞的總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品濃度。按照十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)-轉膜-封閉-Ⅰ抗孵育-Ⅱ抗孵育-電化學發光(ECL)顯色步驟進行，最后利用Image J 軟件對目的條帶灰度值進行分析。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測 利用生物信息軟件預測miR-1270的靶基因。發現miR-1270與CCNG2的3′UTR存在部分連續結合位點，猜測CCNG2是miR-1270的靶基因，并利用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證。構建WT-CCNG2和MUT-CCNG2的CCNG2-3′UTR熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM2000將miR-1270模擬物和miR-NC分別與WT-CCNG2和MUT-CCNG2共轉染A549細胞，培養48 h后，測定各組人胃腺癌細胞(AGS)細胞的熒光素酶活性。

1.9統計學方法 采用SPSS20.0進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與對照組相比，白毛藤多糖組A549細胞的增殖抑制率和細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，隨著白毛藤多糖濃度增加，對A549細胞的增殖抑制和凋亡促進作用顯著增強，各濃度組之間差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

圖1 細胞凋亡流式圖

圖2 白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖、凋亡相關蛋白表達的影響

2.2白毛藤多糖對肺癌A549細胞中miR-1270和CCNG2表達的影響 與對照組相比，白毛藤多糖組A549細胞中miR-1270的表達顯著降低，CCNG2 mRNA和CCNG2蛋白的表達顯著增加(P<0.05)。隨著白毛藤多糖濃度增加，對miR-1270表達的抑制和CCNG2表達的促進作用明顯增強，各濃度組之間差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 CCNG2蛋白表達

表2 白毛藤多糖對肺癌A549細胞中miR-1270和CCNG2表達的影響

2.3miR-1270靶向調控CCNG2的表達 miR-1270的5′端與WT-CCNG2的3′UTR存在部分特異性結合為位點。見圖4。

圖4 CCNG2的3′UTR中含有與miR-1270互補的核苷酸序列

如表3所示，當上調miR-1270表達后，轉染WT-CCNG2的3′UTR的熒光素酶報告基因載體的A549細胞的熒光素酶活性顯著下降(P<0.05)，而轉染MUT-CCNG2的3′UTR的熒光素酶報告基因載體的A549細胞的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。當上調miR-1270表達后，A549細胞CCNG2蛋白的表達顯著降低〔miR-NC組(0.64±0.06)vs miR-1270組(0.25±0.03)，P<0.05〕；當下調miR-1270表達后，A549細胞CCNG2蛋白的表達顯著升高〔anti-miR-NC組(0.63±0.06)vs anti-miR-1270組(0.97±0.09)，P<0.05〕。以上結果表明，CCNG2是miR-1270的靶基因，miR-1270可負性調控CCNG2的表達。見圖5。

表3 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-NC組，miR-1270組，anti-miR-NC組，anti-miR-1270組

2.4抑制miR-1270表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1270組A549細胞miR-1270的表達顯著降低(P<0.05)，表明穩定抑制miR-1270表達的A549細胞株構建成功。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-1270組A549細胞的增殖抑制率和細胞凋亡率顯著增加，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著升高(均P<0.001)，見圖6、表5。表明，抑制miR-1270表達可抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡。

圖6 anti-miR-NC組與anti-miR-1270組增殖凋亡相關蛋白表達

表5 抑制miR-1270表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

2.5CCNG2過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響 與pcDNA組相比，pcDNA-CCNG2組A549細胞CCNG2蛋白的表達顯著升高(P<0.001)，表明過表達CCNG2的A549細胞株構建成功。與pcDNA組相比，pcDNA-CCNG2組A549細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著增加，CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著升高(均P<0.001)，見圖7、表6。表明，CCNG2過表達可抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡。

2.6miR-1270過表達逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用 與對照組比較，白毛藤多糖組A549細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著增加，miR-1270、CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，CCNG2蛋白、p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著升高；與白毛藤多糖+miR-NC比較，白毛藤多糖+miR-1270組A549細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著降低，miR-1270、CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的表達顯著升高，CCNG2蛋白、p21蛋白和Bax蛋白的表達顯著降低(均P<0.001)。表明，過表達miR-1270逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。見表7、圖8。

圖7 CCNG2和增殖、凋亡相關蛋白表達

表6 CCNG2過表達對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

表7 miR-1270過表達逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用

1～4：對照組，白毛藤多糖組，白毛藤多糖+miR-NC組，白毛藤多糖+miR-1270組

3 討 論

肺癌是由癌細胞的增殖失控引起的復雜疾病，癌基因的過度表達和抑癌基因的功能喪失是導致肺癌發生發展的主要原因〔9〕。盡管化療對肺癌等實體瘤具有顯著的臨床活性，但固有和獲得性耐藥的出現大大降低了化療藥物的應用〔10〕。因此，從天然化合物中尋找一種經濟、安全、高效的抗癌藥物是抗癌藥物研發的主要目標。

白毛藤作為我國一種傳統中藥，具有抗炎、抗菌、抗過敏、肝臟保護、增強免疫力和抗腫瘤等多種藥理活性〔11〕。白毛藤參與調控多種惡性腫瘤的發生發展。Lin等〔12〕在研究白毛藤提取物的體外抗癌分子機制時發現，白毛藤提取物可促使骨肉瘤細胞形態學改變，抑制細胞存活，并通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。Liu等〔13〕研究發現白毛藤總皂苷對宮頸癌細胞Hela具有增殖抑制作用，并通過多途徑誘導Hela細胞凋亡。此外，白毛藤提取物還可顯著抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長，促進脾細胞增殖，增強自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T細胞(CTL)活性，改善免疫反應進而表現出抗腫瘤活性〔14〕。本研究中通過體外細胞實驗發現，白毛藤多糖可顯著抑制A549細胞的增殖，促進細胞凋亡。同時，發現白毛藤多糖可顯著抑制A549細胞中miR-1270的表達，促進CCNG2的表達。此外，本實驗結果表明miR-1270可負性調控CCNG2的表達。推測白毛藤多糖通過調控miR-1270/CCNG2通路而發揮作用。

miR-1270是一種保守性較差的miRNA。研究證實，miR-1270可以與干擾素α1和其性質的反義mRNA的相互作用以調節體內穩態〔15〕。此外，miR-1270在惡性腫瘤的發生發展中也起重要作用。Zhong等〔16〕研究發現，miR-1270在骨肉瘤組織和細胞中高表達，通過慢病毒技術干擾miR-1270表達可抑制骨肉瘤細胞的體外增殖和遷移，且miR-1270高表達與診斷時患者的遠處轉移和高級別腫瘤顯著相關。Yi等〔17〕研究表明，miR-1270在甲狀腺癌細胞系和組織中異常上調，miR-1270通過靶向調控SCAI表達促進甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和體內移植。在肺癌中，miR-1270被認為與表觀遺傳調節因子組蛋白去乙酰化酶(HDAC)4相關〔18〕，但關于miR-1270在肺癌中作用機制并未有詳細報道。CCNG2作為一種腫瘤抑制因子，具有調節細胞生長和增殖的作用，其表達量的降低與多種惡性腫瘤類型有關〔19〕。Gao等〔20〕研究發現，胃癌組織中CCNG2表達水平降低，且與腫瘤大小、遷移和分化狀態差有關，過表達CCNG2抑制了腫瘤的生長和轉移。CCNG2在甲狀腺癌組織也呈低表達，過表達CCNG2能夠抑制甲狀腺癌SW579細胞的增殖并促進其凋亡〔21〕。本研究證實抑制miR-1270或過表達CCNG2均可顯著抑制A549細胞的增殖，促進細胞凋亡，過表達miR-1270逆轉了白毛藤多糖對肺癌A549細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，表明在肺癌細胞中，白毛藤多糖通過調控miR-1270/CCNG2通路而發揮抗腫瘤作用。

綜上所述，白毛藤多糖通過調控miR-1270/CCNG2通路可抑制肺癌細胞增殖，促進細胞凋亡。白毛藤多糖是一種有效的肺癌治療藥物，本研究的發現為白毛藤多糖在肺癌臨床治療中的開發應用提供了理論依據。