冠心病并發高血壓患者外周血白細胞SREBP-1 mRNA表達水平與脂質代謝紊亂的關系研究

張訓男，彭春艷，李顯東，張吉才

（1.錦州醫科大學十堰市太和醫院研究生培養基地，湖北醫藥學院附屬醫院，湖北十堰 442000；2.十堰市太和醫院檢驗科，湖北十堰 442000）

冠心病（coronary artery disease，CAD）是影響世界人口的主要心血管疾病之一，也是導致發達國家和發展中國家死亡的主要原因[1]。高血壓是CAD 的重要致病因子[2]，血壓升高可以引起微血管病變，導致冠狀動脈儲備能力下降，引起冠狀動脈病變[3]；也可導致內皮細胞損傷，引發動脈粥樣硬化。脂代謝紊亂，其癥狀表現為血漿三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平的升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平的降低，被認為是CAD 的獨立危險因素，可導致動脈粥樣硬化[4-5]。SREBPs 作為脂質合成轉錄因子，是處于調控脂質代謝核心的一類關鍵基因[6]，大量研究表明固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element binding protein SREBPs）是導致脂質代謝紊亂的重要分子[7]。其中與膽固醇合成和攝取相關的基因，是由SREBP-2 控制的，而SREBP-1 主要調控脂肪生成關鍵酶[8-9]。

在本研究中，我們檢測了CAD 患者SREBPs相對表達水平，以探討其表達水平與冠心病并發高血壓患者發病的相關性，以及與脂代謝紊亂的關系，旨在對CAD 并發高血壓的早期診斷提供理論依據。

1 材料與方法

急性心力衰竭等其他系統嚴重性疾病。最終納入CAD 患者196 例，根據患者血壓和血脂水平，將患者分為CAD 并發高血壓組（共126 例，平均年齡59.68±8.78 歲，其中男性76 例，女性50 例）和單純CAD 組（共70 例，平均年齡57.73±10.27歲，其中男性51 例，女性19 例）。在體檢中心選擇178 例健康體檢者作為對照組，平均年齡57.74±8.48 歲，其中男性106 例，女性72 例。三組研究對象間年齡、性別比較，差異無統計學意義，具有可比性（P> 0.05）。所有研究對象均簽訂知情同意書。使用SYNTAX 網頁（www.syntaxscore.com）對CAD 并發高血壓組126 例患者的造影結果進行評分：低危組0～22 分，中危組23 ～32 分，高危組≥33 分。其中0～22 分為低風險組，共71 例；≥ 33 分為高風險組，共55 例。

1.1 研究對象 選取2017年6月～2018年5月十堰市太和醫院心內科經冠脈造影確診為CAD 的患者為研究對象。診斷標準：高血壓參照2018年修訂版《中國高血壓防治指南》[10]；血脂異常參照2016年修訂版《中國成人血脂異常防治指南》[11]。冠心病患者納入標準：一支及以上主冠狀動脈狹窄> 70%，或左主冠狀動脈狹窄≥50%。排除標準：既往有冠狀動脈搭橋或冠狀動脈支架植入手術史、陳舊性心肌梗死、嚴重心臟瓣膜疾病病史、

1.2 儀器與試劑 TRIZOL 試劑來自美國Invitrogen 公司，HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR 試劑盒和ChamQTM SYBR?qPCR Master Mix 試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。qPCR 引物購自武漢天一輝遠生物科技有限公司。ABI ViiA7實時熒光定量PCR 儀來自美國Life 公司。TC，TG，HDL-C，LDL-C，脂蛋白a[LP（a）]和天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒購自北京九強生物技術股份有限公司；Apo-A1， Apo-B，高敏C-反應蛋白（hs-CRP）和同型半胱氨酸（HCY）采用重慶中元生物技術有限公司試劑盒檢測；肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）和羥丁酸脫氫酶（HBDH）試劑盒購自北京利德曼生化股份有限公司；胱抑素C（Cys-C）和糖化血清蛋白（GSP）采用浙江夸克生物科技有限公司試劑盒檢測。以上生化指標的檢測均采用德國西門子生物醫療電子有限公司ADVIA 2400 全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 生化代謝指標檢測： 所需檢測的血清/血漿樣品凍存于-80 ℃，所有指標的檢測均在十堰市太和醫院中心實驗室通過標準技術進行。

1.3.2 SREBPs 相對表達水平檢測：使用TRIZOL法提取外周血白細胞總RNA，取1 μg 總RNA 經42℃ 2min，50℃ 15min，85℃ 5s 逆轉錄為cDNA，以cDNA 為模板采用SYBR Green I 進行實時熒光定量PCR 反應，PCR 引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，62 ℃ 34 s，72℃ 1 min，40 個循環，采用2－△△Ct進行結果分析及計算。

1.4 統計學分析 采用SPSS17.0 軟件（Chicago，美國）進行數據統計分析。符合正態分布的計量資料采用均值±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK 法檢驗；非正態分布的計量資料采用中位數[四分位數間距]表示，組間比較采用非參數檢驗。分類變量采用卡方檢驗。運用Pearson（符合正態分布的計量資料）或Spearman（非正態分布的計量資料）分析SREBPs 與各生化代謝指標之間的相關性，采用ROC 曲線及曲線下面積反映SREBPs 相對表達水平在CAD 診斷中的準確性（0.7～0.9 表示有一定準確性，0.9 ～1.0 表示準確性較高）。P< 0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組研究對象各生化指標結果比較 見表2。單 純CAD 組TC，HDL-C，LDL-C，Apo-A1 和Apo-B 水平均低于對照組，差異均具有統計學意義（均P< 0.001）；CAD 并發高血壓組LP(a)高于對照組，而TC，HDL-C，LDL-C，Apo-A1 和Apo-B水平均低于對照組，差異均有統計學意義（均P<0.001）。相較于對照組，單純CAD 組及CAD 并發高血壓組hs-CRP 和CK-MB 增高，差異具有統計學意義（均P< 0.001）。

表2 對照組、單純CAD 組和CAD 合并高血壓組間各生化指標結果比較

2.2 SREBPs mRNA 表達水平 見圖1。單純CAD 組SREBP-1 及SREBP-2 mRNA 表達水平與對照組比較，差異無統計學意義（均P> 0.05），而CAD 并發高血壓組SREBP-1 mRNA 表達水平低于對照組及單純CAD 組，差異有統計學意義（均P<0.05）。

圖1 三組SREBPs mRNA 表達水平散點圖

2.3 SREBPs mRNA 表達水平與各生化指標的相關性 見表3。分析所有研究對象的SREBPs 相對表達水平與各生化代謝指標的相關性，結果顯示SREBP-1 與TC，LDL-C，HDL-C，Apo-A1，Apo-B，CysC 和GSP 呈正相關（均P< 0.05），與CK-MB，HBDH，hs-CRP 和HCY 呈負相關（均P< 0.05）。SREBP-2 與AST，LDH，HBDH 呈負相關（均P< 0.05）。

表3 SREBPs 相對表達水平與各生化代謝指標的相關性分析

2.4 對照組及CAD 并發高血壓組SREBP-1 mRNA表達與血壓水平的相關性 見圖2。將對照組及CAD 并發高血壓組SREBP-1 分別與各組的舒張壓及收縮壓做相關性分析，兩組研究對象中SREBP-1與舒張壓及收縮壓均無相關性（均P> 0.05）。

圖2 SREBP-1 與血壓相關性散點圖

2.5 SREBP-1 mRNA 表達水平與CAD 并發高血壓的相關性 見表4。為了探究SREBP-1 mRNA 表達水平與CAD 相關性，在校正了相關混雜因素后進行多因素Logistic 回歸分析。結果所示，SREBP-1是CAD 并發高血壓的獨立風險因素，OR = 0.210，95% CI = 0.079～0.561（P= 0.002），與年齡、性別、糖尿病及高脂血癥無關。

表4 SREBP-1 mRNA 表達水平與CAD 并發高血壓組風險因素分析

2.6 SREBP-1 mRNA 表達水平在CAD 并發高血壓中的診斷價值 見表5。采用ROC 曲線分析低風險組和高風險組的SREBP-1 表達水平，同時將SREBP-1 分別與血脂（TC，TG，HDL，LDL）進行聯合分析。結果顯示SREBP-1 單獨作為預測CAD 并發高血壓嚴重程度的指標時，AUC 面積及敏感度較低，AUC 為0.580(0.503～0.657），敏感度為38.9%（P= 0.045）；聯合TC 時敏感度較高，特異度不高，AUC 為0.600(0.522～0.677），敏感度為86.3%，特異度為33.3%（P= 0.013）；聯合HDL 后敏感度不高，特異度較高，AUC 為0.603(0.527～0.679），敏感度為38.9%，特異度為78.2%（P= 0.010）。

表5 外周血白細胞SREBP-1 mRNA 表達水平用來預測CAD 并發高血壓危險程度的ROC 曲線分析結果

3 討論

CAD 是一種由遺傳、環境等多因素和多機制參與的復雜心血管疾病。動脈粥樣硬化作為一種慢性炎癥性疾病，是CAD 的病理基礎，其發生發展的過程涉及血管壁沉積的脂質、細胞因子、炎癥因子等[12-13]。

脂質代謝紊亂是CAD 發病進程中的重要一環，過剩的脂質沉積在動脈管壁是導致動脈斑塊形成的始動因素。脂質代謝受到一系列轉錄及轉錄后機制的調控。SREBPs 是位于內質網的細胞內膽固醇敏感的脂代謝調節轉錄因子，通過INSIGSREBP-SCAP 途徑對胞內的膽固醇進行反饋調節。主要包含兩個家族成員SREBP-1 和SREBP-2。其中SREBP-1 基因定位于17p11.2，其編碼的轉錄因子SREBP-1 是控制脂肪生成的關鍵因子，可激活其下游效應器乙酰輔酶A（CoA）羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰輔酶A 去飽和酶和甘油3-磷酸酰基轉移酶，調控脂肪酸和三酰甘油的代謝[14-16]。SREBP-2 基因定位于22q13.2，其編碼的轉錄因子SREBP-2 是調節膽固醇代謝的主轉錄因子，對參與膽固醇生物合成的基因具有高選擇性[17-18]，例如羥甲基戊二酰（hydroxymethylglutaryl，HMG）-CoA合酶、HMG-CoA 還原酶、法呢酰焦磷酸合成酶、角鯊烯合成酶和低密度脂蛋白受體。這些轉錄因子增加缺乏脂質的細胞內膽固醇和脂肪酸的合成和攝取[19]。

本研究發現，與健康對照者和單純CAD 患者相比，CAD 并發高血壓患者SREBP-1 表達水平顯著降低。從轉錄水平上來說，SREBP-1 mRNA 可以在胰島素的刺激下激活肝臟X 受體對其的轉錄調控，同時SREBP-1 本身的調控也存在負反饋調控環路，此外,PI3K/SKT/mTORC1 通路可以激活SREBP 的表達，促進其對脂質代謝的調控[20]。作為脂質調控通路特別是脂肪酸和三酰甘油代謝中重要的轉錄因子，下調的SREBP-1 可能與高血壓CAD 患者血漿中增高的TG 水平有關；另外一個重要的原因可能是脂質的堆積阻滯了SREBP-SCAP符合體的轉運和剪切成熟，從而破壞了細胞脂質代謝的穩態；過量的脂質并未有效地激活SREBP 的表達。

高血壓及血脂代謝紊亂是CAD 的獨立風險因素[3]。有證據表明血脂異常和高血壓的發生密切關聯[21]。高血壓患者血壓升高，導致內皮細胞損傷，血小板和單核細胞黏附于血管壁上，內膜表面不平滑，導致更多的血小板和單核細胞黏附聚集在內膜上，這些黏附物釋放生長因子，與炎癥因子及沉積的脂質聯合觸發動脈粥樣斑塊的形成；血壓升高造成微血管病變，進而導致冠脈儲備能力下降，誘發冠脈病變。隨著高血壓患病時間的延長，動脈硬度增加，順應性降低，動脈硬化性心腦血管病的發生率顯著增加[22]。HALPERIN 等[23]報道，與具有最低五分位數（0～20%）的TC，非HDL-C 和TC / HDL-C比例的男性相比，具有最高五分位數（80%～100%）的男性患高血壓風險比例分別增加23%，39%和54%。VALLE 等[24]研究發現重組松弛素Serelaxin可以減輕心肌缺血/再灌注損傷，WANG 等[25]進一步證明Serelaxin 通過下調SREBP-1c 和SREBP-2的表達來減少脂質積累，顯著降低脫氧皮質酮醋酸鹽大鼠的收縮壓。此外，據報道SREBP 裂解激活蛋白（SREBP cleavage-activating protein，SCAP）的遺傳多態性rs12487736 和rs12490383 與超重/肥胖的中國兒童的血壓相關[26]。另有研究證實，纖維母細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）的治療性給藥可能通過抑制SREBP-1 降低飲食誘導的肥胖小鼠血清和肝臟三酰甘油水平并改善脂肪肝。用FGF21 治療4 周后肥胖小鼠的血壓恢復正常，同時改善高血壓大鼠血清脂質譜[27-29]。LEE 等[30]通過致動脈粥樣硬化飲食建立動脈粥樣硬化小鼠模型，使用代謝和脂質組學分析發現小鼠的血清樣本存在代謝紊亂。在致動脈粥樣硬化飲食早期階段（8 周），小鼠心臟中SREBP-1 表達水平升高；在連續喂養至25 周后，SREBP-1 表達呈下降趨勢。以上研究均證明SREBP-1 可能參與高血壓的發病機制。

在本研究中，我們發現SREBP-1 水平的降低是高血壓CAD 的獨立危險因素。在高風險復雜性CAD 患者中，SREBP-1 mRNA 的水平顯著降低。因此我們推測異常的脂質代謝水平可能和高血壓互為致病促進因子。然而在對SREBP-1 mRNA 表達水平與血壓進行關聯性分析后，我們發現兩者并沒有統計學意義上的相關性，這一結果提示高血壓和脂質代謝可能具有復雜的調控關系，在心血管疾病的發生機制中可能構建了調控網絡中重要的一環。此外本研究存在的局限性也可能對血壓和SREBP-1基因表達的關聯產生了影響：樣本量較少；缺乏對于冠心病疾病嚴重程度的分層研究；研究對象使用藥物對于結果潛在的影響。這些內容需在下一步的研究中加以完善。