多發(fā)性骨髓瘤早期實驗診斷相關(guān)新興生物標志物的最新研究進展

徐海燕，陸學東

（中山大學附屬第八醫(yī)院醫(yī)學研究中心，廣東深圳 518000）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是骨髓中漿細胞惡性增殖并伴有單克隆免疫球蛋白分泌為特點的疾病，其發(fā)病率占所有血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%[1]，嚴重危害人群健康。雖然傳統(tǒng)的實驗診斷相關(guān)生物標志物很多，但敏感度和特異度較低，很難對MM 進行早期診斷和早期干預，即使MM治療方法不斷革新，但MM 的生存及預后仍不理想。隨著研究的進展，一些新的生物標志物被證明可預測早期MM 的疾病進展，有利于MM 的早期診斷和后續(xù)的靶點治療。本文就近年來發(fā)現(xiàn)的一些潛在的MM 早期實驗診斷相關(guān)生物標志物進行綜述，為提高MM 的臨床診斷率提供理論基礎(chǔ)。

1 MM 的主要臨床表現(xiàn)

MM 的疾病進展包括了兩個重要的前期階段，即意義不明的單克隆丙種球蛋白病（monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS）和冒煙型多發(fā)性骨髓瘤（smoldering multiple myeloma,SMM）。MGUS 進展為MM 的速度約為每年1%，SMM 是介于MGUS 和MM 之間的惡性臨床前階段，其進展率約為每年10%[2]。MM 惡性漿細胞在骨髓內(nèi)增殖和聚集，疾病晚期時也可見于外周血和其他軟組織器官中[3]。惡性漿細胞會過度分泌κ，λ 輕鏈，以及單克隆免疫球蛋白（monoclonal protein），即M 蛋白。該病的臨床表現(xiàn)主要由M 蛋白、游離輕鏈、惡性漿細胞或惡性漿細胞分泌的細胞因子引起，最終造成終末性的器官損害，如高鈣血癥（hypercalcemia）、腎功能不全（renal insufficiency）、貧血（anemia）以及骨病（bone disease），即典型的CRAB 征[4-5]。MM 的診斷標準就是根據(jù)輕鏈、M蛋白的水平、骨髓中克隆漿細胞的浸潤以及新確認的生物標志物和CRAB 特性而制訂的。用于MM的實驗診斷的傳統(tǒng)生物標志物雖有很多種，但MM的生存率仍然很低，因此，需要鑒定一些更敏感的生物標志物來提高MM 的早期診斷率。

2 骨髓微環(huán)境中的標志蛋白

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞相關(guān)蛋白 骨髓微環(huán)境中骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal stem cells,BMSCs）在MM 進程中起著重要作用，研究顯示，當骨髓瘤細胞與BMSCs 或骨祖細胞共培養(yǎng)時，吻素受體（KISSIR）的表達在這些細胞中均上調(diào)[6]，進而抑制成骨分化。從MM 患者骨髓液中分離得到的BMSCs 進行體外培養(yǎng)，觀察到BMSCs 分泌的白細胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、生長分化因子15 和轉(zhuǎn)化生長因子-β 等骨髓惡性漿細胞增殖有關(guān)因子水平升高，而且還觀察到MM 患者的BMSCs 中分泌型蛋白dickkopf-1，IL-3 和IL-7 等抑制成骨分化相關(guān)的因子表達水平比健康對照組高[7]。此外，有研究表明，與健康對照組相比，MM 患者BMSCs 中產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinases 1,MMP-1），MMP-2 和趨化因子CXCL13 等的表達顯著增加，促進骨髓瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。BMSCs 中這些差異表達的因子促進了MM 及其骨病的進展，這些新的生物標志物有可能用作早期敏感的MM 或骨髓瘤骨病的實驗診斷指標及治療靶點。

2.2 骨髓細胞外基質(zhì)蛋白 細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）由膠原、纖維蛋白原、蛋白多糖和其他參與細胞黏附、遷移和分化的蛋白質(zhì)組成。骨髓ECM 與細胞間的相互作用在骨髓瘤細胞歸巢和增殖分化中起重要作用。有研究觀察到，MGUS 及MM 患者骨髓ECM 中雙糖鏈蛋白多糖Biglycan，纖溶酶原激活物抑制因子1、骨膜素表達水平增多，纖連蛋白fibulin-2，蛋白賴氨酸6-氧化酶及幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1 表達減少，這些差異性表達的ECM 蛋白可促進MM 惡性漿細胞的黏附、侵襲、遷移及增殖[10]。骨髓成纖維細胞表面血小板源性生長因子受體β（platelet-derived growth factor receptorβ,PDGFR-β）也參與腫瘤細胞遷移，有研究報道，PDGFR-β 在MGUS 患者的骨髓成纖維細胞上表達上調(diào)，并且在MM 患者的相應(yīng)細胞中表達水平進一步升高，而在正常者中PDGFR-β 的表達量極低，因此，PDGFR-β 可能作為MM 病程逐漸進展的標志蛋白。Versican 是一種ECM 硫酸軟骨素蛋白聚糖，與多種癌癥的發(fā)病機理有關(guān)，研究顯示，MM 患者骨髓及血清中Versican 表達水平均明顯升高，其水平與血清β2-微球蛋白（β2-microglobulin,β2-MG）和M 帶呈正相關(guān)，而且血清中Versican 的ROC 曲線分析顯示其具有較高的敏感度和特異度，表明Versican 也可能被用作MM潛在的實驗診斷標志物[11]。

2.3 血管生成相關(guān)蛋白 腫瘤的生長都需要有效的血液供應(yīng)，血管生成是MM 進展的一個持續(xù)特征。研究表明，從MGUS，SMM 到新診斷的MM 和復發(fā)性MM，骨髓血管生成程度逐漸增加，而且，骨髓微血管密度增加是MM 患者重要的診斷/預后因素[12]。研究顯示，骨髓惡性漿細胞和內(nèi)皮細胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子等促血管生成因子水平增多，VEGF 的表達量與MM 病情的嚴重程度相關(guān)[13]。微血管內(nèi)皮細胞和骨髓基質(zhì)細胞會響應(yīng)VEGF 刺激而分泌IL-6，IL-6 是骨髓瘤細胞的有效生長因子，反過來又促進骨髓瘤細胞分泌VEGF[14]。此外，血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）可通過增強VEGF 的作用來促進腫瘤血管生成，Ang-1 與之作用相反。有研究表明，與健康人比，新診斷或復發(fā)/難治性MM 患者血清Ang-1/Ang-2 比值下降[15]。另外，MM 患者的血清Ang-2 水平隨著疾病嚴重程度的增加而增加，而且Ang-2 水平與血清β2-MG 水平及骨受累程度呈正相關(guān)，Ang-2 和VEGF 檢測的敏感度和特異度也較高，表明Ang-2，VEGF 可與β2-MG 一起作為MM 診斷或預后的潛在標志物[16]。

3 非編碼RNA

非編碼RNA（non-coding RNA,ncRNA）包括微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA），這些ncRNA 在MM 疾病進程中均起著重要作用。MM 患者外周血清的基因陣列分析發(fā)現(xiàn)三種表達差異較大的miRNA（miR-720，miR-1308 和miR-1246），這三種miRNA 對于區(qū)分健康對照、MGUS 及MM 患者的敏感度和特異度較高[17]。一些miRNA 還與許多常見的MM 實驗室生物標志物顯著相關(guān)。血清miR-214 和miR-135b 的表達水平可反映出骨病變的嚴重程度，能夠區(qū)分有或不伴有骨病的MM 患者，可能成為替代影像學檢查來鑒定MM 相關(guān)骨疾病的有力實驗診斷指標。而且，血清miR-744，miR-130a，let-7d 和let-7e 水平與MM 患者的血紅蛋白水平、血小板計數(shù)呈正相關(guān)，與肌酐、β2-MG 呈負相關(guān)，let-7e 的表達還與M 蛋白水平呈負相關(guān)，這些miRNA 可能成為MM 的早期敏感生物標志物[18-19]。

血清中異常表達的LncRNA 同樣影響著MM的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，MM 患者血清中LncRNA MALAT-1，PDIA3P 表達上調(diào)，可抑制腫瘤細胞死亡或凋亡，促進腫瘤細胞增殖，而且PDIA3P還能增加腫瘤細胞的耐藥性[20-21]。MM 患者血清IncRNA H19 也上調(diào)，臨床病理學分析顯示，IncRNA H19 的表達水平可以作為MM 臨床分期的輔助標志物[22]。MM 的BMSCs 中l(wèi)ncRNA MEG3的表達水平降低，能夠抑制BMSCs 成骨分化，促進MM 的骨質(zhì)破壞[23]。這些lncRNA 表達水平的變化可估計疾病的嚴重程度，有助于MM 的早期診斷。

circRNA 在MM 中的研究較少，但也有研究表明circRNA 在骨髓瘤中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MM 腫瘤細胞中hsa_circ_0007841 及hsa_circ RNA_101237 明顯上調(diào)，促進了MM 的溶骨性病變及腫瘤細胞耐藥性[24-25]。circ0000190 在MM 骨髓組織和外周血中均表達下降，促進了骨髓瘤細胞增殖[26]。這些研究暗示了circRNA 具有作為MM 的新型實驗診斷生物標志物和治療靶標的潛力。

4 循環(huán)腫瘤細胞和循環(huán)腫瘤DNA

外周血中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells,CTCs）或循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）是特征性的腫瘤生物標記。CTCs 是從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤部位脫落進入到循環(huán)中的細胞，因此，它可準確反映疾病狀況[27]。通過多參數(shù)流式細胞儀，可檢測到從MM 患者骨髓進入到外周血的克隆性循環(huán)漿細胞，即骨髓瘤CTCs。研究表明，在新診斷的MM 患者中，400 個以上骨髓瘤CTCs的存在與較高的腫瘤增殖、不良的細胞遺傳學、較低的總體生存率及較高的復發(fā)率相關(guān)[28]。另一項研究表明，超過100 個骨髓瘤CTCs 預示活動性MM復發(fā)患者的生存率較差[29]。此外，SMM 患者中高水平的CTCs 與其2～3年發(fā)展為MM 的風險增高相關(guān)[30]。研究還顯示，MM 患者CTCs 攜帶的突變比例與骨髓克隆漿細胞的突變基本一致，外周血也許能用來確定MM 患者在疾病表現(xiàn)和進展過程中的突變情況[31]。這些數(shù)據(jù)表明CTCs 的實驗室檢測有助于MM 的早期診斷，并預測MM 患者的疾病狀態(tài)和生存率。

ctDNA 是由腫瘤細胞的DNA 片段釋放入循環(huán)系統(tǒng)的胞外DNA，全面反映了腫瘤細胞的遺傳復雜性和異質(zhì)性[32]。研究顯示，MM 患者ctDNA 和骨髓樣本的突變基因是一致的，ctDNA 對骨髓克隆突變和亞克隆突變的敏感度較高，分別為100%和96%[33]。研究還發(fā)現(xiàn)，高水平的ctDNA 與早期疾病復發(fā)相關(guān)，患者總體生存率明顯較差，且ctDNA中TP53 突變比例比骨髓高，可能有助于MM 的早期診斷和預后[34]。與其他蛋白質(zhì)標志物相比，ctDNA 的半衰期不到3 h，這表明它可以反映MM患者的實時腫瘤負擔，也可以在常規(guī)蛋白質(zhì)生物標志物和成像技術(shù)之前檢測到腫瘤動力學的變化，比CTCs 和蛋白生物標志物更敏感和特異[32]。

5 展望

MM 的病理過程復雜，其早期實驗診斷較困難，通過全面研究骨髓微環(huán)境中基因和蛋白質(zhì)表達、外周血中ncRNAs，CTCs 以及ctDNA 等潛在生物標志物的動態(tài)變化，對在早期階段識別和治療MM 患者具有重要意義。此外，外周血中ncRNAs 的檢測，以及在血液活檢中對CTCs 和ctDNA 的檢測，可以幫助臨床醫(yī)生在不進行侵入性骨髓檢查的情況下評估疾病狀態(tài)并早期診斷MM。這些新興的生物標志物已展現(xiàn)出對MM 的診斷和預后潛力，但是上述生物標志物的標準化，仍需要不斷地進行試驗和驗證之后，才能在未來的MM 臨床檢驗中得到應(yīng)用。