急性缺血性腦卒中患者血清miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p和miRNA146a水平表達檢測的診斷價值研究

郭 潔，池水俠

(1.西安醫學院第一附屬醫院急診科，西安710077；2.咸陽市中心醫院，陜西咸陽 712000)

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)是臨床上危害中老年人健康的心腦血管疾病，其具有高致死和致殘率、高患病率和高復發率等特點[1-2]。AIS 主要是由于腦血液供應障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織缺血性壞死或軟化，進而出現相應的神經功能缺損表現。目前AIS 的診斷主要取決于查體、影像學檢測和病史等，但是部分患者影像學表現不典型且費用昂貴、耗時較長。因此，探究miRNA 生物標志物用于AIS 的疾病診斷、病因識別和病情變化預測具有重要的臨床意義[3]。本研究通過比較健康人群和AIS 患者血清miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 的水平，探究三者聯合檢測在AIS 診斷中的應用價值，旨在為AIS的臨床診斷和治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取西安醫學院第一附屬醫院急診科2019年5月～2020年3月收治的65 例AIS 患者為病例組，其中男性36 例、女性29 例；平均年齡51.7±4.2 歲。另選取同期于本院體檢健康者50例為對照組，其中男性29 例、女性21 例；平均年齡53.8±3.4歲。本研究經我院倫理委員會審批通過，受試者自愿參加本研究且均簽署知情同意書。兩組的糖尿病史和高血壓史等一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05）。

納入標準：AIS 患者均符合全國腦血管病學術會議修正的《各類腦血管疾病診斷要點》中AIS 相關的診斷標準[4]，并經MRI 檢查或頭顱CT 驗證。

排除標準：①惡性腫瘤患者；②重要臟器功能異常者；③伴嚴重感染及免疫系統疾病者。

1.2 儀器與試劑 RT-PCR 儀購自德國Qiagen 公司，小型高速冷凍離心機購自德國Eppendorf 公司，RNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒和miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 方法 采集受試者空腹靜脈血3 ml于試管中，5 000 r/min 離心5 min，將血清置于-20℃冰箱中保存。miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a的水平均采用實時災光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR) 進行檢測， 應用RNA 提取試劑盒提取血清中總RNA，應用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA，采用RT-PCR 儀進行測定，反應條件是95℃ 5min；95℃ 30 s；58℃ 30 s 和72℃ 30 s，共40個循環。miRNA-181c-5p 上游引物序列為：5’-ACA CTCCAGCTGGGAACATTCAACCTGTCG-3’，下游引物序列為：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。miRNA-340-5p 上游引物序列為：5’-CTGGTAGGT TATAAAGCAATGA-3’，下游引物序列為：5’-TCAA CTGGTGTCGTGGAG-3’。miRNA146a 上游引物序列為：5’-CAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCATGGGT-3’，下游引物序列為：5’-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3’。

采用美國國立衛生院卒中量表(NIH stroke scale,NIHSS)評價AIS 患者神經功能缺損程度[5]。

1.4 統計學分析 采用SPSS 22.0 統計學軟件分析數據。計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗。相關性分析采用Pearson 相關，采用受試者工作特征曲線(ROC 曲線)計算miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 的AIS 診斷價值，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p和miRNA146a 水平的比較 見表1。比較兩組血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a水平，結果顯示相比于對照組，病例組血清miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平均升高，其差異均有統計學意義(均P=0.000)。

表1 兩組血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平的比較

2.2 血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA 146a 水平與NIHSS 評分的相關性分析 Pearson 相關性分析結果顯示，血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平與NIHSS 評分均呈顯著正相關，其差異具有統計學意義(r=0.272，P＜0.001；r=0.142，P=0.005；r=0.171，P=0.013)。

2.3 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a聯合檢測在AIS 中的診斷價值 miRNA-181c-5p 和miRNA-340-5p，miRNA146a 診斷AIS 的ROC 曲線見圖1，根據ROC 曲線三者聯合檢測診斷AIS的靈敏度和特異度分別為71.2%和76.4%，高于miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a三項指標單獨和兩兩聯合檢測，見表2。

圖1 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p，miRNA146a 診斷AIS 的ROC 曲線

表2 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p，miRNA146a 聯合檢測在AIS 中的診斷價值

3 討論

AIS 是腦卒中的常見類型之一，全球每年約有超過69 萬人患AIS，隨著人們生活質量的提高，我國AIS 的發病率明顯增高。目前臨床上仍未研發出針對AIS 的特效藥物，因此，深入探究生物標志物對AIS 的診斷和治療意義重大。miRNA 是廣泛存在于真核細胞質中的長約18～25 nt 的內源性非編碼單鏈小分子，大量研究指出miRNA 可作為AIS發生的“神經網絡編碼”，是疾病早期診斷、治療和評估預后的新生物學標志物[6]。本研究通過比較兩組血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 的表達水平，探究三者聯合檢測在AIS診斷中的應用價值。

近年來，有研究指出miRNA-181c-5p 可作為阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease,AD)的生物標志物，血清miRNA-181c-5p的缺失可能提示老年腦損傷[7]。miRNA-340-5p 在肺癌中呈高表達，是診斷肺癌較理想的指標[8]。miRNA-146a 是編碼CD40L 的靶基因，而CD40L 是導致AIS 的影響因素[9-10]。本研究結果表明，病例組血清中miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 水平均顯著高于對照組，且與NIHSS 評分呈正相關，由此可證實 miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 可增加AIS 患病風險。ROC 曲線下面積結果顯示，miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 對AIS 患者具有一定的診斷價值，當三者聯合檢測時靈敏度達71.2%，特異度達76.4%，提示miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 聯合診斷具有更高的診斷率，為臨床應用提供更加可靠的理論基礎。

綜上所述，miRNA-181c-5p，miRNA-340-5p 和miRNA146a 三者聯合檢測可進一步提高AIS 患者的診斷率，但關于其與AIS的預后仍需進一步深入研究。