基于核磁共振氫譜篩選隱性梅毒患者血清代謝組學(xué)生物標(biāo)志物的研究

王欣俞，趙晉文，蔡立文，王鑫琪，蔡禮梅

（河北燕達(dá)醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.消化內(nèi)科，河北廊坊 066251）

在我國(guó)傳染病防治體系中將梅毒歸為乙類傳染病種進(jìn)行防治管理。梅毒可通過(guò)性途徑、血液途徑及母嬰途徑等進(jìn)行傳播，是流行病學(xué)關(guān)注的重要傳染病之一，已成為全球范圍內(nèi)關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。梅毒螺旋體（treponemapallidum，Tp）經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的進(jìn)化，高度適應(yīng)人體內(nèi)寄生，隨著Tp 全基因組測(cè)序的完成，Tp 總基因組大小為1.14 Mb，預(yù)測(cè)開放閱讀框架共1 041 個(gè)。Tp 因其公認(rèn)的早期傳播及強(qiáng)大的免疫逃逸能力被稱為“隱形病原體”，梅毒感染機(jī)制十分復(fù)雜，涉及新陳代謝、結(jié)構(gòu)、基因的表達(dá)及調(diào)控等各個(gè)方面[3]。隱性梅毒通常沒(méi)有明顯的臨床癥狀，但仍然具有傳染性，因其疾病的隱蔽性，發(fā)病率增速較快[4-6]。與健康人相比，隱性梅毒患者血液中白細(xì)胞介素-6 的濃度顯著增加，而白細(xì)胞介素-10 的濃度則有顯著降低[7]。梅毒的早期診斷和治療對(duì)改善陽(yáng)性患者的健康至關(guān)重要，如果不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)和治療，會(huì)引起非常嚴(yán)重的并發(fā)癥[8-9]。

隱性梅毒患者對(duì)感染的不知情，是遏制梅毒流行傳播的主要威脅。目前，代謝組學(xué)分析已廣泛應(yīng)用于病原體相關(guān)疾病的研究，有學(xué)者通過(guò)超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法從神經(jīng)梅毒患者腦脊液中鑒定出了D-甘露糖、L-古洛糖-γ-內(nèi)酯、次黃嘌呤和N-乙酰基-L-酪氨酸等特征代謝產(chǎn)物，該發(fā)現(xiàn)可能有助于神經(jīng)梅毒的診斷和治療評(píng)估[10]。代謝組學(xué)研究的兩大主要工具是核磁共振波譜技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）和質(zhì)譜，通過(guò)現(xiàn)代分析技術(shù)手段研究機(jī)體在不同生理病理狀態(tài)下代謝物質(zhì)的種類、數(shù)目變化及相互作用，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面的分析[11]。綜上，本研究采用1H NMR分析技術(shù)對(duì)隱性梅毒患者血清代謝組學(xué)進(jìn)行研究，尋找特征代謝產(chǎn)物，以期為改善隱性梅毒的綜合診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年12月～ 2020年6月在河北燕達(dá)醫(yī)院就診的24 例隱性梅毒患者、24 例健康對(duì)照者血清樣本，獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)20180601。隱性梅毒診斷參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《梅毒診斷WS273-2018》[12]。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①有流行病學(xué)史；②化學(xué)發(fā)光分析法（chemiluminescence analysis，CLIA）陽(yáng)性； ③快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（rapid serum reagin test，RPR）陽(yáng)性；④梅毒螺旋體免疫印跡方法（treponema pallidum western blot test，TP-WB） 確證陽(yáng)性；⑤無(wú)任何梅毒性的臨床表現(xiàn)、無(wú)代謝性疾病的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①CLIA 陰性；③RPR 陰性；③無(wú)代謝性疾病。

將血液樣本進(jìn)行1H NMR 的預(yù)處理，兩組的年齡和性別相匹配，消除年齡、性別差異。

1.2 試劑與儀器 氘水（99.8%，CAS 7789-20-0，美國(guó)Aldrich 公司），無(wú)水磷酸氫二鈉（98%，CAS 7558-79-4，上海康郎生物科技有限公司），1,1,2,2,3,3-六氘-3-三甲基甲硅烷基丙烷-1-磺酸鈉（98%，CAS 2039-96-5，上海吉至生化科技有限公司）；布魯克AVANCE III 500M NMR 光譜儀；NMR 樣品管的直徑為5 mm，帶J Young 閥；梅特勒-托利多ME204E/02 電子天平，可調(diào)移液器（量程為100 ～1 000μl，德國(guó)Eppendorf 公司），計(jì)量檢定合格并在有效期內(nèi)使用；試劑配置及稀釋用水均為二重蒸餾水。

1.3 方法 使用無(wú)添加劑5 ml 真空采血管血液樣本采集，4 ℃條件下，3 000 r/min 離心15 min，取血清轉(zhuǎn)置入凍存管中，于-80 ℃超低溫冰箱保存待用。樣品核磁檢測(cè)預(yù)處理血清樣品中蛋白質(zhì)的過(guò)濾，采用超濾膜Amicon Ultra-0.5 3000 MWCO 過(guò)濾去除。過(guò)濾完成后，將570 μl 樣品放入薄壁5mm NMR 管中，調(diào)節(jié)其pH 值在6.8 ～7.4。樣品標(biāo)準(zhǔn)化處理流程為取血清570 μl，加入氘水70 μl，緩沖液60 μl（緩沖液配置：取7.850 g 無(wú)水磷酸氫二鈉，0.230g 氘水，溶于100ml 去離子水中），最終核磁譜上機(jī)測(cè)試樣體積為700 μl。然后通過(guò)AVANCE III Ascend 500 HD Bruker NMR 光譜儀采集其CPMG壓水峰核磁信號(hào)（譜寬10 kHz，采樣點(diǎn)數(shù)32 000，累加次數(shù)128 次，弛豫延遲時(shí)間3s。自由回波時(shí)間100 ms），以TSP 為化學(xué)移位校準(zhǔn)，化學(xué)內(nèi)標(biāo)濃度500 μmol，核磁頻率500 MHz，上傳譜圖格式ZIP壓縮的 FID 文件( Bruker )，速度模式為快速模式。由貝葉斯核磁信號(hào)在線處理系統(tǒng)對(duì)血清代謝物進(jìn)行鑒定和定量（包括傅立葉變換、化學(xué)位移校正、基線校正等步驟）[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析1H NMR得到樣品中代謝物濃度數(shù)據(jù)集，將48 個(gè)血清樣品的代謝物濃度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為CSV格式上傳到Metaboanalyst 4.0 統(tǒng)計(jì)分析平臺(tái)[13]，通過(guò)生物標(biāo)志物分析模塊（biomarker analysis module）進(jìn)行特征代謝產(chǎn)物受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC） 分析， 應(yīng)用Graphpad Prism 5.0 軟件進(jìn)行組間差異代謝產(chǎn)物分析。符合正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清原始核磁譜圖及其化合物歸屬 見表1、圖1、圖2。通過(guò)貝葉斯核磁信號(hào)在線處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，48 個(gè)血清樣品歸屬得到43 種化合物濃度矩陣。代謝物種類包括枸椽酸、琥珀酸、乳酸、異丁酸、富馬酸和乙酸等有機(jī)酸類，以及甘氨酸、賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸和精氨酸等氨基酸類等。

表1 血清核磁圖譜中歸屬得到的化合物

圖1 所有48 個(gè)血清樣品的原始1H NMR 譜圖

圖2 經(jīng)Bayesil 核磁信號(hào)處理的代表性血清樣本1H NMR 光譜圖（48 個(gè)樣品之一）

2.2 隱性梅毒患者特征代謝產(chǎn)物分析 隱性梅毒患者與健康對(duì)照血清中甲醇及左旋肉堿ROC 曲線分析顯示，兩個(gè)特征代謝物的AUC 分別為0.883 和0.877（見圖3A，3C）。隱性梅毒患者組的左旋肉堿1H NMR 強(qiáng)度平均值為1 069±132，健康對(duì)照組左旋肉堿1H NMR 強(qiáng)度平均值為483±65，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.98，P＜0.001），見圖3B。隱性梅毒患者組的甲醇濃度1H NMR 強(qiáng)度平均值為1 778±315，健康對(duì)照組甲醇濃度1H NMR 強(qiáng)度平均值為279±94，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.56，P＜0.0001），見圖3D。

圖3 基于ROC 曲線分析和T 統(tǒng)計(jì)量的LSP 和SN 組的兩個(gè)特征代謝物

3 討論

近年我國(guó)梅毒流行上升趨勢(shì)已得到有效遏制，但梅毒診治仍存在一些問(wèn)題有待解決，如梅毒螺旋體檢測(cè)不能人工培養(yǎng)，部分方法特異度不高，梅毒的致病機(jī)制仍是臨床研究的難點(diǎn)。梅毒常用的檢測(cè)方法主要分為兩類：一類是病原學(xué)檢測(cè)，另一類是血清學(xué)檢測(cè)。臨床上梅毒的診斷主要依賴血清學(xué)試驗(yàn)，然而，血清學(xué)檢測(cè)的假陰性或生物假陽(yáng)性結(jié)果以及試驗(yàn)方法的局限性可能會(huì)阻礙梅毒的及時(shí)診斷和治療[14-15]。科學(xué)家仍在尋找更敏感和更具體的梅毒診斷標(biāo)志物。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門新興學(xué)科，可對(duì)生物體內(nèi)的所有代謝物特別是小分子代謝物進(jìn)行定性、定量分析[16-18]。NMR 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是對(duì)樣本檢測(cè)無(wú)偏向性，非破壞性，預(yù)處理操作簡(jiǎn)單，具有較高的通量，靈敏度、特異度和分辨率強(qiáng)，成為臨床基礎(chǔ)研究新的熱點(diǎn)，可為生理學(xué)、能力代謝、疾病診斷標(biāo)志物、疾病的干預(yù)等提供大量的信息。1H-NMR 作為代謝組學(xué)研究的重要手段已廣泛應(yīng)用于不同類型疾病差異代謝物的研究[19-21]。

左旋肉堿是一種廣泛存在于生物體的水溶性季銨類化合物，促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸主要參與體內(nèi)能量代謝，特別是脂類代謝。具有促進(jìn)脂肪酸氧化、促進(jìn)支鏈氨基酸代謝及調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)酰基比率等功能[22-24]。先天性甲醇的增加可能在分子水平上解釋視覺障礙的發(fā)展，視覺障礙表現(xiàn)為視網(wǎng)膜梅毒和眼梅毒引起的急性后部多灶性鱗狀色素上皮病[25]。推測(cè)，隱性梅毒患者血清中兩種特征代謝標(biāo)志物可能與其能量代謝變化及視神經(jīng)損傷發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系。此外，關(guān)于神經(jīng)梅毒患者腦脊液代謝分子的研究也發(fā)現(xiàn)系列特征生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)改進(jìn)檢測(cè)診斷及研究患者機(jī)體代謝變化特征和治療評(píng)估具有潛在應(yīng)用價(jià)值[26-27]。本研究ROC 曲線分析表明，隱性梅毒患者組的左旋肉堿和甲醇強(qiáng)度平均值顯著高于健康對(duì)照組（均P＜0.000 1），兩個(gè)特征代謝物的AUC 分別為0.883和0.877。說(shuō)明左旋肉堿和甲醇可作為隱性梅毒患者的潛在生物代謝標(biāo)志物。由于尚未有文獻(xiàn)對(duì)隱性梅毒患者血清代謝物進(jìn)行系統(tǒng)研究，因此，左旋肉堿和甲醇在隱性梅毒中的作用機(jī)制仍然未知。綜上所述，左旋肉堿和甲醇可作為隱性梅毒患者的潛在生物標(biāo)志物，這些發(fā)現(xiàn)可能為隱性梅毒相關(guān)代謝物未來(lái)研究提供重要的信息和思路。本研究的局限性為樣本量較小，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究驗(yàn)證。本研究結(jié)果為梅毒的早期發(fā)現(xiàn)和診治提供了參考，以減少梅毒感染的持續(xù)時(shí)間并防止繼續(xù)傳播。