食管癌患者血清神經元特異性烯醇化酶與長鏈非編碼RNA ITGA9-AS1水平聯合檢測的實驗診斷價值研究

朱 嬌，孫國才，劉素榮，王英英

(1.兵器工業五二一醫院a.腫瘤血液病科;b.老年病科，西安 710065;2.陜西中醫藥大學附屬醫院腫瘤二科，陜西咸陽 712000)

食管癌(esophagus cancer,EC)是我國常見惡性腫瘤之一，其發病較隱匿，患者就診時大多已處于中晚期，致死率高[1-2]。臨床上對EC 患者主要采用手術治療并輔以放療、化療和生物治療，大量研究顯示中晚期EC 患者的生存率較早期明顯降低，因此早期的EC 診療是提高患者預后的關鍵點[3]。近年來有報道指出神經元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)對EC 的診斷具有一定價值和意義[4]，但敏感度不高。目前已有多種與EC 密切相關的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被鑒定出來，其廣泛分布于血清、腦脊液和血漿等體液中[5]。lncRNA ITGA9-AS1 在乳腺癌中低表達且與患者病理特征惡化有關[6]，關于lncRNA ITGA9-AS1 在EC 中的表達及意義尚不明確。本研究通過測定NSE 和血清lncRNA ITGA9-AS1 水平，旨在分析其在EC 中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年5月～～2019年7月兵器工業五二一醫院收治的112 例EC 可疑病變患者為研究對象，其中男性59 例，女性53 例；年齡30～71 歲，平均年齡51.04±8.97 歲。經病理學檢查確診67 例EC 患者為EC 組，45 例食管良性病變為食管良性病變組(食管炎12 例、食管潰瘍27 例和Barrett 食管6 例)。本研究經由我院倫理委員會審批。

納入標準：①研究對象均經胃鏡檢查有黏膜粗糙和食管糜爛等表現，出現吞咽不適、反酸等不適者；②臨床資料完整；③自愿參與本研究且簽署知情同意書。

排除標準：①合并重要臟器功能衰竭者；②并發其他惡性腫瘤和嚴重感染者。

1.2 儀器與試劑 雅培I2000 型電化學發光免疫分析儀，Trizol 試劑購自Invitrogen 公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 擴增試劑盒購自日本ToYoBo 公司，TakaRa Prime-Script RT reagent kit購自大連寶生物工程有限公司，血清RNA 提取試劑盒購自北京天根公司，熒光定量PCR 儀(美國Bio-rad 公司)，lncRNA ITGA9-AS1 及內參引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法 采集兩組晨起空腹肘靜脈血3 ml，12 000 r/min離心10 min 分離血清，-20℃保存。采用電化學發光免疫分析儀和配套試劑盒檢測NSE 水平。

取EC 組織和食管良性病變組織，采用血清RNA 提取試劑盒提取組織中的總RNA，采用Taka-Ra Prime-Script RT reagent kit 將血清總RNA 逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測血清lncRNA ITGA9-AS1和內參基因GAPDH 的水平。lncRNA ITGA9-AS1引物序列為：F:5’-GTTCTGAAAATCACAGTCATC CCTA-3’，R:5’-TGTGCTTCCGTCACCTCTAAATC-3’。GAPDH 引物序列為：F:5’-ATTCCATGGCACCGT CAAGGCTGA-3’，R:5’-TTCTCCATGGTGGTG AAGACGCCA-3’。95℃預變性2 min，95℃ 15s，60℃30s 共40 個循環，用2-ΔΔCt值計算lncRNA ITGA9-AS1 的相對表達量。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0 統計學軟件處理數據，滿足正態性分布及方差齊性的計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用t檢驗，相關性分析采用Pearson 相關分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平的比較 EC 組患者血清NSE（22.71±3.03μg/L vs 2.98±0.22μg/L）和lncRNA ITGA9-AS1（0.88±0.21 vs 0.64±0.14）的表達水平高于食管良性病變組，其差異具有統計學意義（t=13.33，6.41，均P=0.00）。

2.2 EC 患者NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平與病理分期、腫瘤浸潤深度的關系 見表1。III 期EC 患者血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平顯著高于I期和II 期，其差異具有統計學意義(P＜0.01)，另外腫瘤浸潤深度T4 血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1水平顯著高于T1，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。

表1 EC 患者NSE 和lncRNA ITGA9-AS1水平與病理分期、腫瘤浸潤深度的關系

2.3 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 水平與EC 患者病理分期、腫瘤浸潤深度的相關性 Pearson 相關性分析結果顯示，血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 水平與EC 患者病理分期、腫瘤浸潤深度呈顯著正相關(r=0.142，P=0.005；r=0.171，P=0.013)。

2.4 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 聯合檢測對EC 的診斷價值 血清NSE，lncRNA ITGA9-AS1 診斷敏感度均較低（23.9%，53.0%），但均具有較高的特異度（93.7%，90.2%）。聯合檢測在EC 中有較高的敏感度和特異度，分別為82.1%和83.2%。

3 討論

EC 位居世界癌癥死因的第6 位，我國EC 患者的死亡和發病病例約占全球的50%，尤其是醫療衛生相對欠發達的中西部農村高發地區，EC 給當地患者帶來了巨大的經濟負擔和精神壓力[7]。EC 發病隱匿導致就診時患者大多無法治愈，預后較差。流行病學指出發展中國家EC 患者的5年生存率小于5%，NSE 是神經內分泌細胞特有烯醇化酶的同工酶，在小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)中過量表達[8]，其還可用于小兒神經母細胞瘤病情和治療效果的評估[9]。屈雪等[10]指出NSE在EC 患者中的表達高于食管良性病變組，但是單獨檢測其特異度較低。目前已有多種與EC 密切相關的lncRNA 被鑒定出來，其廣泛分布于血清、腦脊液和血漿等體液中[11-12]。lncRNA ITGA9-AS1 在乳腺癌中低表達且與患者病理特征惡化有關，關于lncRNA ITGA9-AS1 在EC 中的表達及意義尚不明確。本研究通過測定血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平，旨在分析其在EC 中的診斷價值。

本研究結果顯示：相較于食管良性病變組，EC組患者血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 過量表達，并且隨著EC的進展，分期愈晚，腫瘤浸潤深度愈深，血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 水平愈高，說明NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 可用于EC 的早期診斷。但敏感度、特異度分析提示，單一標志物檢測敏感度欠佳，無法用于EC 的診斷和病情評估，應用價值有限。當聯合NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 時敏感度和特異度均較高，分別為82.1%和83.2%，說明聯合檢測可有效彌補單項指標檢測敏感度不強的缺點。

綜上所述，血清NSE 和lncRNA ITGA9-AS1 聯合檢測可提高EC早期診斷的敏感度，值得深入研究。