人角膜基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的分離制備及鑒定

劉先寧，汪 耀，潘士印，肖湘華，銀 勇，王亞妮，劉 睿，朱秀萍，趙 明

（西安市第一醫(yī)院，陜西省眼科研究所，陜西省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省眼科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院，西安 710002）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）具有促進(jìn)組織再生加速創(chuàng)面愈合的能力，可通過(guò)調(diào)節(jié)先天及獲得性免疫細(xì)胞的增殖功能抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)， 具有自我更新、多向分化、較低免疫原性。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 不僅廣泛存在于骨髓、胎盤(pán)、羊膜組織中，而且在脂肪組織、臍帶血、外周血、骨骼肌、肝臟、牙齦和牙齒組織、皮膚、乳汁、軟骨、角膜緣基質(zhì)中亦可分離出MSCs[1]。近年來(lái)研究表明，MSCs 可通過(guò)旁分泌產(chǎn)生外泌體，外泌體具有與其來(lái)源的MSCs 相似的促進(jìn)組織修復(fù)、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡、神經(jīng)保護(hù)等特性。外泌體為雙層脂膜結(jié)合的納米囊泡，大小在30～150 nm 之間，含有多種生物活性分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA，microRNA 和DNA 等），是介導(dǎo)細(xì)胞通訊的關(guān)鍵性分泌因子，在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移生物活性分子，在創(chuàng)傷愈合和炎癥轉(zhuǎn)歸等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。本文作者及其項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)在前期分離出人角膜基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞（human corneal stromal mesenchymal stem cells，HCS-MSCs）的基礎(chǔ)上，成功分離制備出HCSMSCs 外泌體，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源 HCS-MSCs來(lái)源于西安市第一醫(yī)院、陜西省眼科研究所分離培養(yǎng)并已鑒定的保存細(xì)胞。

1.2 主要試劑與儀器 MSCs 培養(yǎng)基試劑盒stempro RMSC SFM（ 美國(guó)Invitrogen 公司），0.067mol/L PO4（美國(guó)HyCLone 公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS），15ml 離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國(guó)HyCLone 公司），超速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，OptimaXPN型），納米透射電鏡檢測(cè)儀（美國(guó)FEI 公司，Tecnai G2 Spirit BioTwin 型），Qubit3.0 檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo 公司)，納米粒度顆粒跟蹤分析儀(德國(guó)Particle Metrix 公司)，眼科手術(shù)用刀片、鑷剪等器械（蘇州），RIPA 裂解液（美國(guó)Thermo 公司），鼠抗人CD63，CD81，TSG101 單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(美國(guó)Thermo 公司)，電化學(xué)發(fā)光( electrochemiluminescence，ECL)顯色試劑盒(上海生工生物工程公司)。

1.3 方法

1.3.1 HCS - MSCs 外泌體的分離制備:HCS-MSC培養(yǎng)上清液的制備收集：復(fù)蘇陜西省眼科研究所前期分離培養(yǎng)及鑒定并保存于液氮（-196℃）中的HCS - MSCs[3]（第三代細(xì)胞），采用StemProRMSC SFM 無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第五代細(xì)胞形態(tài)依然具有干性特征（見(jiàn)圖1）。第三至五代細(xì)胞培養(yǎng)48h 后,收集其細(xì)胞培養(yǎng)上清液，進(jìn)行外泌體分離提取。如不能及時(shí)使用，可將細(xì)胞上清液放置-80℃冰箱冷凍保存。

HCS-MSCs 外泌體制備流程（超速離心法）：①將收集后放置于-80℃的培養(yǎng)上清液50ml 取出，25℃水浴解凍，冰上放置；②4℃，2 000×g，離心10 min，取上清；③4℃，10 000×g，離心30 min，取上清；④樣本轉(zhuǎn)移至超高速離心管中，4℃，110 000×g，離心75 min，棄上清；⑤用1ml 1× PBS 重懸沉淀，重懸后用 1×PBS 稀釋?zhuān)?.22μm 濾膜過(guò)濾;⑥樣本轉(zhuǎn)移至超高速離心管，4℃，110 000×g，離心75 min，棄上清；⑦沉淀用相應(yīng)的1ml 1×PBS 重懸，分裝，-80℃保存。

1.3.2 HCS-MSCs 外泌體特異性蛋白標(biāo)志物的檢測(cè) :取上述超速離心法提取的HCS-MSCs 外泌體50μl，加入50μl RIPA 蛋白裂解液，內(nèi)參對(duì)照為SW620 細(xì)胞蛋白裂解液。2 組均在冰上裂解 20 min， 用 Qubit3.0 檢測(cè)儀測(cè)定蛋白濃度。蛋白煮沸變性后，采用10g/dl SDS?PAGE 蛋白分離膠進(jìn)行電泳，每孔上樣30μg 蛋白，分離蛋白后使用300 mA 恒定電流80 min 將其轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，1g/dl PBS/BSA 溶液封閉1 h，加入抗CD63，CD81，TSG101（1∶1 000 稀釋?zhuān)┛贵w，4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 遍，每次10min，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠抗體（1:4000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h，TBST 洗膜2 次，每次10 min，TBS 洗膜10min，加入ECL 發(fā)光液，使用數(shù)碼成像發(fā)光儀曝光檢測(cè)。

1.3.3 HCS-MSCs外泌體納米微粒追蹤檢測(cè)（NTA）:取上述-80℃凍存的外泌體樣本，25℃水浴解凍，冰上放置；取已解凍樣本,用1×PBS 進(jìn)行稀釋?zhuān)?∶4 000），采用納米粒度顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)樣品的粒徑分布及粒子數(shù)目。

1.3.4 納米透射電鏡檢測(cè)（TEM ）HCS-MSCs 外泌體形態(tài):①取外泌體樣本 5μl 滴加在銅網(wǎng)上，室溫孵育 5min；② 孵育結(jié)束后，用吸水紙?jiān)谝粋?cè)吸干多余液體；③向銅網(wǎng)上滴加一滴 2g/dl 的乙酸雙氧鈾，室溫孵育 1min；④孵育結(jié)束后，用吸水紙?jiān)谝粋?cè)吸干多余液體；⑤室溫干燥 20min 左右，可上機(jī)觀察。

2 結(jié)果

2.1 制備外泌體采用的HCS - MSCs 形態(tài)特征 HCS-MSCs 培養(yǎng)至第5 代時(shí)，仍可見(jiàn)呈旋渦樣生長(zhǎng)，梭形，兩頭較細(xì)，中間較粗的纖維樣細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

圖1 培養(yǎng)的第五代人角膜基質(zhì)MSCs 鏡下形態(tài)（×100）

2.2 HCS-MSCs 外泌體特異性蛋白標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果 采用超速離心法獲得的外泌體,進(jìn)行Western blot 檢測(cè)（內(nèi)參對(duì)照為SW620 細(xì)胞蛋白裂解液），結(jié)果顯示，特異性標(biāo)志蛋白CD63，CD81，TSG101 均呈陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖2。

圖2 外泌體特異性標(biāo)志蛋白鑒定結(jié)果

2.3 HCS-MSCs 外泌體納米微粒追蹤檢測(cè)結(jié)果 使用納米粒度顆粒跟蹤分析儀,檢測(cè)提取的HCSMSC 外泌體濃度（換算為原培養(yǎng)上清液中的濃度），其結(jié)果為3.5×1011/ml，粒子直徑為113.3nm。

2.4 HCS- MSCs 外泌體納米透射電鏡檢測(cè)結(jié)果 透射電鏡下，可見(jiàn)提取的外泌體具有典型的圓形、橢圓形囊泡樣杯盤(pán)狀結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖3。

圖3 外泌體透射電鏡下形態(tài)圖（×100 000）

3 討論

外傷、感染、炎癥、免疫等因素可致角膜損傷，嚴(yán)重者可影響視力及外觀甚至致盲。據(jù)統(tǒng)計(jì)資料顯示，角膜病為僅次于白內(nèi)障的第二大致盲性眼病，目前全世界約有6 000 萬(wàn)角膜盲患者，中國(guó)大約有400 多萬(wàn)，感染仍然是我國(guó)角膜盲的主要原因[4]。角膜移植術(shù)是角膜病致盲患者唯一的復(fù)明手段，由于供體角膜材極度匱乏，目前國(guó)內(nèi)每年僅能完成約5000 余例角膜移植手術(shù)。

MSC 具有較強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能，其來(lái)源廣泛，免疫原性低，對(duì)角膜修復(fù)及重建活性生物角膜意義重大[5-7]。近年來(lái)研究表明，MSCs 發(fā)揮治療作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)是其旁分泌的外泌體。已有實(shí)驗(yàn)研究表明， MSCs 外泌體不僅可以促進(jìn)組織傷口修復(fù)、而且還可抑制炎癥和血管的生成。有體外研究顯示，兔角膜基質(zhì)細(xì)胞，在兔脂肪MSC外泌體存在下培養(yǎng)，細(xì)胞凋亡少、增殖多，目前相關(guān)研究主要集中在骨髓、臍帶、脂肪等組織來(lái)源MSCs 外泌體方面[8-10]。關(guān)于人角膜緣基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的研究還罕見(jiàn)報(bào)道[11]。基于不同組織來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞作用的差異性，我們認(rèn)為角膜基質(zhì)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)角膜組織再生及移植后排斥反應(yīng)的治療意義更大。

本研究團(tuán)隊(duì)利用HCS- MSCs 培養(yǎng)上清液成功的分離出外泌體，通過(guò)多項(xiàng)檢測(cè)確認(rèn)其生物學(xué)特性。HCS- MSCs 具有取材方便、再生能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)、利用其無(wú)血清培養(yǎng)上清液采用超速離心法制備的外泌體，含有細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，脂質(zhì)、mRNA 和miRNA，不含細(xì)胞成分，可進(jìn)一步降低制劑的抗原性，由于其納米級(jí)尺寸而更易于穿透生物屏障，更易于生產(chǎn)和儲(chǔ)存。可將其作為一種新的眼病治療策略，用于外傷、感染、炎癥、免疫等因素引起的角膜損傷以及角膜移植術(shù)后修復(fù)、抗炎、抗新生血管等配合治療。HCS- MSCs 外泌體的分離制備和鑒定將為進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。