支氣管哮喘患者血清MicroRNA-145水平表達與肺功能、氣道重塑及Th1/Th2平衡的關系分析

李 穎，任炳臣，韓曉慶，王永紅，趙京梅，李 靜，王海靜，肖 寧，何洪英

（1.邯鄲市中心醫院 呼吸內科一病區， 河北邯鄲 056001;2 邯鄲市第一醫院院前急救，河北邯鄲 056002;3.河北省華北理工大學附屬醫院呼吸內科， 河北唐山 063000）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）的發生機制比較復雜，臨床認為是免疫因素、炎癥介質等相互作用所致的結果，而輔助性T 細胞1/輔助性T 細胞2（helper T cell 1/helper T cell 2，Th1/Th2）失衡與炎癥介質密切相關[1]。Th1 細胞能夠分泌干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）等因子，促使巨噬細胞活化，對機體免疫、炎癥有調節作用，Th2 細胞能夠分泌白介素-4（interleukin-4，IL-4），白介素-13（Interleukin-13，IL-13）等因子，具有促炎作用[2]。通常Th1 和Th2 細胞處于平衡狀態，一旦二者失衡，易引起氣道炎癥疾病，以BA 最常見[3]。氣道重塑在哮喘中呈進行性發展，可加重氣道壁形態異常，致病情進展為重度哮喘，隨著哮喘程度加重，對肺功能的影響也越大[4]。既往對這類患者給予激素治療，但部分病人治療無效[5]，因此臨床需尋求可靠調控因子，明確新的干預靶點。近年來，有學者發現微小核糖核酸-145（micro ribonucleic acid-145，microRNA-145，簡稱miR-145）基因可能參與了肺損害氣道高反應的病變過程，與慢性阻塞性肺疾病有關[6]。而該病和哮喘有諸多相似之處，因此miR-145 可能也參與了哮喘進展過程，但目前哮喘患者miR-145 的表達水平及其在哮喘發生發展中的作用機制尚不清楚，臨床仍需大量研究對此予以論證，鑒于此，本研究擬探討BA 患者血清miR-145 表達水平與肺功能、氣道重塑、Th1/Th2 的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 納入邯鄲市中心醫院2018年7月～2020年7月收治的BA 患者90 例作為BA 組，另選取同期于邯鄲市中心醫院體檢的62 例健康志愿者作為健康組。研究方案獲得邯鄲市中心醫院倫理委員會批準。納入標準：①BA 組：滿足中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組制定的《支氣管哮喘防治指南(2016年版)》中的相關標準[7]，年齡≥18歲；急性發作期病例；初診病例；能配合完成相關檢查；精神狀態、認知功能正常；知情同意。②健康組：性別、年齡等基線資料與BA 組匹配；身體健康狀況良好；能配合完成相關檢查；精神狀態、認知功能正常；知情同意。排除標準：因肺炎、肺間質性疾病等其他因素所致的喘息、咳嗽等癥狀者；自身免疫性疾病者；惡性腫瘤者；入院前三個月內有激素藥物、解痙平喘治療史者；肝、腎、心等臟器嚴重受損者；危重癥者。BA 組男性47 例，女性43 例，年齡23～45 歲，平均年齡33.94±8.75 歲；并發過敏性鼻炎4 例；并發過敏史3 例；體質量指數18～24kg/m2，平均年齡22.15±1.41kg/m2；并發吸煙史16 例；并發飲酒史18 例；并發家族遺傳史15 例。健康組男性34 例，女性28 例，年齡22～48歲，平均年齡31.65±9.02 歲；并發過敏性鼻炎1例；并發過敏史1 例；體質量指數18～24kg/m2，平均22.89±1.64kg/m2；并發吸煙史10 例；并發飲酒史13 例；并發家族遺傳史9 例。兩組基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 主要儀器為高速離心機（山東博科集團，TG-16W），恒溫箱（北京福意電器，FYL-YS-430L）， 熒光PCR 板（Roche 羅氏，4729692001 96 孔板），電泳儀（濟南來寶醫療器械，DYY-6D），紫外分光光度計（上海屹譜儀器制造有限公司，U-T6A）。主要試劑為Trizol 試劑盒（無錫百泰克生物），瓊脂糖（北京中科瑞泰生物）、引物（經上海生物工程設計）。

1.3 方法 受試者在就診或體檢當日，接受相關檢查與指標檢測。血清miR-145：在受試者空腹狀態下，采集肘靜脈血3ml，行離心處理，時間為10min，轉速3 000r/min，分離血清，存放于-70℃環境待測。經實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測，利用Trizol 試劑盒提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度，采用Stem-loop 法行miRNA 逆轉錄合成cDNA，將該反應液經qRT-PCR 法予以檢測，擴增反應條件為95℃預變性10min，95℃變性10s、50℃退火50s、72℃延伸30s，共40 個循環，以U6作為內參引物。引物序列：（1）miR-145：正向引物為5’-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3’，反向引物為5’-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3’；（2）U6：正向引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，引物經上海生物工程設計。待擴增反應完畢，按照每間隔5s 增加1℃的條件，繼續加熱至99℃，建熔解曲線，經2-△△Ct表示血清miR-145 相對表達量。肺功能檢測：利用涵飛醫療（上海）S-980A I 肺功能檢測儀測定1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1），用力肺活量（forced vital capacity，FVC），峰值呼氣流速（peak expiratory flow，PEF），最大呼氣中期流量（maximal mediate expiratory flow 75/25，MMEF75/25）， 并計算FEV1與FVC 的比值，即FEV1/FVC。氣道重塑指標：經德國西門子Sensation 64 高分辨率CT 進行測定，選用薄層技術，層間距、層厚均為1.0mm，掃描電壓、矩陣分別為120MV，512×512，通過骨建法行重塑，受試者均接受深吸氣、深呼氣末屏氣相掃描，各層面取兩個清晰影像行氣道測量，各部位取均值作為最終結果，內容包括氣道總面積（total airway crosssectional area，Ao）、氣道腔面積（area of airway，Ai）、氣道外徑（external diameter，D），氣道內徑（lumen diameter，L），從而計算支氣管管壁厚度與外徑比值（airway wall thickness/External diameter，T/D），氣道壁面積占氣道總截面積百分比（Percentage of wall area，WA%）。T/D=[（D-L）/2]/D，WA%=（Ao-Ai）/Ao×100%。Th1，Th2，T 細胞亞群[T cell subsets1（Tc1），T cell subsets2（Tc2）]及IFN-γ，IL-4 檢測：在受試者空腹下，取4ml 肘靜脈血，分裝于兩管，每管各2ml，一管經美國貝克曼庫爾特CytoFLEX 流式細胞儀檢測外周血Th1，Th2 細胞以及Tc1，Tc2 細胞，另一管行離心處理，2 500 r/min離心15min，離心半徑8cm，取血清存放于低溫冰箱待測，經酶聯免疫吸附試劑盒（上海仁捷生物）測定血清IFN-γ，IL-4 水平。

1.4 統計學分析 使用SPSS23.0 進行研究資料分析。觀測資料中的計量數據，均通過正態性檢驗，以均數±標準差（±s）描述。兩組間的比較，方差齊同為成組t檢驗，方差不齊同為校正t檢驗（統計量為t）。計數資料以例數及率描述。兩組間比較為卡方檢驗或校正卡方檢驗（統計量為χ2）。各指標間的相關分析為Pearson 相關檢驗。統計推斷的檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組血清miR-145 表達水平及肺功能指標比較 見表1。BA 組血清miR-145 表達水平高于健康組，而FEV1，FVC，PEF，MMEF75/25和FEV1/FVC 均低于健康組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 兩組血清miR-145 表達水平及肺功能指標比較（±s）

表1 兩組血清miR-145 表達水平及肺功能指標比較（±s）

項 目BA 組（n=90）健康組（n=62）tP miR-145（2-△△Ct）2.98±0.491.32±0.2527.3800.000 FEV1（L）1.66±0.282.37±0.3114.7040.000 FVC（L）2.65±0.473.38±0.697.7620.000 PEF（L/s）5.34±1.266.45±1.027.2520.000 MMEF75/25（L/s）0.43±0.071.39±0.1256.6960.000 FEV1/FVC（%）62.64±3.9770.12±6.518.0720.000

2.2 兩組氣道重塑指標比較 見表2。BA 組D，Ao，T/D，WA%均顯著高于健康組，差異有統計學意義（均P＜0.05），兩組L，Ai 比較差異無統計學意義（均P＞0.05）。

表2 兩組氣道重塑指標比較（±s）

表2 兩組氣道重塑指標比較（±s）

項 目BA 組（n=90）健康組（n=62）tP L（mm）2.64±0.512.66±0.460.2470.805 D（mm）4.84±0.414.47±0.375.6870.000 Ao（mm2）22.39±5.3514.62±3.6410.6560.000 Ai（mm2）5.43±1.195.01±1.881.5570.123 T/D（%）22.73±0.7120.25±0.6521.8970.000 WA（%）75.75±7.5465.73±6.388.5610.000

2.3 兩組Th1，Th2，Tc1，Tc2 細胞及血清IFN-γ，IL-4 比較 見表3。BA 組Th1，Th1/Th2，Tc1，Tc1/Tc2 和IFN-γ 均低于健康組，而Th2，Tc2 和IL-4較健康組顯著升高，差異有統計學意義（均P＜0.05）。

表3 兩組Th1，Th2，Tc1，Tc2 細胞及血清IFN-γ，IL-4 比較（±s）

表3 兩組Th1，Th2，Tc1，Tc2 細胞及血清IFN-γ，IL-4 比較（±s）

項 目BA 組（n=90）健康組（n=62）tP Th1（%）0.50±0.110.79±0.1513.0040.000 Th2（%）0.84±0.270.58±0.128.0540.000 Th1/Th20.59±0.081.36±0.3119.1240.000 Tc1（%）14.04±1.7630.61±6.5722.7990.000 Tc2（%）10.06±3.253.48±0.4515.8220.000 Tc1/Tc21.40±0.328.79±2.7625.1940.000 IFN-γ（pg/ml）19.97±4.4533.43±5.5216.5980.000 IL-4（ng/ml）18.41±4.897.31±1.5420.1340.000

2.4 BA 患者血清miR-145 表達水平與肺功能、氣道重塑及Th1，Th2，Tc1，Tc2 的相關性 經Pearson 線性相關分析顯示，血清miR-145 表達水平與FEV1，FVC，PEF，MMEF75/25，FEV1/FVC，Th1，Th1/Th2，IFN-γ，Tc1 和Tc1/Tc2 呈負相關（r=-0.612，-0.403，-0.490，-0.534，-0.558，-0.537，-0.619，-0.591，-0.711 和-0.619， 均P＜0.05）， 而其與D，Ao，T/D，WA%，Th2，IL-4 和Tc2 呈正相關（r=0.577，0.556，0.416，0.409，0.542，0.508 和0.624，均P＜0.05），血清miR-145與L，Ai無相關性（r=0.305，0.319，均P＞0.05）。

3 討論

BA 是由肥大細胞、中性粒細胞、T 淋巴細胞等多種細胞因子參與的一種呼吸系統疾病，大部分患者既往有哮喘家族史[8]。研究表明在哮喘發病過程中，CD4+T 細胞發揮了重要作用，其受抗原刺激后，可分化Th1 和Th2 細胞亞群，而Th1 和Th2細胞亞群失衡可能參與了哮喘炎癥的進展過程[9]。近年來，研究發現BA 發病可能與miRNA 表達有關，其可能通過影響炎癥因子釋放參與BA 的病理改變[10]。哮喘患者伴有明顯的氣道病理改變，具體表現為氣道上皮增厚、支氣管腺體肥大、氣道平滑肌細胞增殖等，能引起氣道高反應[11]。研究認為miRNA-145 與氣道高反應性發生有關，但作用機制不明確[12]。鑒于此，臨床可考慮觀察BA 患者血清miR-145 表達水平變化，以便進一步了解病情，提出針對性治療方案。

本結果顯示BA 患者的血清miR-145 表達水平增高。炎癥反應促進了BA 進展，例如IL-4，IL-13 等炎癥介質大量釋放，能通過對B 細胞進行刺激，致抗體免疫球蛋白M 與免疫球蛋白E 生成，加重氣道高反應[13]。miR-145 是高度保守的一種miRNA，小鼠實驗[14]提示其能調控細胞免疫以及炎癥進展，對IL-1，IL-6 等因子有調控作用，表明miR-145 可能通過調控炎癥因子水平參與疾病進展，但該研究發現miR-145 對炎癥反應有抑制作用，與本次結論相悖。該研究主要探討miR-145 與動脈粥樣硬化的關系，與本研究所討論的疾病類型不同，提示miR-145 在不同疾病中的表達與作用存在特異性。孫海霞等[15]發現BA 患者的血清miR-145 表達水平較體檢者增高，與本次結論吻合。本研究還提示BA 患者存在肺損害。肺損害在哮喘中較常見，在哮喘發作過程中有炎癥介質參與，可引起氣道高反應，致黏膜充血、氣道分泌物增加，削弱氣道上皮屏障功能，從而致病菌侵襲肺部，導致肺功能下降，哮喘嚴重程度與肺損害程度、氣道高反應嚴重度密切相關[16]。因此，臨床必須重視對BA 患者進行肺功能檢測。

氣道重塑是BA 患者的常見表現，本次結果提示BA 患者的D，Ao，T/D 和WA%均增高，表明其存在明顯氣道重塑。BA 患者的氣道重塑主要集中于肌層以及外膜氣道壁，可引起形態學、組織學改變，致氣道狹窄，且具有不可逆性，盡早發現、評估氣道重塑，對改善預后有益。D，Ao，T/D 和WA%是評估氣道重塑的常用指標，其中WA%能對氣道重構給予直觀、準確判斷，尤其在判斷氣道狹窄中敏感度高，哮喘程度越重，則WA%值越高，D，Ao 和T/D 對氣道重塑的評估敏感性均較高，能反映氣道反應性程度，氣道反應性越重，則D，Ao和T/D 值越高[17]。本研究還發現BA 患者的Th1/Th2 和Tc1/Tc2 處于失衡狀態。IL-4 是Th2 和Tc2的生成因子，它可促進B 細胞分化、增殖，有效抑制這類細胞的凋亡，還可對嗜酸性粒細胞凋亡進行抑制，致該類細胞數目增多，使炎癥機制啟動，發揮促炎作用[18]。IFN-γ 則是Th1 和Tc1 的生成因子，它對Th2 和Tc2 釋放促炎因子有抑制作用，可抑制炎性浸潤[19]。一旦Th1，Tc1 細胞受抑制，Th2，Tc2 細胞過度活躍，則會導致促炎因子大量釋放，而抑炎介質的釋放減少，促進BA 進展。

血清miR-145 表達水平與FEV1，FVC，PEF，MMEF75/25，FEV1/FVC，Th1，Th1/Th2，IFN-γ，Tc1 和Tc1/Tc2 呈負相關，與D，Ao，T/D，WA%，Th2，IL-4 和Tc2 呈正相關。其中IL-4 過表達能使Th2 細胞直接活化，加重氣道高反應與肺損害，而miR-145 能調控IL-4 的表達，其過表達可致炎癥程度更重，miR-145 過表達可能通過上調IL-4促進BA 患者的肺損害。藍英等[20]研究提示哮喘患兒的Runt 相關轉錄因子3（RUNX3）mRNA 表達水平下降。而另有學者指出，miR-145有促炎作用，Th2 生成的促炎因子能刺激miR-145 表達，且mi-R145 表達能通過靶向調控RUNX3 而調節哮喘病人的Th1/Th2 失衡狀態，在miR-145 表達受到抑制后，則可糾正該失衡現象[21]。由此可見，mi-R145 靶向調節RUNX3 可能是參與哮喘病情進展的重要機制。Tc2 有促炎作用，Tc1 有炎癥抑制作用，而miR-145與Tc2 作用相似，也具有促炎作用，其可能通過共同作用，參與BA 患者病情進展。

綜上所述，BA 患者的血清miR-145 表達水平增高，其過表達對患者肺功能、氣道重塑、Th1/Th2 細胞影響較大，可促進Th1/Th2 失衡，臨床可通過測定血清miR-145 表達進一步了解BA 患者病情。本研究的局限性為選取樣本較少，且未分析不同BA 嚴重程度患者血清miR-145 水平的變化，未來還需增加樣本量，進一步分析BA 嚴重度與miR-145 的關系，更加深入闡述miR-145 對BA 的影響。