骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合Masquelet技術(shù)治療感染性骨缺損的臨床療效觀察

盧承印 王朋濤 張來(lái)福 張海龍 尹利軍 謝艷 王孝輝

臨床上由各種原因引起的感染性骨缺損較為常見(jiàn)，因其治療相當(dāng)困難，給病人家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)，是臨床上需要研究的課題之一［1］。各種治療方法修復(fù)感染性骨缺損時(shí)，均需多次手術(shù)，且此類(lèi)病人軟組織條件往往較差，敏感抗生素缺乏，預(yù)后相對(duì)較差。近年來(lái)，Masquelet技術(shù)治療感染性骨缺損因其操作簡(jiǎn)單，抗感染效果好及二期成骨愈合快，逐漸被臨床醫(yī)師青睞，但在治療過(guò)程中也存在移植骨吸收、骨不連等問(wèn)題［2］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）作為一類(lèi)非造血干細(xì)胞，已有相關(guān)研究表明其可以向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等細(xì)胞分化，具有較強(qiáng)的成骨潛能，是治療骨缺損最為理想的種子細(xì)胞［3-4］?；诖?，我們采用BMSCs結(jié)合Masquelet 技術(shù)治療了30例感染性骨缺損病人，本研究回顧性分析這30例病人的臨床資料，探討應(yīng)用BMSCs結(jié)合Masquelet技術(shù)治療感染性骨缺損的臨床療效。

資料與方法

一、納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①病人年齡為20～65歲；②確診為感染性骨缺損病人；③病人采用BMSCs結(jié)合Masquelet技術(shù)進(jìn)行治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患肢存在神經(jīng)血管損傷或嚴(yán)重短縮畸形；②術(shù)前血尿糞常規(guī)、肝腎功、凝血等檢驗(yàn)結(jié)果異常，或合并有較重的內(nèi)科疾病者；③認(rèn)知障礙或精神病史者；④隨訪資料不完整者。

二、一般資料

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)，2016年6月至2019年1月河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院收治的30例感染性骨缺損病人納入本研究，其中男21 例，女9 例；年齡為20～65 歲，平均34.5 歲。缺損部位：脛骨干18 例，尺、橈骨干6 例，股骨干5 例，肱骨干1 例。骨缺損長(zhǎng)度為3～13 cm，平均7.3 cm。車(chē)禍傷23例，機(jī)器擠壓傷4例，高處墜落傷3 例。24 例存在皮膚缺損或竇道，其中16例在第一階段手術(shù)時(shí)行皮瓣修復(fù)覆蓋創(chuàng)面，其余8例行一期徹底清創(chuàng)，負(fù)壓封閉引流技術(shù)控制感染，待條件許可后行取皮植皮修復(fù)創(chuàng)面。術(shù)前對(duì)傷口分泌物細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果：金黃色葡萄球菌陽(yáng)性20例，陰溝桿菌陽(yáng)性5例，產(chǎn)氣桿菌陽(yáng)性1例，雙重細(xì)菌感染陽(yáng)性2例，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌陽(yáng)性2例。所有病人術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。

三、治療方法

（一）BMSCs制備

所有病人于Masquelet 技術(shù)二期手術(shù)前一天進(jìn)行骨髓血采集和BMSCs 制備，具體方法為：骨髓血采集由醫(yī)生負(fù)責(zé)，通常選取髂前上棘后上方1～2 cm處作為穿刺點(diǎn)，此處骨面較平，容易固定，操作方便、安全。病人取仰臥位，常規(guī)消毒皮膚，戴無(wú)菌手套、鋪消毒洞巾，使用2%利多卡因作局部浸潤(rùn)麻醉直至骨膜，做“品”字形多點(diǎn)麻醉。等待2 min左右，使骨膜得到充分的浸潤(rùn)和麻醉。將骨髓穿刺針固定器固定在適當(dāng)長(zhǎng)度上，當(dāng)穿刺針接觸到骨質(zhì)后則左右旋轉(zhuǎn)，緩緩鉆刺骨質(zhì)，當(dāng)感到阻力消失，且穿刺針已固定在骨內(nèi)時(shí)，表示已進(jìn)入骨髓腔，用50 mL注射器抽吸2～4 mL 肝素鈉（上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司，中國(guó)），來(lái)回抽吸幾次，潤(rùn)濕注射器內(nèi)部，將內(nèi)栓退出1 cm，拔出針芯，接上注射器，用適當(dāng)力度緩慢抽吸，抽吸過(guò)程中，拔出注射器，及時(shí)搖晃混勻，避免骨髓血凝固。抽吸完畢后，插入針芯，輕微轉(zhuǎn)動(dòng)拔出穿刺針，隨后將消毒紗布蓋在針孔上，稍加按壓，用膠布加壓固定，術(shù)后壓迫止血。采集完成后由醫(yī)生交給組織工程實(shí)驗(yàn)人員將血樣轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。采用75%醫(yī)用酒精擦拭注射器外壁后轉(zhuǎn)移至局部百級(jí)的生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）內(nèi)，將注射器內(nèi)的抗凝骨髓血轉(zhuǎn)移至50 mL 無(wú)菌離心管，以600 g 離心15 min，用移液管小心將含BMSCs 的上層清液轉(zhuǎn)移至新的無(wú)菌離心管以200 g 進(jìn)行二次離心，棄去上清后獲得的濃集液置于無(wú)菌注射器中，使用一次性自封包裝袋包裝備用。取0.5 mL 濃集液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，另取0.5 mL 濃集液進(jìn)行單核細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)，單核細(xì)胞數(shù)量即可間接反映BMSCs 數(shù)量，一般以（5～10）×105個(gè)/L 為佳。隨后使用凝血酶凍干粉200 U（湖南一格制藥有限公司，中國(guó)）與1～2 mL 生理鹽水配制成凝血酶溶液，使用5 mL注射器將其吸入注射器內(nèi)，套上專(zhuān)用注射器堵頭，使用一次性自封包裝袋包裝。由制備人員將凝血酶溶液和BMSCs濃集液交給負(fù)責(zé)醫(yī)生。

（二）Masquelet技術(shù)手術(shù)方法

手術(shù)分兩個(gè)階段進(jìn)行。第一階段：徹底清創(chuàng)，清除骨缺損周?chē)仔越M織及死骨，一期或二期皮瓣覆蓋創(chuàng)面，骨缺損區(qū)用抗生素骨水泥（萬(wàn)古霉素）填充缺損及骨折斷端，外固定架或鋼板內(nèi)固定，負(fù)壓引流管充分引流。清創(chuàng)后觀察創(chuàng)面愈合情況，如出現(xiàn)復(fù)發(fā)感染，需再次清除，抗生素骨水泥填充，重復(fù)上述過(guò)程。

第二階段手術(shù)：確定創(chuàng)面無(wú)滲出及竇道等感染征象，且連續(xù)復(fù)查2～3次血常規(guī)，C反應(yīng)蛋白等感染指標(biāo)正常后，進(jìn)行第二階段手術(shù)。根據(jù)病人骨缺損情況去除或保留固定，沿原切口或皮瓣周邊切開(kāi)，顯露形成的誘導(dǎo)膜，在保護(hù)誘導(dǎo)膜完整性前提下將骨水泥小心取出，打通髓腔。將凝血酶溶液與BMSCs濃集液在方盤(pán)內(nèi)混合后靜置3～5 min 即形成凝膠樣BMSCs，在誘導(dǎo)膜腔內(nèi)填充凝膠樣BMSCs 與自體骨或自體骨與人工骨（上海驍博科技發(fā)展有限公司，中國(guó)）的混合物，一般自體骨與人工骨比例要大于3∶1，在骨斷端骨皮質(zhì)周?chē)浞种补呛?，縫合誘導(dǎo)膜，充分引流，沖洗縫合傷口。術(shù)后定期復(fù)查X線片，觀察骨缺損愈合情況，如果復(fù)診時(shí)出現(xiàn)骨折愈合不全或不愈合，則再次取髂骨補(bǔ)充植骨，術(shù)后常規(guī)自體功能康復(fù)。

四、療效評(píng)價(jià)

記錄所有病人骨折愈合時(shí)間及治療過(guò)程中并發(fā)癥發(fā)生情況，并于末次隨訪時(shí)使用Johner-Wruhs 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)骨缺損愈合優(yōu)良率進(jìn)行評(píng)價(jià)。優(yōu)：骨缺損愈合，無(wú)神經(jīng)血管損傷，無(wú)畸形，關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍正常，無(wú)疼痛，能夠恢復(fù)正常工作；良：骨缺損愈合，輕度神經(jīng)血管損傷，輕度畸形，關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍輕度受限，有時(shí)疼痛，正常工作輕度受限；可：骨缺損愈合，中度神經(jīng)血管損傷，肢體畸形，關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍中度受限，經(jīng)常有局部疼痛，正常工作嚴(yán)重受限；差：骨缺損未愈合，嚴(yán)重神經(jīng)血管損傷，肢體嚴(yán)重畸形，關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍嚴(yán)重受限，嚴(yán)重局部疼痛，不能正常工作。

結(jié) 果

所有病人隨訪8～25個(gè)月，平均15.5個(gè)月。其中16 例一期皮瓣均成活。所有病人骨缺損在術(shù)后平均8.3（6～15）個(gè)月獲得臨床和影像學(xué)愈合。1 例術(shù)后感染復(fù)發(fā)，重復(fù)應(yīng)用誘導(dǎo)膜技術(shù)后愈合。1 例術(shù)后12個(gè)月時(shí)復(fù)查顯示骨折愈合不全，再次取髂骨補(bǔ)充植骨后愈合。末次隨訪時(shí)采用Johner-Wruhs評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定：優(yōu)27 例，良2 例，可1 例，優(yōu)良率為96.7%。典型病例見(jiàn)圖1。

圖1 男，32歲，車(chē)禍致左脛骨骨折術(shù)后感染合并骨缺損 a、b：鋼板螺釘固定術(shù)后8個(gè)月脛腓骨正側(cè)位X線片顯示骨折不愈合；c、d：Masquelet技術(shù)一期手術(shù)，抗生素骨水泥填充術(shù)后正側(cè)位X線片；e、f：分離濃縮后果凍樣BMSCs標(biāo)本；g、h：Masquelet技術(shù)二期手術(shù)，骨水泥取出，BMSCs與自體骨混合植骨術(shù)后6個(gè)月復(fù)查顯示骨折愈合良好；i、j：Masquelet技術(shù)二期手術(shù)后12個(gè)月顯示骨折愈合，去除鋼板內(nèi)固定

討 論

2000 年Masquelet 等［5］首次報(bào)道采用誘導(dǎo)膜技術(shù)治療35 例4～25 cm 長(zhǎng)管狀骨骨缺損病人，均取得成功。隨后眾多學(xué)者們開(kāi)始將此技術(shù)應(yīng)用于修復(fù)骨感染、骨腫瘤、創(chuàng)傷等各種原因造成的骨缺損［6-7］。Masquelet技術(shù)操作簡(jiǎn)單、適應(yīng)范圍廣、療效確切，同時(shí)具有較強(qiáng)的抗感染能力［8］。與骨移植技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于不受骨缺損長(zhǎng)度限制，適應(yīng)證更廣泛；與Ilizarov 技術(shù)相比，其優(yōu)勢(shì)在于愈合時(shí)間短、并發(fā)癥少，且病人護(hù)理難度相對(duì)較低；與帶血管蒂骨移植技術(shù)相比，其手術(shù)不需要顯微外科技術(shù)，因此手術(shù)難度相對(duì)較低。隨著臨床應(yīng)用增多，許多學(xué)者支持誘導(dǎo)膜技術(shù)重建骨缺損的臨床效果，但同時(shí)也報(bào)道其存在感染或骨折不愈合的風(fēng)險(xiǎn)［9］。感染或炎癥復(fù)發(fā)常由于創(chuàng)面清創(chuàng)不徹底及圍手術(shù)期管理不當(dāng)所致，本組病例回顧分析發(fā)現(xiàn)術(shù)前根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)的藥敏試驗(yàn)進(jìn)行圍手術(shù)期用藥，待紅細(xì)胞沉降率，C反應(yīng)蛋白等炎性指標(biāo)接近正常是減少術(shù)后感染復(fù)發(fā)的重要環(huán)節(jié)。術(shù)中徹底清創(chuàng)，切除死骨、無(wú)血運(yùn)骨和硬化骨，放置抗生素骨水泥，采用皮瓣等措施解決創(chuàng)面皮膚覆蓋是減少?gòu)?fù)發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。術(shù)后及時(shí)觀察及處理創(chuàng)面，同時(shí)應(yīng)用敏感藥物是防止復(fù)發(fā)的重要保證，一旦復(fù)發(fā)，需重新進(jìn)行上述過(guò)程以確保二期手術(shù)成功。本研究嚴(yán)格采用上述步驟，僅1例復(fù)發(fā)，重復(fù)上述過(guò)程后治療成功。

對(duì)于感染性骨缺損，感染控制后的另一大難題就是骨缺損的愈合，Masquelet技術(shù)的原理是通過(guò)第一階段置入抗生素骨水泥間隔物達(dá)到控制感染的目的，同時(shí)促使其誘導(dǎo)形成纖維膜，利用誘導(dǎo)膜所富含的生物活性物質(zhì)環(huán)境以及適合骨生長(zhǎng)的空間來(lái)促進(jìn)植入骨存活并皮質(zhì)化從而完成骨缺損的修復(fù)［10］。Nau 等［11］在96 只小鼠的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)膜能促進(jìn)新骨形成，并且加速骨礦物質(zhì)密度和骨硬度的進(jìn)展。Yee等［12］也提到誘導(dǎo)膜能夠防止移植物再吸收并促進(jìn)骨質(zhì)向內(nèi)生長(zhǎng)修復(fù)缺損。但Masquelet 技術(shù)也存在骨誘導(dǎo)能力有限，骨質(zhì)塑性相對(duì)較慢的問(wèn)題［13］。如果出現(xiàn)植骨不充分，自體異體骨比例不當(dāng)?shù)?，則容易發(fā)生骨折不愈合的情況。因此，國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家也一直在尋求縮短治療周期的方法，或者增強(qiáng)骨的修復(fù)質(zhì)量，幫助病人早日擺脫疾病的困擾，恢復(fù)工作和生活。隨著人們?cè)诟杉?xì)胞領(lǐng)域研究的不斷深入，BMSCs 逐漸開(kāi)始在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［14］，自體BMSCs能夠在不同的誘導(dǎo)因素下向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有良好的成骨誘導(dǎo)作用［15］。目前有研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等在促進(jìn)BMSCs 成骨分化過(guò)程中具有協(xié)同和誘導(dǎo)作用［16］。而Toth 等［17］通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)研究表明Masquelet技術(shù)中的誘導(dǎo)膜包含各種生長(zhǎng)因子如VEGF，TGF-β和BMP-2。因此，Masquelet 技術(shù)也能夠更好地誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)骨缺損愈合。本研究將BMSCs與Masquelet技術(shù)相結(jié)合，將分離提取的凝膠狀的自體BMSCs與自體骨、人工骨結(jié)合并填充至誘導(dǎo)膜內(nèi)，從而在控制感染的前提下，解決骨缺損這一難題，病人骨缺損在術(shù)后平均8.3（6～15）個(gè)月獲得臨床和影像學(xué)愈合。

筆者認(rèn)為BMSCs 結(jié)合Masquelet 技術(shù)治療感染性骨缺損具有以下優(yōu)勢(shì)：①M(fèi)asquelet技術(shù)一期手術(shù)能夠?qū)Ω腥具M(jìn)行有效控制，形成的誘導(dǎo)膜又能夠在二期手術(shù)植骨時(shí)誘導(dǎo)BMSCs 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)骨缺損愈合；②自體BMSCs 取材方便，來(lái)源廣泛，同時(shí)不存在排異反應(yīng)和倫理問(wèn)題；③基于BMSCs 的成骨能力，二期植骨時(shí)能夠一定程度上彌補(bǔ)人工骨誘導(dǎo)骨生成能力有限以及自體骨來(lái)源不足的問(wèn)題，促進(jìn)骨缺損修復(fù)。

本研究存在以下局限性：①由于老年人體內(nèi)BMSCs 活力及分化成骨細(xì)胞能力相對(duì)較差，因此本次研究未納入年齡超過(guò)65歲以上病人；②BMSCs技術(shù)經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)較高，對(duì)于經(jīng)濟(jì)狀況一般的病人可能無(wú)法接受；③本次研究納入病例數(shù)量有限，且因骨缺損部位不同，設(shè)置單純Masquelet技術(shù)對(duì)照組無(wú)法做到基線資料可比，因此對(duì)于BMSCs能否促進(jìn)Masquelet 技術(shù)治療的骨缺損愈合，無(wú)法得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)，未來(lái)隨著樣本數(shù)量的提升，我們也將對(duì)兩種方法的療效進(jìn)行對(duì)照比較，以得出更具臨床意義的研究結(jié)果；④對(duì)于骨髓血采集量的問(wèn)題，目前臨床上尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，BMSCs 的濃度對(duì)療效產(chǎn)生的影響仍有待進(jìn)一步研究；⑤BMSCs 的提取、鑒定以及保存等方面對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，基層醫(yī)院開(kāi)展該技術(shù)受到一定程度的限制。

在治療過(guò)程中，有以下事項(xiàng)需要注意：①實(shí)驗(yàn)室提供的生物活性濃集物終產(chǎn)品是無(wú)菌的，但是其外包裝不能保證運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程的無(wú)菌，因此不能直接將外包裝放在無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上，需要護(hù)士協(xié)助醫(yī)生打開(kāi)離心管，醫(yī)生若接觸上述外包裝表面后，需要更換新手套后，方可繼續(xù)手術(shù)操作。②由于此方法病人需進(jìn)行包括骨髓血采集在內(nèi)的多次手術(shù)治療，病人再次感染的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此在整個(gè)治療過(guò)程中都需要特別注意；③Masquelet 技術(shù)二期手術(shù)時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇合適的固定方式，包括髓內(nèi)針、鋼板內(nèi)固定等，如骨缺損較大或骨折不穩(wěn)定者，建議選擇外固定架進(jìn)行固定。

綜上所述，我們認(rèn)為，采用BMSCs 結(jié)合Masquelet誘導(dǎo)膜技術(shù)治療感染性骨缺損效果良好，是一種可行的治療方法。