盆底肌損傷后修復過程中囊泡轉運相關基因的表達

陳 玨,洪 莉,李素廷,王 治,陳 茂,郝夢磊,肖 雅,閔 潔,胡 鳴

（武漢大學人民醫院婦產科，湖北 武漢 430060）

壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是指在咳嗽、打噴嚏、大笑、跑步或舉重等身體運動或活動時，腹內壓增加使膀胱的壓力迅速升高而導致不自主的尿液溢出。我國女性SUI 的總體發病率約占18.9%，且發病率隨著人口的老齡化而不斷攀升［1］。盆底肌是以肛提肌為主要成分的盆底組織支持結構，以骨骼肌為主要組成［2］。衰老、妊娠和陰道分娩等因素可造成盆底肌收縮力下降或結構性損傷，盆底支持結構無法對抗腹腔壓力，最終導致SUI 和盆底器官脫出［1］。經陰道分娩的產婦中有10%～30% 存在明顯的肛提肌撕裂，其損傷可能是造成產后SUI 發生的主要因素［3］。

肌肉損傷后主要通過肌衛星細胞的激活，在生肌調節因子的調節和規范下［4］，增殖并分化為新的肌纖維或與受損肌纖維融合，以促進損傷后骨骼肌的修復，其中涉及著復雜的信號調控網絡［5］。內質網-高爾基體之間存在著蛋白囊泡的轉運［6］，分泌性囊泡裝載著多種與肌肉修復相關的細胞因子和miRNA［7］，通過促進肌肉和血管生成，從而參與到肌肉功能調節和損傷修復過程［8］。現有研究主要關注促進骨骼肌損傷修復的細胞因子［9-10］及其作用機制［11-12］，在囊泡轉運過程中起作用的因素鮮有報道，因此探討肌肉修復過程中調節囊泡轉運的相關因素，有望為肌肉損傷后再生修復的治療提供新的靶點。

基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）是一種高通量數據表達數據庫，收錄并整理了全球研究者所上傳的微陣列芯片、二代測序及其他形式的高通量基因組數據［13-14］。本研究首先收集GEO 數據庫中與肌肉損傷相關的數據集，通過GEO2R 分析篩選共同上調的差異表達基因，并確認在肌肉損傷后的不同進程中囊泡轉運相關基因的表達情況。通過經典的陰道擴張模擬產傷法構建小鼠盆底肌損傷模型［15］，采用實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法對損傷后不同時間點的盆底肌中相關囊泡轉運基因的表達進行分析，尋找在盆底肌損傷修復過程中可能調節囊泡轉運的相關分子，以期為SUI 的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組選取SPF 級健康12 周齡的C57BL/6 雌性處鼠32 只，動物生產許可證號：SCXK（遼）2020-0001，體質量18～23 g，平均體質量（20.26±1.04）g。雌性處鼠隨機抽取8 只作為對照組，剩余小鼠通過陰道擴張+遠端牽引法構建盆底肌損傷模型［15-16］，將24 只造模成功雌鼠隨機分為3 組，每組8 只，根據損傷與否及損傷后的時間分為造模1 d 組、造模3 d 組和造模5 d 組。所有小鼠均購于武漢大學人民醫院實驗動物中心，本研究符合動物保護、動物福利和倫理原則以及國家實驗動物倫理福利的相關規定，且已獲得武漢大學人民醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑，Code No.9108，寶日醫生物技術有限公司），HifairTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus，11123ES）和HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix（Low Rox Plus，11202ES）（上海翊圣生物科技有限公司）。NanoDrop ?分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司），RT-qPCR 儀（美國Appllend Biosystems 公司），6-Fr 導尿管（大連庫利艾特醫療制品有限公司），30 g 鋼制砝碼（上海眾淵公司）。

1.3 肌肉損傷數據集查找和篩選以“muscle regeneration”為關鍵詞在GEO 中搜索與肌肉再生修復相關的數據集，選取 GSE5413［17］、GSE45577［18］和GSE469［19-20］3 個數據集，采用GEO2R 以及R 語言分子包進行數據處理分析，篩選出3 個基因集里共同上調的差異表達基因，通過文獻檢索綜合篩選出與細胞內囊泡轉運相關的基因。

1.4 小鼠盆底肌損傷模型的構建采用1.5%異氟烷對小鼠進行氣體麻醉后取仰臥位固定，使用外科消毒潤滑劑潤滑避免陰道裂傷，有序地插入和取出陰道擴張器。使用校正6Fr 弗利導尿管，將導尿管尖端部分剪除，確保尖端球囊密閉性良好，將其潤滑插入陰道，用5/0 絲線收縮陰道周圍皮膚將導尿管固定好。導尿管球囊內注入生理鹽水0.3 mL，直徑約為8 mm，相當于新出生小鼠腦部直徑。導尿管末端連接一固定于實驗臺邊緣的定滑輪，滑輪另一端懸掛30 g 鋼制砝碼，1 h 后撤掉牽引，球囊放水并拔除。對照組小鼠僅將尿管置于陰道中，不進行導尿管球囊注水擴張及牽引，放置1 h 后拔出［15-16］。

1.5 小鼠盆底肌取材將各組小鼠眼球放血，斷頸法處死后用眼科剪和鑷子打開盆腔，分離內臟和脂肪組織，暴露恥骨聯合并從中間剪斷，依次輕輕減去雙側恥骨聯合前段和陰道壁，暴露肛提肌組織。用手術刀沿盆壁及脊柱剝離肛提肌組織，留取直腸末端作為標記。獲取盆底肌組織后立即裝入潔凈干燥的凍存管內，置于液氮罐中保存。

1.6 RT-qPCR 法檢測各組小鼠盆底肌組織中目標基因表達水平使用RNAiso Plus 提取盆底肌組織的總RNA，并通過NanoDrop?分光光度計測定RNA 濃度和純度。使 用HifairTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for RT-qPCR 將來自總RNA 的樣品RNA 逆轉為cDNA。使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix（Low Rox Plus）進行RT-qPCR。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，重復40 個循環；熔解曲線：95 ℃維持15 s，60 ℃維持60 s，95 ℃維持15 s。引物序列如表1 所示。以GAPDH作為參考基因，采用2－ΔΔCt法計算每個基因的表達水平，實驗重復3 次。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.7 數據處理使用GEO 數據庫自帶的GEO2R在線分析工具處理基因表達數據集，分析并篩選出差異表達基因，篩選標準為P＜0.05 且倍數變化（fold change，FC）對數值的絕對值|log（FC）|＞2。使用R 軟件分析差異表達基因，可視化為熱圖。使用FunRich 軟件生成韋恩圖，篩選出3 個數據集共差異表達的基因，進行下一步分析。

1.8 統計學分析采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統計學分析。各組小鼠盆底肌組織中目標基因表達水平以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異基因分析和篩選以“muscle regeneration”為關鍵詞搜索與肌肉再生修復相關的GEO 數據集，選取GSE5413、GSE45577 和GSE469 3 個數據集，以損傷后第3 天數據與對照組進行比對，采用GEO2R 分析差異表達基因，使用R軟件ggplot2程序包使差異表達基因可視化，生成火山圖（圖1A），使用FunRich 軟件生成韋恩圖，結果顯示3 個數據集共差異表達基因有614 個。見圖1B。

圖1 GSE5413、GSE45577 和GSE469 3 個數據集火山圖（A）和在肌肉損傷時共同高表達基因的韋恩圖（B）Fig.1 Volcano diagram（A）of three data sets of GSE5413,GSE45577 and GSE469 and Venn diagram of common highexpression genes during muscle injury（B）

2.2 囊泡轉運相關基因篩選及表達變化分析通過文獻檢索，從共差異表達基因中篩選出與囊泡轉運相關的 10 個基因：ArfGAP3、LGALS3、KDELR3、CSF1R、ANXA4、STMN1、THBS2、PLXNB2、KIF20A 和EMR1 基因。提取3 個數據集中10 個基因在肌肉損傷后不同時間點的表達水平。GSE5413 數據集為偏心收縮或冷凍引起的損傷后7 d 內，分別在6 h、1 d、3 d 和7 d 時的RNAseq數據，結果顯示：在偏心收縮損傷后，ARFGAP3、LGALS3、STMN1、KIF20A 和EMR1 基因表達增加，KDELR3、CSF1R、ANXA4、THBS2 和PLXNB2 基因表達水平呈降低趨勢（圖2A）。GSE45577 數據集結果顯示：在甘油或心臟毒素環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）注射損傷3、7、14 和21 d 后，脛骨前肌中CSF1R、THBS2、PLXNB2、KIF20A 和EMR1 基因表達水平升高，ArfGAP3 和ANXA4 表達水平先降低后升高，KDELR3 和STMN1 基因在損傷后表達水平降低（圖2B）。GSE469 數據集展示了分別在向腓腸肌注射CTX 誘導肌肉再生，注射后的27 個時間點（0～40 d）時，腓腸肌中上述基因的表達情況。ARFGAP3、LGALS3、KDELR3、THBS2、KIF20A 和EMR1 基因在肌肉損傷后表達水平升高，CSF1R、ANXA4、STMN1 和PLXNB2 基 因在損傷后表達水平降低（圖2C）。

圖2 GSE5413、GSE45577 和GSE469 數據集中基因表達情況Fig.2 Gene expressions in GSE5413,GSE45577 and GSE469 data sets

2.3 盆底肌損傷后囊泡轉運相關基因的表達RT-qPCR 法檢測與囊泡轉運相關的10 個基因（ARFGAP3、LGALS3、KDELR3、CSF1R、ANXA4、STMN1、THBS2、PLXNB2、KIF20A和EMR1），在盆底肌損傷模型小鼠中第0、1、3 和5 天時的表達情況。

RT-qPCR 法檢測結果顯示：在小鼠盆底肌損傷后 mRNA 表達水平升高的有ARFGAP3、STMN1、THBS2 和 PLXNB2 基 因。其 中ARFGAP3 mRNA 表達水平在損傷后第1 天增加1.687 倍（P＜0.05），第3 天增加2.493 倍（P＜0.01）。STMN1 mRNA 表達水平在損傷后第1 天升高0.295 倍（P＜0.05）；THBS2 mRNA 表達水平在損傷后第1 天升高1.565 倍（P＜0.01）；PLXNB2 mRNA 表達水平在損傷后第3 天升高1.124 倍（P＜0.01）。

在小鼠盆底肌損傷后mRNA 表達水平降低的有CSF1R、ANXA4 和EMR1 基因。其中CSF1R mRNA 表達水平在損傷后第1 天降低0.467 倍（P＜0.01），第3 天降低0.276 倍（P＜0.05）；ANAX4 基因mRNA 表達水平在損傷后第3 天降低0.228 倍（P＜0.05），第5 天降低0.224 倍（P＜0.05）；EMR1 基 因mRNA 表達水平在損傷后第1 天降低0.208 倍（P＜0.05）。

LGARLS3、KDELR3 和KIF20A mRNA 表 達水平在小鼠盆底肌損傷后與損傷前比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 小鼠盆底肌損傷模型中損傷第0、1、3 和5 天時ARFGAP3、LGARLS3、KDELR3、CSF1R、ANXA4、STMN1、THBS2、PLXNB2、KIF20A 和EMR1 基因mRNA 表達水平Fig.3 Expression levels of ARFGAP3,LGARLS3,KDELR3,CSF1R,ANXA4,STMN1,THBS2,PLXNB2,KIF20A and EMR1 gene mRNA in mouse pelvic floor muscle injury models at 0,1,3,and 5 d of injury

3 討論

SUI 被喻為一種看不見的“社交癌”，發病時私密性高，患者常羞于啟齒或求助無門，對患者的生活、人際關系和心理健康都產生了巨大的負面影響。SUI 的發病率較高，且病情隨著年齡的增長而加重。隨著科學技術水平的提高，我國人口平均壽命延長，人們對于生活品質的追求也逐步提升。關于SUI 的發病機制及干預靶點研究將對SUI 的治療具有重要的指導意義。

盆底肌肉損傷是造成SUI 的重要因素之一，臨床研究［21］顯示：衰老、慢性便秘、妊娠和陰道分娩導致盆底肌肉急、慢性損傷，使盆底肌收縮功能下降。SUI 患者盆底肌也呈現出病理性萎縮的改變，如肌肉橫切面肌減小、肌絲缺損、排列紊亂，大量纖維碎片累積以及炎癥細胞浸潤等特征［22］，表明盆底肌損傷與SUI 的發生密切相關。臨床研究［23］表明：陰道分娩導致盆底肌損傷是尿道生殖膈擴張最重要的因素，通過產前和產后的會陰超聲隨訪檢測，發現產后6 周～6 個月盆底肌裂孔面積減小，提示盆底肌損傷后具有一定的再生修復能力。

GEO 中整理了高通量基因組數據［13-14］，以“muscle regeneration”為關鍵詞搜索，查詢出3 個在肌肉損傷后不同時間進程的差異化表達基因及基因集（GSE5413、GSE469 和GSE45577）。通過分析發現在肌肉損傷后的再生修復過程中，3 個基因集共有614 個共差異表達基因。囊泡轉運可調節多種肌細胞因子的分泌，從而參與到肌肉功能調節或損傷修復過程。GEO2R 分析篩選出在3 個基因集中共同高表達或與細胞內囊泡轉運相關的10 個基因。對上述基因進一步研究，結合在小鼠盆底肌損傷的動物模型中的RT-qPCR 法驗證結果，發現在盆底肌損傷后的基因差異表達可以找出盆底肌損傷修復再生過程中的靶點。

本研究通過小鼠盆底肌損傷模型研究結果顯示：在盆底肌損傷修復的過程中mRNA 表達水平升高的有 ARFGAP3、STMN1、THBS2 和PLXNB2 基 因，其 中 ARFGAP3、THBS2 和PLXNB2 mRNA 表達水平升高趨勢較明顯；在盆底肌損傷后CSF1R、ANXA4 和EMR1 mRNA 表達水平降低，其中CSF1R mRNA 表達水平降低差異有統計學意義。在盆底肌損傷修復期間，各種分泌性細胞因子可通過促進血管形成，調控炎癥反應，抑制細胞凋亡，招募內源性干細胞，從而保護受損骨骼肌細胞，促進骨骼肌功能和形態的恢復［24］。上述在盆底肌損傷后具有表達差異的基因，可能通過調控細胞高爾基體運輸分泌性細胞因子，從而介導細胞信號傳遞。后續對于上述差異化表達基因和信號分子關系的研究，將有助于揭示盆底肌再生修復的調節機制。

本研究基于SUI 的研究現狀，利用公共數據庫挖掘出肌肉損傷修復過程中的差異化表達基因，并構建小鼠盆底肌損傷模型，驗證在盆底肌損傷后修復過程中上述差異基因的表達情況，對后續的研究啟發思路具有重要意義。然而針對盆底肌損傷后第0、1、3 和5 天時間點進行基因表達的分析，僅初步發現具有表達差異的基因，后續對于驗證層面的豐富以及探索差異化表達基因在盆底肌修復過程中的調控作用，仍存在很大的研究空間。盆底肌損傷修復的復雜調控機制有待進一步探索和發現。