茶樹WRKY轉錄因子CsWRKY17的克隆與表達分析

劉苗苗，臧連生，孫曉玲，周忠實，葉萌*

茶樹WRKY轉錄因子的克隆與表達分析

劉苗苗1,2，臧連生1，孫曉玲2，周忠實3*，葉萌2*

1. 吉林農業大學生物防治研究所，吉林 長春 130118；2. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3. 中國農業科學院植物保護研究所，北京 100094

WRKY轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一，在調節植物的抗蟲防御反應中發揮關鍵作用。然而，目前抗蟲相關WRKY轉錄因子的研究還主要集中于草本植物中，木本植物中的研究還十分滯后，仍有大量WRKY未被發掘與鑒定。以茶樹龍井43為試驗材料，克隆了1個WRKY轉錄因子基因，命名為。研究發現，全長序列為1?141?bp，包含1個987?bp的開放閱讀框，編碼328個氨基酸。結構域分析表明，基因具有1個典型的WRKY結構域和1個C2H2型鋅指結構，屬于第Ⅱ亞家族。同源比對及系統發育樹分析發現，CsWRKY17與擬南芥的AtWKRY11和AtWRKY17同源關系最近。此外，具有明顯的組織表達特異性，并可被機械損傷、茶尺蠖取食或模擬取食、茉莉酸（JA）等外用激素處理誘導表達。亞細胞定位試驗證實定位在細胞核中。綜上結果表明，在細胞核中發揮功能，并很可能通過調節JA、脫落酸（ABA）、油菜素內酯（BR）和赤霉素（GA）等信號通路來調控茶樹對植食性昆蟲的誘導防御反應。研究結果為深入解析WRKY轉錄因子在茶樹蟲害相關信號通路中的作用打下基礎，同時為茶樹抗蟲基因挖掘和抗蟲品種選育提供了理論依據和參考。

茶樹；WRKY轉錄因子；；表達分析；抗蟲防御

植物在遭受植食性昆蟲為害時，會迅速啟動防御相關的信號通路，誘導抗性相關基因的表達，進而合成與防御相關的化合物以抵御蟲害[1-4]。其中，轉錄因子（Transcription factors，TFs）在植物的抗蟲防御信號調控中起著十分關鍵的作用[2,5-8]。轉錄因子又稱為反式作用因子，是一類能夠通過與靶基因（如抗蟲化合物合成酶基因）啟動子區域的順式作用元件相結合，調控靶基因轉錄的DNA結合蛋白[9-10]。植物中含有很多轉錄調控因子家族，其中一些超家族擁有上百個成員基因，如MYB、WRKY、AP2/ERF、bHLH、bZIP、C2H2和NAC家族等[6,11-14]。WRKY TFs是植物中最大的轉錄因子家族之一，目前已在擬南芥（）中發現了超過70個WRKY成員，水稻（）中也發現了100多個WRKY成員[15-17]。

研究表明，WRKY TFs家族成員均含有一段約60個氨基酸組成的WRKY結構域，N末端含有WRKYGQK核心序列，具有高度保守性，其家族命名即來源于此；C端通常為C2H2或C2HC型鋅指結構，主要介導WRKY TFs與目的DNA序列的特異性結合[16,18]。根據WRKY結構域的數量和鋅指結構的類型，WRKY家族又被分為3個亞家族：第Ⅰ亞家族包含2個保守WRKY結構域和1個C2H2（Cx4-5Cx22-23HxH）型鋅指結構；第Ⅱ亞家族包含1個WRKY結構域和1個C2H2型鋅指結構；第Ⅲ亞家族則包含1個WRKY結構域和1個C2HC（Cx7Cx23HxC）型鋅指結構[17-18]。有報道表明，WRKY不僅可以結合目的基因啟動子中的W-box（TTGACC/T）直接激活或者抑制防御信號通路相關基因的表達，還可以與其他WRKY相互作用來間接調節植物的免疫和防御[19-20]。

WRKY TFs在植物應對蟲害脅迫過程中發揮關鍵作用。如Skibbe等[21]在野生煙草（）中鑒定到2個蟲害響應基因和，單獨或同時沉默和均提高了煙草對煙草天蛾（）的敏感性。Yao等[22]也在煙草中發現了3個受煙粉虱（）取食誘導的WRKY轉錄因子、和，沉默這3個基因會顯著地增加煙粉虱的存活時間和產卵量。此外，水稻中的和均能正調控水稻體內胰蛋白酶抑制劑的含量，從而增強水稻對二化螟（）的抗性[23-24]。有意思的是，擬南芥中的受蚜蟲取食為害誘導表達后，能有效降低桃蚜（）的取食難度，縮短其口針刺入維管束的時間，因而負調控植物的防御反應，使植物變得更易感蚜蟲[25]。盡管WRKY在植物抗蟲防御中的重要性已經被逐步證實，然而目前有關WRKY對植物抗蟲防御調控作用的研究還主要集中在水稻、擬南芥、煙草等草本植物中，木本植物中抗蟲相關的WRKY還鮮有報道。因此，挖掘和鑒定木本植物中的WRKY轉錄因子，對深入解析WRKY的抗蟲調控機理、拓寬人們對植物-昆蟲互作機制的理解具有重要意義。

茶樹（）是一種重要的多年生木本經濟作物，在其生長發育過程中常常受到多種害蟲的為害，對茶葉的產量和品質造成巨大影響。因此，明確茶樹蟲害脅迫響應的分子調控機理、挖掘茶樹抗蟲相關基因，對今后選育茶樹抗蟲品種具有重要的指導價值。然而，茶樹中有關WRKY TFs的研究還主要集中于其對低溫、干旱、高鹽等非生物脅迫的抗性調控方面[26-30]，目前僅通過克隆鑒定發現了基因可能參與了茶樹抗蟲防御反應[31]，還有大量蟲害脅迫響應相關的WRKY TFs未被發掘和報道。基于此，本研究以龍井43為試驗材料，克隆獲得了1個新的茶樹WRKY基因，并利用生物信息學分析了該基因的結構、理化特征以及進化關系等。此外，還進一步明確了該基因在細胞中發揮功能的位置，以及不同處理下的表達特征。本研究為深入解析WRKY在茶樹蟲害相關信號通路中的作用打下基礎，同時為茶樹抗蟲基因的挖掘和抗蟲品種的選育提供了理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以2年生龍井43盆栽苗為供試茶苗，預培養于中國農業科學院茶葉研究所玻璃溫室大棚內。試驗前挑選生長健壯、長勢一致、無病蟲害的茶苗轉移至人工氣候室[溫度(26±2)℃，光周期L∶D=12∶12，相對濕度70%～80%]，恢復培養3～4?d后用于后續試驗。

茶尺蠖（）幼蟲采自中國農業科學院茶葉研究所試驗茶園，于人工氣候室內[溫度(26±2)℃，光周期L∶D=14∶10，相對濕度65%～75%]用幼嫩的龍井43茶樹葉片進行飼喂和種群繁殖。室內穩定馴養兩代后，選取大小相近且健康活躍的二齡幼蟲用于后續試驗。

1.2 基因克隆

基于茶樹轉錄組數據篩選出基因的轉錄本序列，經NCBI ORFfinder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）確認其具有完整的開放閱讀框。運用Primer Blast設計該基因全長特異性引物-F和-R（表1）。以茶尺蠖為害6?h后的茶樹葉片cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶KOD FX（TOYOBO）擴增全長片段，PCR反應總體系為20?μL，反應程序為68℃ 3?min；98℃ 10?s，60℃ 30?s，68℃ 90?s，35個循環；68℃延伸5?min。擴增所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后在紫外燈下切割，并使用膠回收試劑盒（Thermo GeneJET Gel Extraction Kit）對目的片段進行回收純化，然后將其連入-Blunt Zero 載體（TRANSGEN BIOTECH）并轉化至-T1感受態細胞中，用通用引物M13-F/R（表1）對陽性克隆進行PCR鑒定、保存，并送浙江尚亞生物科技有限公司測序。

表1 引物信息

1.3 生物信息學分析

運用在線軟件ProtParam（http://web.expa sy.org/protparam）分析蛋白理化性質；運用Softberry（http://softberry.com）進行氨基酸序列分析；使用TBtools軟件尋找目的基因在茶樹染色體上的位置；在NCBI數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中下載其他同源蛋白序列，在MEGA 7.0軟件中采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹（參數：poisson mode，complete delection，boostrap=1?000）；在DNAMAN中進行多序列比對；采用SWISS-MODEL軟件預測蛋白三維結構，并用Pymol軟件編輯輸出。

1.4 茶苗處理

1.4.1 茶尺蠖幼蟲取食（Eo）處理

選取大小一致的頂芽下第二葉位葉片，處理組接入10頭二齡茶尺蠖幼蟲，并用透明網袋罩住取食葉片防止幼蟲逃逸；對照組用相同網袋罩住葉片。待害蟲取食葉片有明顯缺刻時開始計時，分別在處理1.5、3、6、12、24、36、48?h后剪取為害葉片，迅速浸入液氮中。設置6個生物學重復。

1.4.2 機械損傷（W）和機械損傷疊加茶尺蠖唾液（W+OS）處理

選取大小基本一致的頂芽下第二葉位葉片，用鋸齒滾輪于主葉脈兩側各損傷2道（間距0.5?cm），并立即在損傷部位涂抹雙蒸水（每片葉20?μL），作為W處理；在損傷部位涂抹茶尺蠖唾液（每片葉20?μL），作為W+OS處理；不做任何處理的茶樹葉片作為對照。分別在處理1.5、3、6?h后剪取為害葉片，迅速浸入液氮中。設置6個生物學重復。

1.4.3 植物激素處理

茉莉酸（JA）處理：將適量JA溶解于少量無水乙醇中，然后用50?mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 8.0）配成濃度為150?μg·mL-1的溶液（含0.02%吐溫20），每株茶苗噴施JA稀釋液10?mL，以噴施10?mL磷酸緩沖液（含0.02%吐溫20）的茶苗為對照。分別在處理0.5、1.5、3、6、12、24、48?h后剪取頂芽下第二葉位葉片，迅速浸入液氮中。設置6個生物學重復。

油菜素內酯（BR）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水楊酸（SA）、乙烯（ET）處理方法如下：用蒸餾水分別配置100?nmol·L-1BR、100?μmol·L-1ABA、10?μmol·L-1GA、100?μmol·L-1SA、200?mg·L-1ET的溶液，每株茶苗噴施處理液10?mL，以噴施10?mL蒸餾水（含0.02%吐溫20）的茶苗為對照。處理24?h后剪取頂芽下第二葉位葉片，迅速浸入液氮中。設置6個生物學重復。

1.4.4 不同組織處理

選取生長狀況相近的開花期茶樹，分別取根、莖、葉、花等4個組織，剪取樣品后迅速浸入液氮中。設置5個生物學重復。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

1.6 亞細胞定位

利用Exnase Ⅱ重組酶（Vazyme Biotech）將基因克隆至pBI121-GFP載體上，構建pBI121--GFP融合表達載體，隨后轉入DH5感受態細胞，對陽性克隆進行PCR鑒定、保存，并送浙江尚亞生物科技有限公司測序。將測序正確的質粒轉入農桿菌GV3101中，用含有卡那霉素（Kan）和利福平（Rif）抗性的LB培養基進行篩選，并對陽性克隆進行PCR鑒定和保存。

取少量上述保存菌液接入5?mL含有Kan和Rif的LB液體培養基中，28℃，200?r·min-1活化，隨后按1∶50稀釋到誘導培養基（含Kan和Rif，10?mmol·L-1MES，20?μmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.6）中28℃、200?r·min-1培養過夜。收集菌液并棄去上清液，用浸潤液（pH 5.7）重懸，將OD600調至1.0左右。室溫靜置3?h后，選取4～5葉期的本氏煙（），每株注射約1?mL菌液，3個生物學重復。室溫正常條件下培養2?d后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況。以pBI121-GFP空載體注射的本氏煙作為陽性對照。

1.7 數據統計與分析

根據試驗設計和統計分析原理，利用SPSS 18.0（Chicago Illinois State USA）軟件對試驗數據進行統計分析。采用獨立樣本檢驗或方差分析（LSMeans進行多重比較）對的誘導表達水平進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 CsWRKY17的克隆與序列分析

以茶尺蠖為害6?h后的茶樹葉片cDNA為模板，擴增獲得長度約1?100?bp的特異性條帶。對該條帶進行純化回收并連入-Blunt Zero載體后測序，得到的序列與轉錄組序列完全匹配。將測序結果在NCBI上進行Blastn分析，發現其與茶樹基因組預測的（GeneBank: XM_028257290.1）序列相似度達99.91%。克隆獲得的序列全長1?141?bp，包含987?bp開放閱讀框，編碼328個氨基酸殘基，位于茶樹第14條染色體上。

2.2 CsWRKY17的生物信息學分析

2.2.1 理化性質分析

利用ProtParam對CsWRKY17的理化性質進行分析，結果表明，CsWRKY17相對分子質量為35.7?kDa，理論等電點為9.66，共328個氨基酸，其中絲氨酸（Ser）含量最多，達到14.9%；包含26個負電荷殘基[天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）]，42個正電荷殘基[精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）]；不穩定系數為50.27，脂溶指數為62.44，總平均親水性指數為–0.621，推測為不穩定親水蛋白。

2.2.2結構域及三維結構分析

將CsWRKY17與擬南芥和水稻中WRKY蛋白進行同源性比對分析，結果顯示，所有序列中均有一段高度保守的結構域，其N端含有1個典型的WRKYGQK核心序列，C端含有1個C2-H2型（Cx4-5Cx22-23HXH）鋅指結構，表現為WRKY第Ⅱ亞家族的特征，說明CsWRKY17屬于WRKYⅡ家族成員之一（圖1）。進一步在SWISS-MODEL上對CsWRKY17蛋白的三維結構進行模擬分析，結果顯示其WRKY結構域由5個反向平行的折疊和無規則卷曲組成，與已報道的茶樹CsWRKY3、CsWRKY6、CsWRKY31、CsWRKY48等蛋白三維結構極其相似[27,31]，說明茶樹WRKY家族結構域的高度保守性。

2.2.3系統發育樹分析

為了分析茶樹CsWRKY17與其他植物同源蛋白的進化關系，并由此推測其在茶樹中可能發揮的功能，本研究在擬南芥（）、水稻（）小麥（）、棉花（）、大豆（）等代表物種中選取了15個同為WRKY第Ⅱ亞家族、與CsWRKY17同源性較高且已知生物學功能的蛋白序列，利用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）進行進化分析，構建系統發育樹。聚類結果顯示，茶樹CsWRKY17與擬南芥AtWRKY17和AtWRKY11聚到一起，親緣關系最近，而與OsWRKY11、GhWRKY48親緣關系較遠（圖2）。

圖1 茶樹CsWRKY17蛋白同源比對

注：擬南芥：AtWRKY7（AT4G24240.1）、AtWRKY11（AT4G31550.1）、AtWRKY17（AT2G24570.1）、AtWRKY15（AT2G23320.1）、AtWRKY74（AT5G28650.1）、AtWRKY39（AT3G04670.1）、AtWRKY6（AT1G62300.1）；水稻：OsWRKY51（LOC_Os04g21950.1）、OsWRKY68（LOC_Os04g51560.1）、OsWRKY25（LOC_Os08g13840.2）、OsWRKY11（LOC_Os01g43650.1）；小麥：TaWRKY53（ALC04270.1）；大豆：GmWRKY13（NP_001237376.2）；棉花：GhWRKY17（ADW82098.1）、GhWRKY39（AGX27510.1）、GhWRKY48（AFB35811.1）

2.3 CsWRKY17表達模式分析

2.3.1的組織表達特異性分析

為明確的表達模式，首先檢測了茶樹不同組織器官中的轉錄水平。結果發現，在茶樹的根、莖、葉、花等組織器官中均有表達，且具有明顯的組織特異性（圖3）。以茶樹葉中的表達量為參照進行分析，發現茶樹莖中的表達量僅為葉中的43%，差異顯著；而花中的表達量與葉中相當；在根部的表達量顯著高于其他組織部位，約為葉的4.75倍（圖3）。上述結果表明，在茶樹根部表達量最高，其次為葉和花，在莖中表達量最低。

2.3.2對蟲害脅迫的響應分析

為探究是否參與茶樹對蟲害脅迫的響應，對該基因在蟲害脅迫下的表達譜進行分析。結果表明，與對照相比，茶尺蠖幼蟲取食顯著上調的表達量，且在取食1.5?h后即可誘導，并隨取食時間的增加，誘導倍數也呈現增長趨勢，到36?h和48?h時達到頂峰，誘導倍數為7.66～7.10倍（圖4-A）。由于茶尺蠖幼蟲取食過程中伴隨著機械損傷和口腔分泌物的雙重作用，為厘清基因究竟受哪一種作用影響，利用機械損傷疊加茶尺蠖唾液的方式（W+OS）模擬害蟲取食處理茶苗，同時設置機械損傷（W）處理和未處理茶苗（Control）兩個對照。結果顯示，在1.5?h時間點上單獨W處理即能顯著誘導的表達，而W+OS處理與W處理相比誘導更為強烈，且持續時間更長，處理3?h后表達水平在W處理中已不再上調，而在W+OS處理中依然顯著上調（圖4-B）。上述結果表明，對蟲害的誘導響應是機械損傷和唾液的共同作用，且唾液起主導作用，推測可能參與了茶樹對茶尺蠖的抗性反應。

注：圖中不同的小寫字母表示各個處理之間方差分析存在顯著差異（P<0.05）

注：A為茶尺蠖幼蟲取食處理；B為茶尺蠖模擬取食處理。*表示處理與對照相比存在顯著差異（*，P<0.05；**，P<0.01；Student's t-tests）。不同的小寫字母表示各個處理之間方差分析存在顯著差異（P<0.05）。下同

2.3.3對多種激素的響應分析

為進一步探究可能介導的防御信號通路，利用qRT-PCR分析了對JA、SA、ET、BR、ABA、GA等防御相關信號分子的響應情況。由于茶尺蠖幼蟲取食能夠顯著激活，因此對與咀嚼式口器昆蟲抗性相關的JA處理進行了不同時間點的詳細分析。試驗結果表明，JA、ABA、BR和GA處理均能顯著上調的表達（圖5-A和5-B），其中JA處理12?h后即可顯著上調該基因表達量，并持續至處理后48?h（圖5-A）；而對SA和ET處理則無明顯響應（圖5-C），由此推測可能參與了JA、ABA、BR和GA相關信號的作用網絡。

2.4 CsWRKY17的亞細胞定位分析

為明確CsWRKY17在細胞中可能發揮功能的位置，通過構建pBI121--GFP融合表達載體，運用農桿菌侵染法浸潤核定位的轉基因本氏煙葉片，使目的基因在煙草葉片中進行瞬時表達，以pBI121-GFP空載體作為陽性對照。試驗結果如圖6所示，空載體在全細胞中均能觀察到綠色熒光，而融合了后僅在細胞核中觀察到綠色熒光信號，且與核定位的轉基因煙草中的紅色熒光信號重疊，呈現黃綠色熒光，說明很可能在細胞核中行使其生物學功能。

3 討論

WRKY TFs在調節蟲害誘導的防御反應中發揮重要作用，然而茶樹中參與抗蟲脅迫的WRKY卻鮮有報道。本研究克隆獲得了1個WRKY基因。同源性比對和結構域分析表明，含有1個典型WRKY結構域和1個C2H2型（C-X4-C-X23-HX-H）鋅指結構，屬于第Ⅱ亞家族；聚類分析結果表明，CsWRKY17與AtWRKY11和AtWRKY17聚為同一個分支，關系最近。Journot-Catalino等[32]研究發現，AtWRKY11和AtWRKY17參與調節擬南芥中生物和非生物脅迫相關防御過程，單獨敲除或同時敲除和會顯著增強擬南芥對病原菌pv的基礎抗性。Ali等[33-34]研究表明，和不僅可以正調控擬南芥對胞囊線蟲（）的抗性，還可以正調控擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受力。據此，我們推測很可能也在茶樹應對生物或非生物脅迫反應中發揮重要功能。

注：A為茉莉酸處理；B為油菜素內酯、脫落酸和赤霉素處理；C為水楊酸和乙烯處理。BUF表示緩沖液處理

注：將CsWRKY17克隆到pBI121-GFP載體中，空載體作為陽性對照。GFP：綠色熒光蛋白；RFP：紅色熒光蛋白

本研究表明，茶尺蠖取食后，的表達量從蟲害誘導的早期（1.5?h）被顯著誘導并持續到48?h。同樣地，在受到煙草天蛾幼蟲取食時，煙草中的和會迅速上調（15?min左右）[21]；二化螟取食30?min后即會誘導水稻的表達[24]。另外，本研究發現，盡管機械損傷也能誘導的表達，但卻明顯低于茶尺蠖唾液處理。機械損傷和茶尺蠖取食亦能顯著誘導茶樹中蟲害脅迫相關的[31]。因此，我們推測參與了茶樹抗蟲反應，并且是茶樹蟲害誘導防御反應早期的調節子。

本研究發現，JA處理12?h后以及BR、ABA、GA處理24?h后均誘導的表達。在水稻中，JA處理顯著誘導的表達，誘導表達后的會抑制水稻體內JA的含量，從而控制和平衡水稻對二化螟的防御反應[23]。在棉花中，ABA能夠顯著誘導的表達水平，通過激活ABA信號通路相關基因的表達來增強植物對干旱脅迫的耐受性[35]。同樣地，擬南芥中的WRKY46、WRKY54和WRKY70為BR信號通路的正調節子，BR處理強烈促進這3個基因的表達[36]。當、、同時突變后，BR對擬南芥的生長調控作用消失[36]。有意思的是，GA處理抑制了卷心菜（var.）中的表達，而能夠與GA合成相關基因以及啟動子中的W-box相結合，從而抑制這2個基因的表達[37]。以上研究均暗示了很可能也是通過調節JA、BR、ABA或GA信號通路來調控茶樹對茶尺蠖的防御和抗性。

在茶樹根、莖、葉和花中均有表達。其中，根中的表達量最高，葉片和花中次之。前人研究顯示，WRKY基因的表達具有組織特異性，例如：抗性基因主要在番茄的根部表達[38]，主要表達于水稻的節間和花穗中[39]。在根中的組成型高表達以及在葉中受茶尺蠖取食后的誘導表達，暗示了其可能不僅參與調節茶樹葉片對蟲害的抗性，還可能參與調節根對非生物或生物脅迫的響應。

大量研究表明，WRKY TFs能在細胞核中與靶基因的啟動子相結合，進而調控靶基因的表達。如在細胞核中與SA相關基因、JA相關基因和的啟動子相結合，調控水稻中JA和SA的相關信號通路以及植株體內SA的含量[40]。也定位于細胞核中，它不僅可以直接結合GA信號通路關鍵基因的啟動子W1、W2和W3區域以增強的表達水平，還能夠與SLR1蛋白相互作用來增加它的穩定性，從而抑制水稻體內的GA信號通路[39]。本研究的亞細胞定位試驗發現定位于細胞核中，并受到JA、BR、ABA、GA等外源激素處理的誘導表達。因此我們推測，也很可能在細胞核中與靶基因的啟動子相結合，進而調控JA、BR、ABA和GA信號通路相關基因的表達，但具體的互作靶標和調控機制還有待進一步研究。

本研究從茶樹中克隆得到轉錄因子，并詳細分析了其物理和化學特征，探究了在機械損傷、茶尺蠖為害和不同激素處理下的表達模式，以及在不同組織器官中的表達差異性，同時明確了該基因在細胞中發揮生物學功能的位置，推測CsWRKY17是蟲害誘導防御反應的一個早期調節子，并很可能通過參與調節JA、BR、ABA和GA等信號通路來調控茶樹對茶尺蠖的抗性反應。本研究不僅為深入解析WRKY調節植物抗蟲防御反應的作用機制打下了基礎，還為茶樹抗蟲新基因的挖掘和茶樹抗蟲品種的遺傳改良提供重要參考和依據。

[1] Erb M, Kliebenstein D J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: the blurred functional trichotomy [J]. Plant Physiology, 2020, 184(1): 39-52.

[2] Erb M, Reymond P. Molecular interactions between plants and insect herbivores [J]. Annual Review of Plant Biology, 2019, 70: 527-557.

[3] Aerts N, Mendes M P, Van Wees S C M. Multiple levels of crosstalk in hormone networks regulating plant defense [J]. The Plant Journal, 2021, 105(2): 489-504.

[4] Wang J, Wu D, Wang Y, et al. Jasmonate action in plant defense against insects [J]. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(13): 3391-3400.

[5] Ng D W, Abeysinghe J K, Kamali M. Regulating the regulators: the control of transcription factors in plant defense signaling [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(12): 3737. doi: 10.3390/ijms19123737.

[6] Cao Y P, Li K, Li Y L, et al. MYB transcription factors as regulators of secondary metabolism in plants [J]. Biology, 2020, 9(3): 61. doi: 10.3390/biology9030061.

[7] 吳雨捷, 吳健, 王幼平, 等. WRKY轉錄因子在植物抗逆反應中的功能研究進展[J]. 分子植物育種, 2020, 18(22): 7413-7422.

Wu Y J, Wu J, Wang Y P, et al. Advances in the function of WRKY transcription factor in plant stress response [J]. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(22): 7413-7422.

[8] He J, Bouwmeester H J, Dicke M, et al. Genome-wide analysis reveals transcription factors regulated by spider-mite feeding in cucumber () [J]. Plants, 2020, 9(8): 1014. doi: 10.3390/plants9081014.

[9] Rushton P J, Torres J T, Parniske M, et al. Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsley PR1 genes [J]. EMBO Journal, 1996, 15(20): 5690-5700.

[10] Ciolkowski I, Wanke D, Birkenbihl R P, et al. Studies on DNA-binding selectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-domain function [J]. Plant Molecular Biology, 2008, 68(1/2): 81-92.

[11] Bian Z Y, Gao H H, Wang C Y. NAC transcription factors as positive or negative regulators during ongoing battle between pathogens and our food crops [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 22(1): 81. doi: 10.3390/ijms22010081.

[12] Feng K, Hou X L, Xing G M, et al. Advances in AP2/ERF super-family transcription factors in plant [J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2020, 40(6): 750-776.

[13] Kielbowicz-Matuk A. Involvement of plant C2H2-type zinc finger transcription factors in stress responses [J]. Plant Science, 2012, 185/186: 78-85.

[14] Alves M S, Dadalto S P, Goncalves A B, et al. Plant bZIP transcription factors responsive to pathogens: a review [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2013, 14(4): 7815-7828.

[15] Bakshi M, Oelmüller R. WRKY transcription factors [J]. Plant Signaling & Behavior, 2014, 9: e27700. doi: doi.org/10.4161/psb.27700.

[16] Rushton P J, Somssich I E, Ringler P, et al. WRKY transcription factors [J]. Trends in Plant Science, 2010, 15(5): 247-258.

[17] Chen F, Hu Y, Vannozzi A, et al. The WRKY transcription factor family in model plants and crops [J]. Critical Reviews in Plant Sciences, 2017, 36(5/6): 311-335.

[18] Eulgem T, Rushton P J, Robatzek S, et al. The WRKY superfamily of plant transcription factors [J]. Trends in Plant Science, 2000, 5(5): 199-206.

[19] Jiang J, Ma S, Ye N, et al. WRKY transcription factors in plant responses to stresses [J]. Journal of Integrative Plant Biology, 2017, 59(2): 86-101.

[20] Bai Y L, Sunarti S, Kissoudis C, et al. The role of tomatogenes in plant responses to combined abiotic and biotic stresses [J]. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 801. doi: 10.3389/fpls.2018.00801.

[21] Skibbe M, Qu N, Galis I, et al. Induced plant defenses in the natural environment:WRKY3 and WRKY6 coordinate responses to herbivory [J]. Plant Cell, 2008, 20(7): 1984-2000.

[22] Yao D M, Zou C, Shu Y N, et al. WRKY transcription factors inmodulate plant immunity against whitefly via interacting with MAPK cascade pathways [J]. Insects, 2020, 12(1): 16. doi: 10.3390/insects12010016.

[23] Hu L F, Ye M, Li R, et al. The rice transcription factor WRKY53 suppresses herbivore-induced defenses by acting as a negative feedback modulator of mitogen-activated protein kinase activity [J]. Plant Physiology, 2015, 169(4): 2907-2921.

[24] Li R, Zhang J, Li J, et al. Prioritizing plant defence over growth through WRKY regulation facilitates infestation by non-target herbivores [J]. Elife, 2015, 4: e04805. doi: 10.7554/elife.04805.

[25] Kloth K J, Wiegers G L, Busscher-Lange J, et al. AtWRKY22 promotes susceptibility to aphids and modulates salicylic acid and jasmonic acid signalling [J]. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(11): 3383-3396.

[26] 郭俊紅, 王偉東, 谷星, 等. 茶樹WRKY轉錄因子基因的克隆及表達分析[J]. 茶葉科學, 2017, 37(4): 411-419.

Guo J H, Wang W D, Gu X, et al. Cloning and expression analysis of WRKY transcription factor genetranscription factor in tea plants () [J]. Journal of Tea Science, 2017, 37(4): 411-419.

[27] 王鵬杰, 岳川, 陳笛, 等. 茶樹、和基因的分離及表達分析[J]. 浙江大學學報(農業與生命科學版), 2019, 45(1): 30-38.

Wang P J, Yue C, Chen D, et al. Isolation and expression analysis of,andgenes in tea plant [J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences), 2019, 45(1): 30-38.

[28] 王鵬杰, 陳笛, 林浥, 等. 8個茶樹WRKY轉錄因子基因的克隆與表達分析[J]. 中草藥, 2019, 50(3): 685-693.

Wang P J, Chen D, Lin Y, et al. Cloning and expression analysis of eight WRKY genes in[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2019, 50(3): 685-693.

[29] 肖羅丹, 唐磊, 王偉東, 等. 茶樹轉錄因子的克隆及功能分析[J]. 中國農業科學, 2020, 53(12): 2460-2476.

Xiao L D, Tang L, Wang W D, et al. Cloning and functional analysis oftranscription factors in tea plant [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2020, 53(12): 2460-2476.

[30] Wang Y, Shu Z, Wang W, et al., a novelgene from, is involved in cold and drought stress responses [J]. Biologia Plantarum, 2016, 60: 443-451.

[31] 戈林剛, 葉保華, 辛肇軍, 等. 茶樹基因的克隆及表達分析[J]. 山東農業科學, 2018, 50(1): 1-8.

Ge L G, Ye B H, Xin Z J, et al. Cloning and expression analysis ofgene in[J]. Shandong Agricultural Sciences, 2018, 50(1): 1-8.

[32] Journot-Catalino N, Somssich I E, Roby D, et al. The transcription factors WRKY11 and WRKY17 act as negative regulators of basal resistance in[J]. Plant Cell, 2006, 18(11): 3289-3302.

[33] Ali M A, Wieczorek K, Kreil D P, et al. The beet cyst nematodemodulates the expression of WRKY transcription factors in syncytia to favour its development in Arabidopsis roots [J]. PLoS One, 2014, 9(7): e102360. doi: 10.1371/journal.pone.0102360.

[34] Ali M A, Azeem F, Nawaz M A, et al. Transcription factors WRKY11 and WRKY17 are involved in abiotic stress responses in[J]. Journal of Plant Physiology, 2018, 226: 12-21.

[35] Ullah A, Sun H, Hakim, et al. A novel cotton WRKY gene,-like, improves salt tolerance by activating the ABA signaling pathway and scavenging of reactive oxygen species [J]. Physiologia Plantarum, 2018, 162(4): 439-454.

[36] Chen J, Nolan T M, Ye H, et al. Arabidopsis WRKY46, WRKY54, and WRKY70 transcription factors are involved in brassinosteroid-regulated plant growth and drought responses [J]. Plant Cell, 2017, 29(6): 1425-1439.

[37] Fan Z Q, Tan X L, Shan W, et al. Characterization of a transcriptional regulator, BrWRKY6, associated with gibberellin-suppressed leaf senescence of Chinese flowering cabbage [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(8): 1791-1799.

[38] Singh D, Debnath P, Roohi, et al. Expression of the tomato WRKY gene,, alters root sensitivity to ethylene, auxin and JA and affects aerial architecture in transgenic Arabidopsis [J]. Physiology and Molecular Biology of Plants, 2020, 26(6): 1187-1199.

[39] Lan J, Lin Q, Zhou C, et al. Small grain and semi-dwarf 3, a WRKY transcription factor, negatively regulates plant height and grain size by stabilizing SLR1 expression in rice [J]. Plant Molecular Biology, 2020, 104(4/5): 429-450.

[40] Qiu D Y, Xiao J, Ding X H, et al. OsWRKY13 mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate- and jasmonate-dependent signaling [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2007, 20(5): 492-499.

Cloning and Expression Analysis ofTranscription Factor in Tea Plants

LIU Miaomiao1,2, ZANG Liansheng1, SUN Xiaoling2, ZHOU Zhongshi3*, YE Meng2*

1. Institute of Biological Control, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 3. Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094, China

WRKY transcription factors, a super family of plant transcription factors, play an essential role in the regulation of plant defense responses to herbivores. While the roles of herbivore-related WRKY transcription factors are well established in grass plants, their roles in woody plants are still largely unknown. Here, we cloned a WRKY transcription factor, named.has a full length of 1?141?bp, contains a 987?bp open reading frame, and encodes 328 amino acids. Based on the conserved domain analysis,belongs to the WRKY Ⅱ subfamily, containing one conserved WRKY domain and a typical C2H2-type zinc finger motif. Homology alignment and phylogenetic tree analysis show that CsWRKY17 has the closest relationship with AtWKRY11 and AtWRKY17 in. Moreover,exhibited a tissue specific expression, and was also induced by mechanical wounding, tea geometrid () attack, simulated herbivory, and exogenous phytohormone treatments like JA. Transient expression experiments indicate that it might play a role in the nucleus. Taken together, we proposed thatis a potential regulator of herbivore-induced defense responses against herbivores in tea plants through JA, ABA, GA and BR signaling. Our study paved the way for molecular analysis of herbivore-relatedWRKY genes in tea plants, and provided a good genetic resource and theoretical basis for future studies of pest-resistant genes and breeding of tea plants.

, WRKY transcription factors,, expression analysis, herbivore resistance

S571.1；Q52

A

1000-369X(2021)05-631-12

2021-04-30

2021-06-03

國家自然科學基金（31901898）、中央級公益性科研院所基本科研業務費（1610212019001）

劉苗苗，女，碩士研究生，主要從事植物與昆蟲互作研究。*通信作者：zs.zh@126.com；mengye@tricaas.com

（責任編輯：黃晨）