注射器內分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定茶葉中24種農藥殘留

馬佳麗，王晨，陳紅平，柴云峰，諸力，劉新

注射器內分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定茶葉中24種農藥殘留

馬佳麗1,2,3,4，王晨1,3,4*，陳紅平1,3,4，柴云峰1,3,4，諸力1,3,4，劉新1,3,4*

1. 中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 中國農業科學院研究生院，北京 100081；3. 農業農村部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008；4. 農業農村部茶葉產品質量安全風險評估實驗室（杭州），浙江 杭州 310008

基于茶葉基質特點，開發了注射器內分散固相萃取快速前處理技術，建立了茶葉中24種農藥殘留超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。茶葉樣品經乙腈提取，無水MgSO4鹽析，在設計的注射器裝置內以丙基乙二胺鍵合硅膠和石墨化炭黑作為分散吸附劑進行凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法進行檢測。在3個添加水平（0.01、0.05、0.5?mg·kg-1）下，紅茶和綠茶中24種農藥的平均回收率為61.7%～98.8%，相對標準偏差為0.4%～5.5%，準確度和精密度良好。24種農藥的紅茶和綠茶基質標準工作液線性關系良好，相關系數（2）均大于0.995，檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.05～5.36?μg·kg-1和0.18～17.86?μg·kg-1，該方法具有良好的靈敏度。本方法具有簡便快捷、所需儀器少、省時等優勢，適用于茶葉中多農藥殘留的定量檢測。

茶葉；超高效液相色譜-串聯質譜；農藥殘留；注射器內分散固相萃取

茶葉是一種重要的飲料產品。目前，我國已成為世界上最大的茶葉生產國，在國際茶葉貿易中占有重要地位[1]，同時我國也是世界上最大茶葉消費國。為保障茶葉的產量和質量，在茶樹生長過程中需要對病蟲草害進行防控。生態化協調發展要求采用以生物防控的技術，而有些茶樹種植者往往采用了噴施農藥的防控手段，從而導致茶葉中存在農藥殘留。目前茶葉中新煙堿類、氨基甲酸酯類、有機磷類、三唑類等農藥的檢出已被廣泛報道。陳思敏等[2]在15個茶葉樣品中檢出11種農藥，其中多菌靈、苯醚甲環唑和噠螨靈的檢出率大于60%且殘留量較高；余璐等[3]在茶葉樣品中檢測出15種農藥，其中包括噻嗪酮、啶蟲脒和三唑磷。

目前，茶葉中農藥殘留的分析方法主要有氣相色譜法[4-5]、液相色譜法[6-7]、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）[8-10]、液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[11-13]等。多農殘檢測通常采用通用性強、選擇性好、靈敏度高的GC-MS/MS和LC-MS/MS法，尤其LC-MS/MS法對茶葉農藥殘留的檢出限可達到ng·kg-1水平。茶葉作為一種高度復雜的基質，富含嘌呤堿、多酚和一些特有的色素。其在樣品前處理階段易與目標農藥一同提取，導致直接干擾和基質效應，因此茶葉農藥殘留檢測方法的開發與改進主要聚焦于前處理技術。傳統的前處理方法，如固相萃取[14-15]、基質固相分散[4,16]、凝膠滲透色譜[17-18]等，雖然能夠有效去除茶葉中的共萃取物質，但十分耗時、有機溶劑用量大且前處理設備昂貴，無法滿足對茶葉農殘檢測便捷、快速、低成本、高通量等的需求。一些新型前處理方法利用注射器進一步簡化了操作，例如注射器內分散固相萃取（IS-dSPE）、快速濾過型凈化（m-PFC）等。其中IS-dSPE法憑借注射器特有的活塞推拉操作避免了費時的離心步驟和大量的開關蓋操作，實現高通量的同時簡化了操作，提高了前處理的效率。該方法已在蜂蜜[19]、河水[20]、魚[21]等的農藥多殘留檢測中成功運用，但在茶葉中應用較少。

因此，本研究選擇了茶葉中檢出率高的24種農藥，其中16種農藥我國已制定限量標準，其余8種暫未制定限量但應用較為廣泛。以IS-dSPE法為基礎，進一步調整了注射器裝置，優化了質譜參數、提取條件、凈化條件、離心以及渦旋時間，以其建立具有簡單、快速、準確和高通量等優點的檢測方法，適用于茶葉中多農藥殘留的快速檢測，保障茶產品的安全質量。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）-AB Sciex TQ 5500三重四極桿質譜儀（美國Sciex公司），串聯使用；DMT-2500多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司）；渦旋混勻儀[大龍興創試驗儀器(北京)股份公司]；4-16KS冷凍離心機（德國Sigma公司）；5?mL一次性使用無菌帶針注射器（江蘇治宇醫療器材有限公司）；6?mL固相萃取（SPE）柱管及篩板（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

24種農藥標準品均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司和上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈、甲醇（HPLC級）均購自美國FIsher公司；-丙基乙二胺鍵合硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、多壁碳納米管（MWCNTs）均購自天津博納艾杰爾科技有限公司；交聯乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）購自美國Sigma-Aldrich公司；無水硫酸鎂（MgSO4）購自北京百靈威科技有限公司；尼龍濾器（孔徑0.22?μm，直徑13?mm）購自上海安譜實驗科技股份有限公司；試驗用水由Milli-Q試驗室水純化系統（美國Millipore公司）純化制得。茶葉樣品均為市售茶葉。

1.2 樣品前處理

將5?mL注射器拆解，取其中的活塞和針頭；在6?mL SPE柱管中加入篩板，在篩板上部填充100?mg PSA與25?mg GCB的組合吸附劑，將活塞從SPE柱管上部緩慢推到底，下部接上針頭，即獲得本研究所使用的組裝注射器。分散固相萃取注射器如圖1所示。

稱取2.00?g（精確至0.01?g）粉碎的茶葉試樣于50?mL離心管，加入5?mL去離子水，浸泡30?min，加入10?mL乙腈，充分渦旋振蕩30?s，加4?g無水MgSO4，渦旋振蕩30?s，以7?500?r·min-1離心5?min。吸取上清液1?mL至裝有100?mg PSA、25?mg GCB吸附劑的組裝注射器內，充分渦旋振蕩30?s，緩慢推動注射器活塞，濾液直接經尼龍濾器過濾，待超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）分析。

1.3 農藥標準溶液的配制

混合標準溶液：準確稱取各農藥標準品20.0?mg于20?mL容量瓶中，以乙腈溶解并定容至刻度，配成1?000?mg·L-1的標準儲備液，–18℃以下貯存。以乙腈稀釋至所需濃度，得到混合標準溶液。

混合標準工作液：取適量的混合標準溶液，以茶葉空白樣品經1.2章節處理得到基質溶液稀釋至1?mL，配置濃度為1、2、5、10、20、50、100、200、500?μg·L-1基質標準工作液。

圖1 分散固相萃取注射器示意圖

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱采用Waters Acquity HSS T3柱（2.1?mm×100?mm，1.7?μm）。流動相：A相為含0.1%甲酸及1?mmol·L-1甲酸銨水溶液，B相為含0.1%甲酸及1?mmol·L-1甲酸銨的甲醇溶液。流動相梯度洗脫程序：0～1?min，保持10% B；1～2?min，變為70% B；2～6?min，變為98% B；6～8?min，保持98% B；8～8.1?min，變為10% B；8.1～14?min，保持10% B；流速：0.3?mL·min-1；進樣量：1?μL；柱溫：40℃；運行時間：14?min。

質譜條件：采用電噴霧正離子源模式（ESI+）；氣簾氣（Curtain gas）壓力241.3?kPa；碰撞氣（Collision gas）壓力48.3?kPa；噴霧電壓5?500?V；霧化溫度500℃，霧化氣（GS1）壓力334.7?kPa；輔助氣（GS2）壓力334.7?kPa。監測模式：多反應監測（MRM）。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

以乙腈配制質量濃度為0.1?mg·L-1的24種目標化合物標準溶液，經針泵注射進樣，采用電噴霧正離子模式進行質譜條件優化，質譜優化結果如表1所示。

在選擇母離子時，24種目標化合物中23種皆以[M+H]+為母離子進行了二級質譜優化。水胺硫磷的分子量為289.053?77，其加氫峰[M+H]+（m/z 290）的信號強度很弱，說明離子化效率低，靈敏度難以滿足要求。除了分子離子峰[M+H]+外，水胺硫磷還存在加氫脫氨基峰[M+H-NH3]+（m/z 273）、加銨峰[M+NH4]+（m/z 307）、加鈉峰[M+Na]+（m/z 312）和加鉀峰[M+K]+（m/z 328）。母離子全掃時，[M+H-NH3]+、[M+NH4]+、[M+Na]+信號強度較高，而[M+K]+的信號強度很弱，表明水胺硫磷與鉀離子的結合能力很弱，不考慮作為母離子。以[M+NH4]+為母離子的離子對經液相色譜分離后峰形較差，分析可能是由于銨離子濃度不穩定造成，不考慮作為母離子。以[M+H-NH3]+和[M+Na]+為母離子的離子對經液相色譜分離后峰形均較好，但[M+H-NH3]+的離子對響應值顯著高于[M+Na]+，兩者豐度最高的離子對273/230.9和312/270.1的響應值之比為38∶1。因此本研究最終選擇[M+H-NH3]+（m/z 273）作為水胺硫磷的母離子，m/z 230.9、m/z 121分別作為其定量和定性子離子。分子結構及碎片離子裂解途徑如圖2所示。

2.2 前處理條件優化

2.2.1 提取條件的優化

本研究采用對所測農藥具有較強溶解性的乙腈作為提取溶劑。對于一些氨基甲酸酯類或是強極性的農藥，用水浸泡茶葉再經乙腈提取的效率高于用純乙腈提取的[11,22]。前期試驗表明，2?g茶樣加入5?mL水浸泡30?min后再經10?mL乙腈提取，更有利于乙腈對茶葉中極性農藥的提取，獲得穩定的結果。提取時需要加入鹽析劑飽和水相，以促使目標農藥進入乙腈相，為此本研究比較了3種不同鹽處理（即1?g NaCl+4?g無水MgSO4、4?g無水MgSO4、3?g NaCl）對目標農藥提取效率的影響。結果發現（圖3），23種農藥在3種處理下的回收率均在70%～120%，而烯啶蟲胺的回收率均低于70%。烯啶蟲胺的正辛醇水分配系數（log）為–0.66，水溶性較強，因此導致其易溶解于下層水相中，在提取時損失較大。由于烯啶蟲胺回收率在4?g無水MgSO4的處理下相對較高，為60.5%。因此本方法采用5?mL去離子水、10?mL乙腈提取并用4?g無水MgSO4鹽析。

2.2.2 注射器裝置及吸附劑優化

當注射器內直接裝入吸附劑，在吸取提取液后置于混勻渦旋儀上渦旋過程中會出現漏液的現象。經多次試驗驗證表明，在注射器底部加置篩板后，篩板可起到阻隔液體功能，可保證渦旋時不出現漏液情況。考察PSA、C18、GCB、PVPP和MWCNTs對目標農藥的凈化效果，用量分別為100、100、50、50、25?mg，以篩選合適的分散固相萃取吸附劑。試驗結果如圖4-A所示，在PSA和PVPP兩個處理下，大部分農藥凈化效果相對較好，目標農藥（烯啶蟲胺除外）的回收率皆能保證在70%～120%。其中多菌靈在PSA處理下回收率為71.1%，比凈化前提高了7%。并且PSA對于基質效應的改善也優于其他幾種吸附劑。

GCB、C18和MWCNTs作為QuEChERS前處理技術中常用的分散固相吸附劑，對基質中的色素具有較強的去除能力，使提取液顏色變淺[23]。該現象在本試驗中也得到了證實（圖4-B），其中GCB凈化后的液體顏色最淺，對茶葉中色素類物質凈化效果最好。

從回收率上看，GCB和MWCNTs均對多菌靈存在明顯的吸附作用，使其回收率降至60%以下，這與GCB和MWCNTs易吸附平面結構的物質有關。C18對毒死蜱、乙螨唑、噠螨靈、咪鮮胺和唑蟲酰胺等多種農藥存在吸附現象，使其回收率顯著低于凈化前，可能由于C18本身極性較弱，對弱極性農藥也具有一定吸附作用。因此，為了保證回收率并兼顧凈化效果，最終選擇將PSA作為吸附劑主體，并搭配少量GCB進一步去除色素類物質。

表1 24種農藥的UPLC-MS/MS多反應監測參數

注：*為定量離子對

Note: * denotes quantitative ion pair

圖2 正模式電噴霧串聯質譜中水胺硫磷分子結構及碎片離子裂解途徑

圖3 使用不同鹽析劑時茶葉中24種農藥的回收率

對PSA用量進一步優化，比較了200、150、100?mg和50?mg PSA處理后的凈化效果。如圖5-A所示，不同PSA用量對大部分目標農藥的回收率影響不顯著，但多菌靈在50?mg和100?mg PSA處理下的回收率可達到70%以上。從基質效應看（圖5-C），大部分農藥的基質抑制效應隨著用量的增加而明顯改善。綜合回收率和基質效應考慮，選擇100?mg PSA為最終用量。

對GCB用量優化時，比較了100?mg PSA基礎上分別加入50、25?mg和10?mg GCB處理后的凈化效果。如圖5-B所示，不同GCB用量對于大部分目標農藥的回收率影響不大，但多菌靈的回收率隨GCB用量增大而降低，在50?mg用量時降至60%以下。從基質效應看，隨著GCB用量的增加，大部分農藥的基質抑制未得到明顯改善（圖5-D），但對于色素類物質的去除效果提升。因此本研究最終選擇100?mg PSA搭配25?mg GCB作為最終的吸附劑組合。

圖5 PSA和GCB不同用量分散固相萃取凈化處理下茶葉中24種農藥的回收率和基質效應

2.2.3 渦旋時間的優化

本方法共有3次渦旋操作，第一次為提取步驟加入提取溶劑后；第二次為提取步驟加入鹽析劑后；第三次為凈化步驟提取液加至吸附劑后。本試驗分別對3次渦旋時間進行了優化，提取階段離心管中的2次渦旋時間均分別設置30?s、1?min、2?min和5?min進行比較，凈化階段注射器的渦旋時間設置30?s、1?min和2?min進行比較。結果如圖6所示，第一、三次渦旋時間對目標農藥回收率影響不顯著。而隨著第二次渦旋時間的延長，大部分農藥的回收率略有上升，可能由于渦旋時間長對水分的去除更加充分。總體上，目標農藥在第二次渦旋30?s后得到的回收率為61.0%～98.3%，可以滿足檢測需求，因此，3次渦旋均選擇30?s作為渦旋時間以提高效率。

注：A：第一次渦旋B：第二次渦旋C：第三次渦旋

2.3 方法的準確度和精密度

在空白的紅茶和綠茶樣品中添加24種農藥的混合標準溶液，開展添加回收試驗，添加水平分別為0.01、0.05、0.5?mg·kg-1。回收率和相對標準偏差結果見表2。除了綠茶中烯啶蟲胺在加標濃度為0.01?mg·kg-1時未能檢出，其余目標農藥在紅茶和綠茶中的加標回收率范圍在61.7%～98.8%，相對標準偏差（RSD，n=3）為0.1%～5.8%。結果表明，該方法準確度和精密度良好，符合多農殘檢測要求。

表2 紅茶和綠茶樣品中24種農藥的平均回收率和相對標準偏差

續表2

2.4 方法的線性范圍、檢出限、定量限和基質效應

對1.3章節配制的系列混合標準工作液和基質混合（紅茶、綠茶）標準工作液檢測，繪制溶劑、紅茶和綠茶的標準曲線。如表3所示，有23種農藥的紅茶（發酵茶）和綠茶（不發酵茶）基質標準工作液在不窄于1～100?μg·L-1的范圍內線性關系良好，相關系數（2）均大于0.995。綠茶和紅茶中23種農藥的檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.05～3.70?μg·kg-1和0.18～12.35?μg·kg-1，表明本方法具有良好的靈敏度。烯啶蟲胺在綠茶中靈敏度相對欠缺，檢出限為5.36?μg·kg-1，定量限為17.86?μg·kg-1，在5～500?μg·L-1范圍內線性關系良好（2=0.999?2）。

目標化合物的基質效應（ME值）計算公式如下：ME=基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率×100%。試驗結果表明，24種農藥在紅茶和綠茶中的ME分別為20%～100%和11.1%～100%，總體上目標農藥在綠茶中的基質抑制效應比紅茶更強。噻蟲胺、吡蟲啉、噻蟲嗪、滅多威等一些農藥存在很強的基質抑制效應，其中噻蟲胺、吡蟲啉、噻蟲嗪3個農藥在綠茶中的ME均低于15%。為了校正基質效應，本方法使用基質空白液配制混合標準工作液。

2.5 實際樣品分析與對比

采用建立的注射器結合UPLC-MS/MS法，對市售的紅茶和綠茶共10份茶葉樣品中的24種目標農藥進行定性定量檢測，并與實驗室傳統QuEChERS檢測方法的結果進行比對。結果顯示（表4），兩種檢測方法檢出的農藥品種相同，檢出結果的相對偏差范圍為2.2%～17.3%，表明本研究建立的新型檢測方法與實驗室傳統方法結果具有一致性。

表3 紅茶和綠茶中24種農藥的線性方程、線性范圍、相關系數、方法檢出限及定量限

在樣品前處理時間上，本研究建立的新型方法對單個樣品凈化時間可控制在2?min以內，而實驗室傳統方法由于需要較長時間的渦旋離心，通常單個樣品的凈化時間需要15?min左右。由此可見，本研究建立的新型檢測方法可以在較短時間內完成茶葉中多種農藥殘留的提取凈化過程，較傳統方法在效率上有較大的提高。

表4 本研究方法與傳統方法對10份茶樣檢出結果對比

3 討論和結論

本研究通過對前處理條件、質譜條件等優化，建立了注射器內分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜測定茶葉中24種農藥殘留的方法。該方法采用乙腈對茶葉樣品提取，無水MgSO4鹽析，在設計的注射器裝置內以PSA和GCB組合凈化，UPLC-MS/MS分析。通過對茶葉中24種農藥平均回收率試驗，顯示該方法的平均回收率在61.7%～98.8%，RSD小于5.5%，說明該方法具有良好的準確度和精密度。通過對該方法的檢出限試驗，方法檢出限在0.05～5.36?μg·kg-1，靈敏度良好。24種農藥在線性范圍內相關系數（2）均大于0.995，線性關系良好。與傳統QuEChERS方法采用的dSPE相比，通過注射器裝置簡化了操作，可將單個樣品的凈化時間控制在2?min以內。方法具有操作簡單易上手、所用儀器少、時間節省、普適性好等優點，適合用于茶葉中多農藥殘留的日常檢測。

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Rapid Determination of 24 Pesticide Residues in Tea by in-Syringe Dispersive Solid Phase Extraction-Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

MA Jiali1,2,3,4, WANG Chen1,3,4*, CHEN Hongping1,3,4, CHAI Yunfeng1,3,4, ZHU Li1,3,4, LIU Xin1,3,4*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China; 3. Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China; 4. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Tea Products (Hangzhou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China

Based on the characteristics of tea matrix, a rapid pretreatment technology of in-syringe dispersive solid phase extraction (dSPE) was developed, and an analytical method based on ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established for the detection of 24 pesticide residues in tea. Tea samples were extracted using acetonitrile, salted-out with MgSO4, purified with primary secondary amine and graphitized carbon black as dispersive adsorbents in designed syringe devices, and detected by UPLC-MS/MS. Recoveries of 24 pesticides in black and green teas were 61.7%-98.8% at three spiked levels (0.01?mg·kg-1, 0.05?mg·kg-1and 0.5?mg·kg-1), which indicated high accuracy with the relative standard deviations of 0.4%-5.5%. The calibration curves of 24 pesticides in black and green teas showed good linearity with correlation coefficients (R2) higher than 0.995. The limits of detection (LOD) and the limits of quantitation (LOQ) were 0.05-5.36?μg·kg-1and 0.18-17.86?μg·kg-1, respectively, which show high sensitivity of this method. Being simple, fast, less instrument required and time-saving, this method is suitable for quantification of multiple pesticide residues in tea.

tea, ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, pesticide residues, in-syringe dispersive solid phase extraction

S571.1；TS207.3

A

1000-369X(2021)05-717-14

2021-02-01

2021-03-01

財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系（CARS-19）、中國農業科學院創新團隊（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS-06）、國家農產品質量安全風險評估項目（GJFP2020001）

馬佳麗，女，碩士研究生，主要從事茶葉質量安全研究。*通信作者：wangchen@tricaas.com；liuxin@tricaas.com

（責任編輯：趙鋒）