32份茶樹地方群體種資源的遺傳多樣性和群體結構分析

李長樂，葛悅，閆美琳，李慧，林青青，王璞，趙華，王明樂，王郁，郭飛，倪德江

32份茶樹地方群體種資源的遺傳多樣性和群體結構分析

李長樂，葛悅，閆美琳，李慧，林青青，王璞，趙華，王明樂，王郁，郭飛*，倪德江

華中農業大學園藝林學學院/園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070

選取均勻分布于茶樹15個連鎖群上的30對SSR引物，對來自12個省份的32份茶樹群體種資源進行遺傳多樣性和群體結構分析，以期為茶樹雜交育種親本選擇和演化路線推斷提供參考。研究共獲得149個等位基因，平均每個SSR標記檢測到5.96個等位基因，引物多態性信息含量均值為0.660。32個茶樹群體Shannon’s多樣性指數范圍為0.691～1.089，平均數為0.954；觀測雜合度的范圍為0.253～0.633，平均數為0.510；期望雜合度范圍為0.430～0.653，平均數為0.590。供試茶樹群體遺傳分化系數（）均值為0.205，遺傳分化水平較高。基于Nei’s遺傳距離的聚類和群體結構分析結果一致，供試種質可劃分為四大類型，具有明顯的地域分布規律。

群體品種；SSR分子標記；群體結構；遺傳多樣性；演化路線

茶樹在我國分布廣泛，經歷了長期的自然選擇及人工馴化和栽培過程，形成了豐富多樣的種質資源。現有的茶樹品種基本分為有性系品種和無性系品種兩大類，有性系品種用種子繁殖，又稱“群體品種”，群體品種包含的個體類型豐富，是天然的種質資源庫。

近年來，隨著茶產業的蓬勃發展，發掘和保護優異茶樹種質資源的重要性日益凸顯，關于茶樹種質資源方面的文獻越來越多，從表型性狀、內含成分、適制茶類到細胞結構、基因序列的研究均有報道[1-4]。分子標記揭示的是基因組層面上DNA序列的差異，相對于形態學標記、生化標記等，受外界環境因素影響小。1980年至今，越來越多的分子標記技術成功用于茶樹種質資源的遺傳多樣性分析、種質鑒定和分類研究[5-7]。在茶樹中廣泛應用的分子標記技術主要有限制性片段長度多態性標記（RFLP）、擴展片段長度多態性標記（AFLP）、單核苷酸多態性標記（SNP）、簡單重復序列標記（SSR）等[8-10]。SSR是第二代分子標記，技術成熟，穩定可靠，獲取途徑便捷，且具有共顯性、單個位點多態性高、重復性好、特異性強、數量豐富等特點，被廣泛運用于茶樹種質的遺傳多樣性評估、親緣關系鑒定、群體結構劃分、指紋圖譜構建等[11-12]。黃丹娟[13]對我國茶樹品種的遺傳多樣性水平進行分析，從128個SSR標記中篩選出2套核心引物，認為分析254個茶樹品種遺傳多樣性至少需要用30對SSR引物。姜曉輝等[14]利用毛細管電泳熒光標記技術對廣東茶樹群體種質進行研究、聚類，綜合分析了其遺傳結構并推測了其可能的基因交流情況。楊軍等[15]利用SSR分子標記對福建茶樹種質資源展開研究，將供試樣品劃分類群并鑒定了親緣關系。姚明哲等[16]對四川和重慶茶樹群體種的遺傳多樣性和群體結構進行分析，發現川、渝茶樹群體種在群體結構上有較明顯的差異，推測出這兩地種質可能具有不同的演化和傳播途徑。Zhao等[17]利用14個SSR分子標記分析了大理茶中25個居群內587個茶樹個體的遺傳多樣性，發現各居群內部水平上野生居群遺傳多樣性的減少和遺傳漂變的發生高于馴化居群。

國內外學者對茶樹群體種資源的各方面做了大量研究，但對于全國范圍內多省份茶樹種質資源的綜合研究相對較少，難以從整體范圍去考量、發掘不同地區群體種資源的關聯與差異性。茶樹地方群體品種是茶樹種質資源的重要組成部分，也是優質茶樹選育的重要材料。本研究基于SSR分子標記對來自12個省份的32份茶樹地方群體品種進行群體結構和遺傳多樣性研究，以期揭示不同地區茶樹種質親緣關系和地域分布規律，為優異茶樹種質資源的發掘和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為來自全國12個省份（包含32個地區）的茶樹地方群體品種，課題組前期從各個產區實地考察、收集茶籽，統一播種、定植于華中農業大學茶學試驗基地。分子標記樣品為單株取樣，以前期整理的供試地方群體品種典型形態學特征為參照，每個群體種選擇6株代表性植株，共計192株單株，分別采集各單株幼嫩組織并儲藏于–80℃冰箱備用。供試群體名稱、來源、編號等信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及SSR引物信息

茶樹基因組DNA的提取使用CTAB法；提取所得DNA樣品的濃度和質量使用超微量分光光度計和2%瓊脂糖凝膠電泳檢測；試驗所用的30對引物均由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列參照文獻[13]。

1.2.2 PCR反應體系和反應條件

PCR反應體系（10?μL）：10?μmol·L-1的正反向引物各0.5?μL，2×Taq PCR MasterMix（Taq DNA Polymerase、MgCl2、dNTPs）5?μL，300?ng·μL-1的DNA模板1?μL，滅菌超純水3?μL。PCR擴增程序為：94℃預變性3?min；94℃變性30?s，各引物退火溫度退火30?s，72℃延伸30?s，35個循環；72℃延伸10?min，擴增完畢于4℃冰箱保存。

表1 供試材料的名稱及原產地

1.2.3 毛細管電泳

毛細管電泳系統為QIAxcel Advanced全自動核酸分析儀，預制膠卡夾為QIAxcel DNA High Resolution Kit（1200），運行方法為OM800，吸取時間選擇10?s。運行結束后，保存電泳結果的峰圖和膠圖進行數據統計分析。

1.3 數據統計與分析

1.3.1 數據統計

采用人工讀帶方法根據擴增條帶分子量大小進行統計，有清晰目標條帶記為“1”，無清晰目標條帶的記為“0”，生成“0、1”數據矩陣。

1.3.2 數據分析

不同軟件分析所需要數據格式的轉換通過DataFormate實現；使用Popgen 32軟件進行Hardy-Weinberg平衡檢驗、中性檢驗、各項遺傳參數估算、遺傳距離和遺傳一致度計算；遺傳多樣性指數（值）計算公式為12，式中表示第個等位基因位點出現的頻率[18]；根據Nei’s遺傳距離和鄰接法（Neighbor-joining method），利用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

應用Structure 2.3對供試茶樹材料進行群體結構分析，假定群體數目（K值）為1～15，各位點相互獨立，將蒙特卡羅算法開始時的不作數迭代次數（Length of burn-in period）設為50?000，將不作數迭代數的MCMC設為50?000，每個K值重復運行10次。以似然值最大原則，根據在線軟件Structure Harvester計算結果確定最佳分組K值，進而得到最優群體結構。

2 結果與分析

2.1 引物的多態性信息量

用30對引物對供試的茶樹樣品進行擴增，其中有25對均勻分布于15條染色體上的SSR引物擴增效果較好，能夠擴增出清晰的條帶，且擴增產物經過毛細管電泳檢測后能產生較好的多態性。引物TM209的部分毛細管電泳圖譜如圖1所示。

使用Popgene 32軟件對供試茶樹群體的25對SSR位點進行了Hardy-Weinberg平衡檢驗和中性測試分析（設置1?000次重復）。Hardy-Weinberg平衡檢驗可以評估供試群體與遺傳平衡群體之間的偏離程度，是評估群體其他計算數據是否可靠的一種手段[19]。對茶樹群體毛細管電泳數據進行Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗，800組數據中僅有136組顯著偏Hardy-Weinberg平衡，且散落分布在不同群體的不同位點上，意味群體評估數據相對可靠。中性測試分析結果顯示，25對SSR位點中有6對位點的統計量觀測值（）略偏離95%置信區間，其余19對SSR位點觀測值均在95%置信區間范圍內，表明這些基因座大多為中性基因，不受自然選擇和其他因素的影響，可用于茶樹群體遺傳多樣性分析（表2）。

利用25對SSR高多態性引物擴增結果對來自32份茶樹群體的192個單株進行遺傳多樣性分析，共獲得149個等位基因，其中最多為10個，最少為4個，平均為5.96個；有效等位基因數在1.786～5.532，平均為3.424個（表3）。值通常反映引物的多態性程度，當值＞0.5時，為高度多態性；當0.25＜值＜0.5時，為中度多態性；當值＜0.25時，表現為低度多態性[20]。供試樣品的值變化范圍較大（0.440～0.819），平均值為0.660，說明本研究中所選出的25對引物總體上存在較高的多態性，適用于茶樹種質資源的鑒定。觀察雜合度（）和期望雜合度（）的范圍在0～1（0表示無多態性；1表示無限多個等位基因具有相同頻率），供試群體的位于0.214～0.750，平均值為0.510；位于0.441～0.821，平均值為0.681。表明在整體水平上，供試茶樹群體具有較高的遺傳多樣性。

2.2 茶樹群體遺傳多樣性與遺傳結構分析

2.2.1 不同地區茶樹群體遺傳多樣性分析

如表4所示，32個茶樹群體的觀測等位基因數（）范圍為2.760～3.760，平均觀測等位基因數為3.318；有效等位基因數（）的范圍為1.813～2.794，平均有效等位基因數為2.445；Shannon’s多樣性指數（）范圍為0.691～1.089，平均數為0.954；觀測雜合度（）的范圍為0.253～0.633，平均數為0.510；期望雜合度（）范圍為0.430～0.653，平均數為0.590。32個茶樹群體中有30個群體的觀測雜合度小于期望雜合度，說明茶樹群體內存有一定程度的近交現象，導致純合子過量。多態位點數為23～25個，說明各群體的遺傳多樣性水平較高。

圖1 引物TM209的部分毛細管電泳圖譜

表2 25個位點中性檢測信息

2.2.2 茶樹群體遺傳分化分析

對茶樹群體遺傳結構進行統計檢驗分析，結果如表5所示。25個SSR位點的基因流均值為0.969，約等于1，其中14個位點的基因流小于1，11個位點基因流大于1，說明茶樹各群體內和群體間都存在一定程度的遺傳分化，這可能與茶樹作為經濟作物受到人為干預較多以及茶樹異花授粉、自交不親和的特性有關。其總群體固定指數（）的范圍在0.022～0.660，平均值為0.250。群體內固定系數（）平均值為0.056，接近于0，表明群體可能是Hardy-Weinberg隨機交配群體[21]。群體間遺傳分化系數（）為0～＜0.05時，群體間具有低水平遺傳分化；位于0.05～＜0.15時，群體間具有中等水平遺傳分化；位于0.15～＜0.25時，群體間具有較高水平遺傳分化[22]。本研究供試茶樹群體遺傳分化系數（）均值為0.205，說明群體間遺傳分化水平較高。

2.2.3 系統發育分析及群體結構劃分

基于供試樣品兩兩之間的Nei’s遺傳距離矩陣，應用鄰接法對32份資源進行系統發育分析（圖2）。其中來自同一省市不同地區的茶樹地方群體品種顯示出了較近的親緣關系（簇a）：黎家坪群體種和馮家臺群體種（同屬湖北省恩施市），龍井種和鳩坑種（同屬于浙江省杭州市），黃山種和祁門種（同屬安徽省黃山市）。整體分析結果表明，32個供試樣品被劃分為3個簇，簇a主要包括13份種質資源，分別為湖北（3份）、江西（2份）、浙江（2份）、貴州（1份）、安徽（2份）、福建（1份）、河南（1份）、陜西（1份）的種質資源；簇b包含12份種質資源，分別為江西（5份）、湖北（1份）、湖南（2份）、廣西（1份）、貴州（2份）、云南（1份）的種質資源；簇c包括廣西（2份）、廣東（1份）、湖南（2份）、云南（2份）的種質資源。

應用Structure 2.3對供試材料進行群體結構分析，結果表明，當K=2時，ΔK的數值最大（圖3）。按照似然值最大的要求分析來自32個地區的茶樹群體種，可以將其分成2個遺傳群體，紅色表示亞群A，綠色表示亞群B（圖4-A）。為了進一步研究茶樹群體結構，本研究對K=4時的茶樹群體結構也進行了分析（圖4-B）。基于Structure 2.3軟件分析得到的茶樹群體分類結構與根據Nei’s遺傳距離得到的鄰接聚類分析結果一致。當K=2時，群體A包括整個簇c；群體B包含簇a和簇b。當K=4時，整體分類結構也和鄰接聚類分析結果相符，在K=2時的分類結果上進一步細化，增加了亞群C（藍色）和亞群D（黃色）。

表3 25個位點多樣性信息

表4 群體遺傳多樣性信息表

綜合系統發育樹和群體結構分析的結果，供試群體可以劃分為四大類。從原產地來看，這四大類茶樹種質在地理分布上表現出一定規律：位于云南的群體種（鳳慶大葉茶、勐庫大葉茶）單獨聚為一類；第二類在湖南南部和廣西、廣東區域集中分布；第三類主要分布在云南、貴州、廣西、湖南、湖北、江西等地，這些地區位于供試茶區的中部；第四類主要分布在湖北、江西、福建、陜西、河南、安徽、浙江等地，這些地區位于供試茶區的東部和北部末端。

圖3 ΔK隨K值的變化趨勢

表5 F統計檢驗

注：1：石阡苔茶；2：宜春群體種；3：鳩坑種；4：都勻毛尖；5：竹山大黑葉；6：江華苦茶；7：城步峒茶；8：坦洋菜茶；9：上猶群體種；10：龍井種；11：婺源種；12：南山白毛茶；13：修水群體種；14：永修群體種；15：遂川群體種；16：黎家坪群體種；17：浮梁種；18：馮家臺群體種；19：宜昌大葉茶；20：汝城白毛茶；21：云臺山種；22：牙己茶；23：信陽種；24：黃山種；25：十里香；26：鳥王茶；27：祁門種；28：紫陽種；29：勐庫大葉茶；30：羅坑群體種；31：六堡茶；32：鳳慶大葉茶。下同

注：圖A為K=2，紅色表示群體A，綠色表示群體B。圖B為K=4，紅色表示群體A，綠色表示群體B，藍色表示群體C，黃色表示群體D。圖C為K=3時，Structure軟件劃分的A（紅色）、B（綠色）兩個亞群在系統發育樹上的分布情況。圖D為K=4時，Structure軟件劃分的A（紅色）、B（綠色）、C（藍色）、D（黃色）4個亞群在系統發育樹上的分布情況

3 討論

3.1 引物的多態性信息量

物種的遺傳多樣性分析是其種質資源評價和雜種優勢利用的基礎，遺傳多樣性評價指標易受到供試材料及標記方法的影響。本研究利用25對SSR引物對來自不同省份的192個單株進行遺傳多樣性分析，Hardy-Weinberg平衡檢驗和中性測試結果表明，所選的位點多為中性位點，各群體供試材料在遺傳水平相對穩定、可靠，有利于茶樹群體種質遺傳多樣性的研究。分析共獲得149個等位基因，平均每個SSR標記檢測到5.96個等位基因，引物多態性信息含量均值為0.660，表現為高多態性引物，有利于不同遺傳背景供試材料的區分。與其他研究相比，本研究檢測到的等位位點數偏高，這可能是由于本研究中研究材料涵蓋面積廣、類型豐富，且采用的毛細管電泳檢測方法，數據較傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測更為靈敏、精確，能區分3～5?bp的差異，故能檢測到更多的等位位點。

3.2 供試樣品的遺傳多樣性

喬婷婷[23]對不同省份茶樹資源多樣性進行統計，發現廣西、廣東和云南的資源多樣性偏高，湖南、江蘇、安徽和河南的多樣性偏低。本研究中各省份的遺傳多樣性并沒有明顯的地域規律，這可能與所選取的供試材料及樣本量不同有關。根據雜合度的概念，當雜合度大于0.5時，群體具有比較豐富的遺傳多樣性；且觀測雜合度值和期望雜合度值越接近，群體的遺傳多樣性程度越高[24-25]。本研究供試茶樹群體Shannon’s多樣性指數為0.691～1.089，觀測雜合度平均值為0.51，期望雜合度平均值為0.59，各群體的觀測雜合度值和期望雜合度值非常接近，說明供試的32個群體都具有較高的遺傳多樣性，其中城步峒茶群體的觀測雜合度及期望雜合度與劉振等[26]研究結果相似。遺傳分化系數（）平均值為0.205，表明供試茶樹群體間遺傳分化水平較高，側面反映了研究選用的SSR位點對供試樣品具有較好的區分效果。

3.3 供試樣品的群體結構

黃丹娟[13]和喬婷婷[23]基于分子標記分別對不同省份優良茶樹品種進行聚類分析，都發現福建、浙江、安徽和河南的種質資源聚在同一類群，與本研究分析得到的茶樹群體聚類結果一致。本研究中，來自云南的鳳慶大葉茶和勐庫大葉茶并沒有與十里香聚在一起，而是單獨聚為一類，推測這可能與橫斷山脈獨特的地貌有關。研究表明，山脈和河流可以改變植物的生境并影響物種的群體結構，橫斷山脈是中國最長、最寬和最典型的南北走向山系，也是植物區系東西、南北多樣性融合和選擇演化的關鍵地帶[27-29]，在地理分布上，鳳慶大葉茶和勐庫大葉茶原產地位于橫斷山脈西側區域，而十里香原產地位于橫斷山脈東側區域。

本研究中第二大類包含城步峒茶、江華苦茶、汝城白毛茶、六堡茶、南山白毛茶和羅坑群體種6份種質資源，聚集分布在3個彼此相鄰的省份中，與鳳慶大葉茶和勐庫大葉茶親緣關系較近；在K=2時，第四大類與第三大類聚為一類，第四大類主要分布于前人所推測茶樹傳播路線的末端區域，而第三大類在供試茶區西南到東北方向皆有分布，且從云南經貴州、湖南呈放射狀在廣西、江西、湖北等地分布。結合本研究系統發育分析結果，推測遺傳背景不同的供試茶樹分別通過以下2條途徑傳播：（1）一部分種質（第一大類和第二大類）從云南經廣西向湖南、廣東傳播；（2）其他種質（第三大類和第四大類）從云南經貴州、湖南向湖北、江西傳播，最終傳播到福建、安徽、浙江、陜西、河南等地。

3.4 茶樹地方群體品種的收集與保護

32份茶樹地方群體種遺傳多樣性研究結果顯示，每份茶樹地方群體種內包含著豐富的種質資源，且不同群體種間遺傳分化水平較高。系統發育及群體結構分析表明，供試茶區中，西南地區較東北地區種質遺傳分化水平高，且傳播中間地帶（湖南、湖北、江西）包含茶樹資源類型較為豐富，供試茶區東部末端及北部末端類型單一、遺傳背景較為狹窄，與姚明哲等[30]的研究結果相似；對江南茶區茶樹地方品種遺傳多樣性進行分析，湖南、湖北、江西的種質表現出了豐富的多樣性[31]；對來自安徽省內10個地區的茶樹群體種進行遺傳多樣性分析，結果表明它們遺傳相似性極高，遺傳相似系數為0.946～0.987[32]。基因分型往往與表型性狀相關聯，余書平等[33]基于分子標記技術對開化縣茶樹群體種進行親緣關系分析，發現了兩個基于分子標記的基因分型結果一致、表型性狀表現相似的特異種質。可以適當結合分子標記技術開展各地方種質遺傳多樣性研究，挖掘親緣關系相對較遠的核心種質，因地制宜的開展茶樹地方群體種質的收集與保護工作。

感謝中國農業科學院茶葉研究所陳亮研究員課題組為本研究提供引物。

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Analysis of Genetic Diversity and Population Structure of 32 Tea Landraces in China

LI Changle, GE Yue, YAN Meilin, LI Hui, LIN Qingqing, WANG Pu, ZHAO Hua, WANG Mingle, WANG Yu, GUO Fei*, NI Dejiang

Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Tea plant populations are natural populations of tea plants. They are cultivated in specific production areas and contain individuals with different economic and biological traits. There are great differences among individuals and there are many types. They are important materials for studying the evolutionary relationship and breeding of tea plants. In this study, 30 pairs of SSR primers distributed on 15 linkage groups were selected to analyze the genetic diversity and population structure of 32 tea plant populations from 12 provinces, in order to provide a reference for the selection of tea breeding parents and the inference of evolution route. In this study, a total of 149 alleles were obtained with an average of 5.96 for each SSR marker. The average polymorphism information content of primers was 0.660. Shannon's diversity index of 32 tea populations ranged from 0.691 to 1.089, with an average of 0.954. The observed heterozygosity ranged from 0.253 to 0.633, with an average of 0.510. The expected heterozygosity ranged from 0.430 to 0.653, with an average of 0.590. The average genetic differentiation coefficient () of tea plant population was 0.205, indicating a high level of genetic differentiation. The results of clustering based on Nei's genetic distance and population structure analysis were consistent. The germplasm to be tested was divided into 4 major types, with obvious regional distribution.

tea landraces, SSR molecular marker, population structure, genetic diversity, evolutionary route

S571.1；S324

A

1000-369X(2021)05-619-12

2021-03-02

2021-03-24

國家重點研發計劃（2019YFD1001601）、園藝作物種質資源平臺（2020DFE017）、中央高校基本科研業務費專項（2662020YLPY023）

李長樂，女，碩士研究生，主要從事茶樹遺傳育種研究。*通信作者：guofei@mail.hzau.edu.cn

（責任編輯：黃晨）