溶膠－凝膠分子印跡CsPbBr3量子點(diǎn)的構(gòu)建及其在膽固醇熒光檢測(cè)中的應(yīng)用

宋敏霞，管 杰，陳 璐，舒 韻，徐 琴，胡效亞

（揚(yáng)州大學(xué) 化學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225002）

膽固醇（CHO）是人和動(dòng)物組織細(xì)胞中不可缺少的生物分子，然而大量醫(yī)學(xué)調(diào)查研究表明，人體內(nèi)的高CHO含量易引起動(dòng)脈硬化等心血管疾病［1］，因此準(zhǔn)確、及時(shí)檢測(cè)CHO具有十分重要的意義。目前檢測(cè)CHO的常用方法中，色譜法［2］能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中膽固醇的測(cè)定，但需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，儀器設(shè)備體積較大，價(jià)格較高，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求；比色法［3］和電化學(xué)方法［4］相對(duì)簡(jiǎn)單，但需要利用膽固醇氧化酶提高其選擇性，方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性受酶活性的限制。熒光法操作過(guò)程簡(jiǎn)便、響應(yīng)快速、結(jié)果精確靈敏，是膽固醇測(cè)定的良好選擇。近年來(lái)金屬納米顆粒、酶標(biāo)CdSe/ZnS量子點(diǎn)（QDs）［5－6］等常被用作熒光檢測(cè)的探針材料。但是，大多數(shù)探針存在熒光產(chǎn)率低、粒徑分布廣、穩(wěn)定性差等不足［7－8］。因此，開發(fā)一種檢測(cè)CHO的新型熒光探針材料極為必要。

區(qū)別于經(jīng)典的Cd系量子點(diǎn)或碳量子點(diǎn)等，近幾年發(fā)展起來(lái)的全無(wú)機(jī)鹵化物鈣鈦礦量子點(diǎn)（CsPbX3QDs，X=Cl、Br、I）具備合成工藝簡(jiǎn)單、發(fā)射波長(zhǎng)及帶隙可調(diào)、熒光強(qiáng)度高、電荷轉(zhuǎn)移快等優(yōu)異特性，在太陽(yáng)能電池、發(fā)光二極管、激光等光電領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［9－11］。然而，利用其熒光特性進(jìn)行分析的文獻(xiàn)報(bào)道較少，這是由于CsPbX3QDs在水或氧氣存在下不穩(wěn)定，缺乏選擇性［12］。SiO2具有良好的光透明度，將CsPbX3QDs包覆于SiO2基質(zhì)中已被證明是在保持CsPbX3QDs熒光性質(zhì)的前提下，改善其穩(wěn)定性的有效策略之一［13］。

選擇性是制備熒光傳感器時(shí)需要考慮的關(guān)鍵因素之一。雖然膽固醇氧化酶可被用來(lái)提高熒光探針的選擇性，但是基于酶構(gòu)建的傳感器成本過(guò)高且容易失活［14］。分子印跡聚合物（MIPs）作為一種典型的仿生元件，具備較高的選擇性，同時(shí)還具有成本低、制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好等較多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多種樣品的分析檢測(cè)［15－16］，將MIPs與包括熒光在內(nèi)的傳感技術(shù)相結(jié)合也逐漸成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

本工作將具有高選擇性的MIPs和具備優(yōu)異熒光性質(zhì)的CsPbBr3QDs結(jié)合，以CsPbBr3QDs作為信號(hào)單元，四甲氧基硅烷（MTMOS）為交聯(lián)劑，3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）為功能單體，通過(guò)范德華力和氫鍵與模板分子CHO相互作用，在溶膠－凝膠過(guò)程將CHO引入到SiO2網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，去除模板分子后形成能對(duì)CHO進(jìn)行選擇性識(shí)別的位點(diǎn)；同時(shí)將CsPbBr3QDs包封在形成的硅層網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，提高了CsPbBr3QDs的穩(wěn)定性，獲得對(duì)模板分子CHO具有特異性識(shí)別能力的熒光傳感平臺(tái)（MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs）。研究了合成的MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器的結(jié)構(gòu)組成、熒光性能和識(shí)別性能，并將其成功應(yīng)用于脫脂奶粉中CHO濃度的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JEM－2100透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Tensor－27傅里葉變換紅外光譜（美國(guó)布魯克科技有限公司）；FS－5熒光光譜儀（英國(guó)愛丁堡公司）。碳酸銫、乙酸乙酯、正己烷、甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；溴化鉛（PbBr2）、辛胺（OAm）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、四甲氧基硅烷（MTMOS）、十八烯（ODE）、油酸（OA）、正硅酸乙酯（TEOS）（上海阿拉丁試劑有限公司）；膽固醇、甘油三酯、尿酸、脂肪酸、人血清蛋白、葡萄糖（上海麥克林生化有限公司）。若無(wú)特殊說(shuō)明，所用試劑均為分析純，且未經(jīng)進(jìn)一步純化；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CsPbBr3QDs及SiO2包封的CsPbBr3QDs（CsPbBr3@SiO2QDs）的合成 根據(jù)文獻(xiàn)［17］，通過(guò)典型的熱注射法合成CsPbBr3QDs。SiO2包裹的CsPbBr3QDs顆粒合成步驟如下：將0.188 mmol PbBr2和5mL的ODE添加到三頸燒瓶中，在真空下通入N2除氧，溫度控制在120℃攪拌1h，然后在N2保護(hù)下快速添加100μL的OAm、500μL的TEOS和100μL的OA。0.5 h后，反應(yīng)溫度由120℃升至170℃，快速加入700μL碳酸銫溶液（預(yù)熱到100℃），并立即冰水浴制備QDs。隨后，將反應(yīng)暴露在空氣中，攪拌30min生成對(duì)CsPbBr3QDs進(jìn)行包裹的SiO2殼層。再用正己烷洗滌兩次去除多余的溶劑，以9000r/min離心8min后烘干底物，得到CsPbBr3@SiO2QDs。最后，將CsPbBr3@SiO2QDs顆粒分散在10mL正己烷溶劑中保存。

1.2.2 MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的合成 將0.389 g CHO（1mmol）、0.90 mL（5mmol）APTES和10mL ODE在25℃下攪拌2h直至CHO與APTES混合均勻。然后加入100μL濃度為0.02 mol·L－1的CsPbBr3@SiO2QDs作為熒光載體，攪拌30min，加入100μL交聯(lián)劑MTMOS，反應(yīng)密封，室溫下攪拌12h后停止反應(yīng)，以9000r/min離心5min去除上清液并將反應(yīng)物60℃烘干。稱取20mg烘干后的固體顆粒分散至10mL由乙酸乙酯和正己烷組成的混合溶劑（體積比1∶3）中，超聲洗滌以去除印跡聚合物中殘留的CHO分子，直至熒光強(qiáng)度不再變化。將去除模板分子后的固體再次分散到洗脫液中，超聲，用HPLC對(duì)洗脫液進(jìn)行測(cè)定，未檢測(cè)到CHO信號(hào)，表明CHO分子已被完全洗脫。將洗脫后的固體顆粒60℃烘干，即得到MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs。在不添加CHO的情況下，用相同的方法和步驟合成了NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs。

1.2.3 CHO檢測(cè)稱取20mg MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs加入含有不同濃度CHO的乙酸乙酯溶液中，定容至10mL，識(shí)別30min后，取適量上述溶液加入石英比色皿（0.35 mL）中，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)450nm，發(fā)射波長(zhǎng)515nm，狹縫半寬均為1.00 nm，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量其熒光信號(hào)強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

利用透射電鏡（TEM）表征了CsPbBr3QDs、CsPbBr3@SiO2QDs和MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的微觀結(jié)構(gòu)。圖1A為合成的CsPbBr3QDs的透射電鏡圖，其平均直徑約為7.9 nm，具有良好的分散性，顆粒表面光滑平整，大小基本一致。圖1B是CsPbBr3@SiO2QDs的透射電鏡圖，以TEOS為前驅(qū)體并水解后，可在CsPbBr3QDs表面產(chǎn)生一層SiO2包裹層，將CsPbBr3QDs成功封裝到TEOS水解生成的硅基質(zhì)中，有效保護(hù)熒光量子點(diǎn)（CsPbBr3QDs）。圖1C是MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的透射電鏡圖，可以看出，APTES中的氨基與CHO中的羥基通過(guò)氫鍵相互作用，在CHO的周圍通過(guò)脫水與MTMOS以Si—O—Si鍵交聯(lián)在一起并包圍模板，呈現(xiàn)比較緊密的球形結(jié)構(gòu)。

圖1 CsPbBr3QDs（A）、CsPbBr3@SiO2QDs（B）和MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（C）的透射電鏡圖，以及CHO（a）、CsPbBr3QDs（b）、CsPbBr3@SiO2QDs（c）、MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs洗脫前（d）后（e）、NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（f）的紅外光譜（D）Fig.1 TEM images of CsPbBr3QDs（A），CsPbBr3@SiO2QDs（B）and MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（C），and FT－IR spectra（D）of CHO（a），CsPbBr3QDs（b），CsPbBr3@SiO2QDs（c），MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs before（d）and after（e）elution，and NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（f）

圖1D為CHO、CsPbBr3QDs、CsPbBr3@SiO2QDs、MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs洗 脫 前 后 及NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的FT－IR光譜。CHO的FT－IR光譜（曲線a）圖中，3411cm－1和2950cm－1分別對(duì)應(yīng)CHO中—OH和C—H鍵的伸縮振動(dòng)峰，1465cm－1和1362cm－1處為—CH2和—CH3的不對(duì)稱變形振動(dòng)峰，1050cm－1處為C—OH的伸縮振動(dòng)峰［18］。CsPbBr3QDs（曲線b）在2930cm－1和2864cm－1處表現(xiàn)出長(zhǎng)烷基鏈（—CH2—）的伸縮振動(dòng)峰，1713cm?1和1451cm?1處分別為封端在CsPbBr3QDs表面的油酸和油胺的振動(dòng)峰。CsPbBr3QDs@SiO2（曲線c）在1267cm－1和1030cm－1處的峰對(duì)應(yīng)Si—O—Si鍵，769cm－1處對(duì)應(yīng)Si—O鍵，這表明在TEOS水解縮合后形成了包裹在CsPbBr3QDs表面的硅層［19］。MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs洗脫前（曲線d）在3446cm?1和2953cm?1處表現(xiàn)出CHO的—OH和C—H鍵特征峰，表明模板分子CHO成功印跡，1640cm－1和1452cm－1處對(duì)應(yīng)功能單體APTES的—NH2鍵，1378cm－1和1057cm－1處對(duì)應(yīng)Si—O—Si鍵的伸縮振動(dòng)，760cm－1處為Si—O—Si鍵的面外變形振動(dòng)，457cm－1處為Si—O—Si鍵的彎曲振動(dòng)。通過(guò)比較曲線c和曲線d，可以發(fā)現(xiàn)Si—O—Si鍵的振動(dòng)峰發(fā)生紅移，這可能是由于CHO成功印跡后形成了氫鍵。曲線e表明MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs洗脫后，3446cm－1處—OH的伸縮振動(dòng)峰消失，其紅外光譜類似于NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（曲線f），此外，2953cm－1處C—H鍵伸縮振動(dòng)峰的信號(hào)也略有減弱，這些都表明模板分子CHO被有效去除。

2.2 MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs用于CHO熒光檢測(cè)的可行性

圖2為不同條件下CsPbBr3@SiO2QDs的熒光光譜圖。MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs洗脫模板分子CHO前（曲線a）熒光強(qiáng)度最低，去除模板分子CHO后MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（曲線c）的熒光強(qiáng)度恢復(fù)，與NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（曲線d）的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，說(shuō)明該模板分子從印跡薄膜中基本洗脫完全并形成對(duì)CHO具有特異識(shí)別能力的位點(diǎn)。當(dāng)MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs識(shí)別CHO后，CsPbBr3@SiO2QDs的熒光強(qiáng)度再次下降（曲線b），說(shuō)明CHO對(duì)MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的熒光發(fā)射具有明顯的猝滅作用，表明CHO占據(jù)了結(jié)合位點(diǎn)，形成空間位阻，影響了量子點(diǎn)的熒光效率。綜上表明MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs對(duì)CHO具有良好的特異性識(shí)別能力，能用于CHO的識(shí)別測(cè)定。

圖2 MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs洗脫前（a）、在含有1.00 ×10－10mol·L－1CHO的乙酸乙酯溶液中識(shí)別30min后的MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（b）、去除模板分子CHO后的MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（c）和NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（d）的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs before removing the template（a），MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs incubated in ethyl acetate solution containing1.00 ×10－10mol·L－1CHO for30min（b），MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs after removing the template（c）and NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（d）

2.3 MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器對(duì)CHO的檢測(cè)性能

利用所制備的MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器檢測(cè)不同濃度的CHO。圖3A顯示隨著CHO濃度的增加，MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。圖3B曲線a表明：在1.00 ×10－11～5.00 ×10－8mol·L－1CHO濃度范圍內(nèi)，MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的熒光猝滅效率（（IF0－IF）/IF）隨CHO濃度對(duì)數(shù)（lgc）的增加呈線性減小，其線性方程為：（IF0－IF）/IF=－0.0371 +0.2352 lgc（mol/L），r2=0.9937 ，檢出限（LOD，由3σ/k計(jì)算所得，其中σ為空白樣品5次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）為2.48 ×10－12mol·L－1。表1對(duì)比了用于CHO檢測(cè)的不同分子印跡傳感器的線性范圍和檢出限，表明MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器具有檢測(cè)線性范圍寬、檢出限低等特點(diǎn)。印跡效率是衡量分子印跡傳感器的一個(gè)重要指標(biāo)，印跡因子（Imprinting factor，IF=KSV，MIP/KSV，NIP）被用于評(píng)價(jià)印跡效率（KSV，MIP和KSV，NIP分別代表MIP和NIP傳感器標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率［20］）。一般IF＞1，IF越大，選擇性越好，印跡效果越好。圖3B曲線b表明，NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs的線性方程為：（IF0－IF）/IF=0.0113 +0.0198 lgc（mol/L），r2=0.9912 。對(duì)于所制備的MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器，其印跡因子約為11.88，這可能與MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs具有特異性識(shí)別位點(diǎn)，對(duì)CHO的親和力高于NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs有關(guān)。

圖3 CHO濃度對(duì)MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光光譜的影響（A），MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（曲線a）與NIPs/CsPbBr3@SiO2 QDs（曲線b）的線性校準(zhǔn)曲線（B），MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器對(duì)CHO的選擇性及干擾（C），MIPs/CsPbBr3@SiO2 QDs熒光傳感器的重現(xiàn)性（D）Fig.3 Effect of CHO concentration on the fluorescence spectra of MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（A），linear calibration curves for MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（curve a）and NIPs/CsPbBr3@SiO2QDs（curve b）（B），selectivity of MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs fluorescence sensor to CHO and the interferences（C），reproducibility of MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs fluorescence sensor（D）a－h(huán)：1.00 ×10－11－5.00 ×10－8mol·L－1

表1 MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器與文獻(xiàn)報(bào)道分子印跡傳感器性能的比較Table1 Comparison of the performance of MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs fluorescence sensor and the molecule-imprinted sensor reported in the literature

通過(guò)檢測(cè)MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器在甘油三酯（TG）、尿酸（UA）、脂肪酸（FA）、人血清白蛋白（HSA）和葡萄糖（Glucose）等物質(zhì)存在下的熒光猝滅效率，研究了MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器對(duì)CHO的選擇性。圖3C表明10倍濃度干擾物對(duì)1.00 ×10－10mol·L－1CHO的測(cè)定基本不產(chǎn)生影響，這主要是因?yàn)镸IPs上特定形狀的印跡空腔和分布的官能團(tuán)可以選擇性地識(shí)別CHO，從而降低了其他物質(zhì)的干擾。

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)檢測(cè)5個(gè)獨(dú)立研制的傳感器在不同時(shí)間對(duì)CHO的熒光響應(yīng)結(jié)果，研究了熒光傳感器的重現(xiàn)性，并對(duì)每個(gè)批次進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)試。如圖3D所示，結(jié)果表明熒光傳感器具有良好的重現(xiàn)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.3%。

2.4 熒光傳感器的檢測(cè)機(jī)理

在檢測(cè)過(guò)程中，模板分子CHO通過(guò)氫鍵與功能單體APTES提供的官能團(tuán)氨基（—NH2）作用后，被MIPs／CsPbBr3@SiO2QDs的SiO2殼層上的印跡位點(diǎn)所捕獲，形成空間位阻，影響熒光信號(hào)單元（CsPbBr3QDs）的發(fā)射和電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光猝滅［22］。在450nm激發(fā)波長(zhǎng)下，IF0/IF與CHO濃度的線性關(guān)系符合Stern－Volmer方程：IF0/IF=1+KSV［Q］［23］，其中［Q］為CHO的濃度。根據(jù)該方程計(jì)算出Stern－Volmer的猝滅常數(shù)（KSV）為7.12 ×108L/mol，較高的猝滅常數(shù)進(jìn)一步證明非熒光物質(zhì)CHO在疏水性CsPbBr3@SiO2QDs上的強(qiáng)吸附導(dǎo)致了熒光猝滅。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

進(jìn)一步研究了MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器用于實(shí)際樣品分析的可行性和準(zhǔn)確性。以市售脫脂奶粉為實(shí)際樣品，稱取0.50 g市售脫脂奶粉，加入10mL乙酸乙酯，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min后，將上清液以0.45 μm濾膜過(guò)濾，取10μL濾液加入10mL乙酸乙酯中用于CHO含量測(cè)定，并將測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)GB5009.128－2016［24］的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。對(duì)脫脂奶粉樣品進(jìn)行3個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其回收率為88.0 %～97.4 %（表2），證明所制備的MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器具有良好的可行性。

表2 MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器對(duì)脫脂奶粉中CHO的檢測(cè)（n=5）Table2 Detection of CHO in skimmed milk samples by MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs fluorescence sensor（n=5）

3 結(jié) 論

本研究以CsPbBr3QDs為熒光探針，并基于溶膠－凝膠分子印跡技術(shù)將其包裹在SiO2基質(zhì)中提高穩(wěn)定性及賦予其識(shí)別性能，構(gòu)建了MIPs/CsPbBr3@SiO2QDs熒光傳感器。研究了該傳感器對(duì)CHO測(cè)定的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器對(duì)CHO具有良好的選擇性，并成功應(yīng)用于脫脂奶粉中CHO含量的測(cè)定。該熒光傳感平臺(tái)還可擴(kuò)展用于其他物質(zhì)的分析檢測(cè)，相關(guān)研究結(jié)果拓寬了全無(wú)機(jī)鈣鈦礦量子點(diǎn)材料在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。