QuEChERS/液相色譜－串聯質譜測定豬肉中賽拉嗪及其代謝產物2，6-二甲基苯胺

張譯文，任蘇瑜，翟明燕，何 欣，譚 峰

（大連理工大學 環境學院，工業生態與環境工程教育部重點實驗室，遼寧 大連 116024）

賽拉嗪是一種α受體激動劑，可直接作用于中樞神經系統，起到鎮靜、鎮痛和麻醉效果，常作為肌肉注射鎮靜劑、止痛藥和肌肉松弛劑用于動物的基礎麻醉［1－2］。賽拉嗪在動物體內的主要代謝產物為2，6-二甲基苯胺（DMA），其可引起高鐵血紅蛋白癥，對中樞神經和肝臟有一定損傷，嚴重時造成昏迷、休克，且具有基因毒性和致癌作用，世界衛生組織國際癌癥研究機構將DMA列為2B類致癌物［3－4］。因此，動物源性食品中賽拉嗪和DMA的分析具有重要意義。

目前，賽拉嗪和DMA的分析主要采用液相色譜和液相色譜－質譜聯用技術［1，5－8］。如高雪和崔晶晶等［5－6］對血液和尿液中的賽拉嗪及DMA含量進行了檢測。Zheng等［7］測定了動物組織中賽拉嗪和DMA的殘留量。由于生物樣品基質的復雜性，樣品前處理過程尤為關鍵。目前生物樣品常用的前處理方法為液液萃取、固相萃取等，這些前處理方法操作較復雜且有機溶劑用量較多。QuEChERS是一種操作簡便、快速的樣品前處理技術，廣泛用于生物、食品及環境樣品的凈化處理［9－11］。本文將QuEChERS方法用于豬肉樣品中賽拉嗪和DMA的前處理，考察了不同提取溶劑、吸附劑種類及用量對目標物回收率的影響，建立了豬肉中賽拉嗪及DMA的QuEChERS/液相色譜－串聯質譜（LC－MS/MS）測定方法。該法具有簡單、快速、靈敏度高等優點，可用于市售豬肉樣品中賽拉嗪及DMA的篩查。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent RPLC/6410B液相色譜－三重四極桿串聯質譜（美國安捷倫科技有限公司），KQ－20DE超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器公司），D-130勻漿機（德國Wiggens公司），VM-02U渦旋儀（美國Crystal公司），BSA224S電子天平（德國Sartorius公司），H1750離心機（湖南湘儀公司），Smart-S15實驗室純水系統（上海和泰公司），WD-12氮吹儀（杭州奧盛公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，Sigma－Aldrich公司），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司），賽拉嗪和DMA標準品（純度大于98%，Dr.Ehrenstorfer公司）；C18吸附劑（50μm）和N-丙基乙二胺（PSA，40～63μm）均購于天津博納艾杰爾科技有限公司；豬肉樣品購于當地超市。

1.2 液相色譜－質譜條件

色譜條件：色譜分析在Agilent RPLC/6410B液相色譜－三重四極桿串聯質譜上完成。色譜柱為Waters C18（100mm×2.1 mm，3.5 μm），柱溫為40℃，進樣體積為10μL，流速為0.25 mL/min。流動相：A相為0.1 %甲酸－水溶液，B相為0.1 %甲酸－乙腈溶液。梯度洗脫條件：0～0.5 min，20% B，0.5 ～4min，20%～70%B；4～4.01 min，70%～20%B。

質譜條件：電噴霧正離子采集模式，霧化氣壓力為0.31 MPa，干燥氣溫度為250℃，干燥氣流速為14L/min，鞘氣溫度為350℃，鞘氣流速為12L/min，毛細管電壓為4kV，噴嘴電壓為1kV，碰撞解離電壓為120V，掃描范圍為m/z50～500，定量分析采用多反應監測模式。

1.3 標準溶液配制

準確稱量賽拉嗪和DMA標準品各1.0 mg于10.0 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容，配制得到質量濃度為100mg/L的標準儲備液，于－20℃冷藏保存。

1.4 樣品前處理

1.4.1 QuEChERS法 稱取勻漿后的豬肉組織5g（“2.2.1 ”進行提取方法比較時均使用0.25 g）于離心管中，加入賽拉嗪和DMA混標溶液，使每種待測物的含量均為100μg/kg，渦旋后加入2%乙酸－乙腈溶液使總體積為20mL，勻漿1min，渦旋振蕩，然后加入3g無水Na2SO4和1g NaCl［12－13］，超聲1min，離心并收集全部上清液。向其中加入50mg PSA和100mg C18吸附劑，渦旋并超聲1min，于4℃離心得上清液，取2mL提取液氮吹至近干，用1mL初始流動相復溶，過0.22 μm濾膜后待LC－MS/MS分析。

1.4.2 液液萃取法 稱取勻漿后的豬肉組織0.25 g于離心管中，加入混標溶液，使每種待測物的含量均為300μg/kg，渦旋混勻后，加入2%乙酸－乙腈溶液使總體積為3mL，勻漿1min，渦旋振蕩，離心收集上清液，殘渣用乙腈洗滌，重復提取1次，合并上清液。向其中加入2mL乙腈飽和的正己烷，水平振蕩提取5min，收集下層，相同步驟用正己烷重復提取2次，合并提取液后氮吹至近干，用1mL初始流動相復溶，過0.22 μm濾膜后待LC－MS/MS分析。

2 結果與討論

2.1 液相色譜－質譜檢測條件的優化

根據待測物分子結構，賽拉嗪和DMA中均含有氨基，易質子化帶正電荷，因此采用正離子模式。以乙腈－水為流動相，并在流動相中添加0.1 %甲酸，以提供質子化所需H+。對流動相梯度洗脫條件進行了優化，實驗發現采用“1.2”所示的簡單梯度洗脫程序，賽拉嗪和DMA即能實現很好的分離，整個分析過程可在4min完成（圖1A）。

為準確定性樣品中的賽拉嗪和DMA，每個化合物須有2個定性離子。通過對賽拉嗪和DMA的二級譜圖進行分析，發現賽拉嗪碎裂后產生的碎片離子中，以m/z為90.3 和164.3 的碎片離子信號最強且穩定；而DMA以m/z為105.4 和107.4 的碎片離子信號最強且穩定，因此分別選擇上述碎片離子作為賽拉嗪和DMA的定性離子，與母離子構成定性離子對（如表1），對樣品中賽拉嗪和DMA進行確認。此外，分別選擇m/z為90.3 和105.4 兩個碎片離子作為賽拉嗪和DMA的定量離子。進樣質量濃度為100μg/L時，賽拉嗪和DMA碎片離子的提取離子色譜圖分別為圖1B和C。

圖1 賽拉嗪和DMA的總離子流圖（A）及賽拉嗪（B）和DMA（C）碎片離子的提取離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of xylazine and DMA（A）and extracted ion chromatograms of xylazine（B）and DMA（C）

表1 賽拉嗪及DMA的質譜分析參數Table1 Analytical parameters of tandem mass spectrometry for xylazine and DMA

2.2 提取條件的優化

2.2.1 提取方法的選擇 將市購豬肉組織絞碎后按“1.4 ”兩種方法進行溶劑提取、凈化處理，結果未檢出賽拉嗪和DMA，因此采用該樣品制備基質空白溶液。首先對比分析了液液萃取法和QuEChERS法對豬肉中賽拉嗪和DMA的提取、凈化效果及回收率，豬肉組織取樣量均為0.25 g，提取溶劑體積為3mL。結果顯示，使用液液萃取法獲得的樣品背景較復雜，出現較多雜峰，干擾賽拉嗪和DMA的定量分析，目標物的回收率為39.4 %～70.3 %。而采用QuEChERS法的除雜效果明顯，色譜圖的峰形較好，賽拉嗪和DMA的回收率為78.1 %～81.9 %，高于液液萃取法的回收率。因此實驗選擇QuEChERS法對樣品進行前處理。

2.2.2 提取溶劑的優化常見的提取溶劑有甲醇、正己烷、乙酸乙酯和乙腈等。研究表明，提取過程中加入微量有機酸（如甲酸、乙酸）能夠促進目標物在水相和有機相之間的分配和轉移［12］。考慮到豬肉樣品中大量的蛋白質、脂質在乙腈或甲醇體系中有較好的沉淀效果，且目標物在乙腈和甲醇中的溶解度高，因此分別考察了乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）、乙腈－2%乙酸（HAc）、甲醇－2%乙酸作為提取溶劑時的效果。向空白樣品中添加混合標準溶液使每種待測物的含量均為100μg/kg，按照“1.4.1”中QuEChERS方法以上述4種溶劑提取樣品后測定。結果顯示，4種溶劑對賽拉嗪的提取效率為67.3 %～88.9 %，而對DMA的提取效率較低，僅為9.3 %～36.5 %。其中以乙腈－2%乙酸為提取溶劑時賽拉嗪和DMA的提取效果最好（圖2）。因此，選擇乙腈－2%乙酸作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對賽拉嗪和DMA回收率的影響Fig.2 Effects of extraction reagents on the recoveries of xylazine and DMA

2.2.3 吸附劑種類與用量的優化PSA是一種極性吸附劑，對目標物的保留機理為弱陰離子交換（水溶性基質）、極性相互作用（非極性有機基質）、螯合作用，可有效去除脂肪酸、有機酸、極性色素和糖，廣泛用于農殘樣品的前處理［13－14］。C18的疏水性強，對非極性組分有吸附作用，主要用于反相萃取，適用于非極性到中等極性的化合物。實驗考察了PSA（75mg）、C18（75mg）、PSA/C18（25mg/50mg）分別作為吸附劑對賽拉嗪和DMA回收率的影響。按照“1.4.1 ”中QuEChERS方法進行前處理，結果如圖3所示，使用上述3種吸附劑時，賽拉嗪的回收率為70.6 %～77.1 %，差異較小；而DMA使用PSA和C18混合吸附劑的回收率為59.9 %，明顯高于單獨使用PSA或C18的回收率（15.9 %和48.0 %）。因此，實驗選擇PSA/C18混合吸附劑進行樣品凈化處理。

圖3 吸附劑種類對賽拉嗪與DMA回收率的影響Fig.3 Effects of adsorbents on the recoveries of xylazine and DMA

進一步對比了PSA/C18（10mg/20mg、25mg/50mg和50mg/100mg）不同用量組合條件下賽拉嗪和DMA的回收率。結果顯示，上述3種條件下賽拉嗪的回收率為89.1 %～90.4 %，DMA的回收率為59.9 %～79.3 %。實驗選擇PSA和C18的用量分別為50mg和100mg，此時兩目標物的回收率總體較好。

2.3 基質效應

在液相色譜－質譜分析時，基質效應常對分析過程有顯著干擾，影響分析結果的準確性。考慮到豬肉中含有較多蛋白質和脂肪，本文考察了賽拉嗪和DMA在空白樣品中的基質效應。分別用純乙腈溶劑和空白基質溶液稀釋賽拉嗪和DMA樣品的標準儲備液，制備成不同質量濃度的系列溶液，然后按照本方法進行測定，以目標物定量離子的峰面積對質量濃度做校正曲線，并以2種曲線斜率的比值作為基質效應。結果表明，賽拉嗪與DMA的基質效應分別為0.86 和0.89 ，均表現為弱抑制效應。為減少基質效應的影響，提高準確性和重復性，實驗采用基質匹配校準曲線對目標物進行定量。

2.4 方法學評價

向空白基質溶液中加入不同質量濃度的混合標準溶液，按照“1.4.1”方法進行前處理后測定，以目標物定量離子的峰面積對其質量濃度進行線性擬合，得到賽拉嗪和DMA的線性范圍均為0.2 ～500μg/L。以3倍信噪比時的質量濃度作為檢出限（LOD），以10倍信噪比時的質量濃度作為定量下限（LOQ），計算得到賽拉嗪和DMA的LOD分別為0.05 、0.15 μg/L，LOQ分別為0.16 、0.50 μg/L，換算成以樣品質量計算LOD分別為0.10 、0.30 μg/kg，LOQ分別為0.32 、1.00 μg/kg（見表2）。

為考察方法的回收率，取不同質量濃度賽拉嗪和DMA的混標溶液加入勻漿后的肉類樣品，使不同樣品間目標物的含量為10、100、1000μg/kg，每個加標樣品設6個平行組。經前處理及LC－MS/MS測定后，計算得到賽拉嗪和DMA的回收率分別為95.6 %～108%和70.3 %～79.5 %，相對標準偏差（RSD）分別為2.6 %～2.8 %和3.1 %～5.0 %（見表2）。

Compound Linear range（μg/L）0.2 ～500 0.2 ～500 r2 Xylazine DMA 0.993 0.99 8 LOD（μg/kg）0.10 0.3 0 LOQ（μg/kg）0.32 1.0 0 Added10μg/kg Recovery（%）95.6 70.3 RSD（%）2.8 5.0 Added100μg/kg Recovery（%）108 72.7 RSD（%）2.6 4.2 Added1000μg/kg Recovery（%）100 79.5 RSD（%）2.8 3.1

2.5 實際樣品的檢測

為驗證本方法的實用性和可靠性，在當地商場選擇10個豬肉樣品，按照本方法對樣品進行凈化后分析其中賽拉嗪和DMA的殘留。結果發現所有樣品均未檢出賽拉嗪，但在1個樣品中檢出DMA，其含量為1.13μg/kg。圖4為該樣品的色譜圖。

圖4 實際樣品測定的色譜圖Fig.4 Chromatogram of an actual sample

3 結 論

本文建立了QuEChERS/液相色譜－串聯質譜測定豬肉中賽拉嗪及其代謝產物DMA的分析方法，并優化了提取溶劑、吸附劑種類和用量以及色譜、質譜分析條件。所建立的方法操作簡單、分析速度快，回收率高，對賽拉嗪和DMA的檢出限分別為0.10 、0.30 μg/kg，能夠滿足實際樣品分析的要求。該方法成功應用于市售豬肉中賽拉嗪和DMA殘留的檢測。