畜禽肉及飼料中氟苯尼考殘留免疫分析方法研究

謝美嬋，楊金易，李 然，肖治理，王 弘，徐振林，孫遠明，沈玉棟

（華南農業大學 食品學院/廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

氟苯尼考（Florfenicol，FF，圖1）是新一代氯霉素類廣譜抗菌藥［1］，具有抗菌廣譜、吸收好、體內分布廣、安全高效等特點。自氯霉素禁用后，氟苯尼考作為氯霉素的替代物，常用于畜禽呼吸道和消化道細菌性感染病的防治［2］。但氟苯尼考具有血液毒性和胚胎毒性等，且隨著使用范圍和劑量加大，細菌也會對其產生耐藥性［3－4］。我國2019年發布的GB31650－2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中規定氟苯尼考在不同動物組織中的殘留限量為0.1 ～30.0 μg/g［5］。然而，隨著畜禽養殖業的發展，氟苯尼考濫用導致其在畜禽體內積累，引發的畜禽食品安全問題日益突出［6］，對人們的健康產生了巨大潛在危害。因此，開發靈敏準確的檢測方法對畜禽產品中的氟苯尼考殘留進行監管至關重要。

圖1 氟苯尼考化學結構Fig.1 Chemical structure of florfenicol

目前，針對氟苯尼考殘留的檢測方法主要是儀器方法［7－9］，這些方法靈敏度高、檢測結果準確可靠，但是前處理要求高、操作專業性強，不能實現高通量現場篩查。免疫分析方法［10］具有低成本、高通量的優點，與大型儀器確證方法優勢互補，顯著提高了畜禽產品及飼料獸藥殘留的檢測效率。近年來，食品中氟苯尼考殘留的免疫分析方法有一定發展，但這些方法多數與同類的氯霉素有顯著交叉反應［11－13］。而氯霉素為禁用獸藥，氟苯尼考是限量獸藥，兩者的檢測要求懸殊，其顯著的交叉反應導致無法判別測定結果。孫法良等［14］建立的雞肉中氟苯尼考殘留檢測的酶聯免疫吸附分析方法與氯霉素等無顯著交叉反應，但半抑制濃度（IC50）僅79.3 ng/mL，靈敏度并不十分理想。

本研究擬在前期基礎上［15］篩選制備針對氟苯尼考的高特異性單克隆抗體，并建立靈敏準確的免疫分析方法，以期為食品安全監管提供技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Multiskan MK3酶標儀（美國Thermo公司）；EYELA旋轉蒸發儀（上海愛郎儀器有限公司）；氮吹儀（康寧科技有限公司）；QP50質譜儀（日本島津公司）；DRX－600NMR核磁共振儀（德國瑞士Bruker公司）；UV－3010紫外可見分光光度計（日本Hitachi公司）。

氟苯尼考、氯霉素、恩諾沙星等標準品（上海麥克林生化科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、碳二亞胺（EDC）、Freund完全佐劑與不完全佐劑、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG抗體（美國Sigma公司）；N，N-二甲基甲酰胺（上海阿拉丁試劑公司）；T液為0.05 mol/L Tris－HCl緩沖液（pH8.0 ）；P液為0.025 mol/L磷酸緩沖液（pH7.5 ）；PBS為0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH7.4 ）；PBST為0.01 mol/L含0.05 %吐溫－20的磷酸緩沖液（pH7.4 ）；其它化學試劑均為國產分析純。半抗原FFD為本實驗室自制［15］（圖2）；小鼠骨髓瘤SP2/0（本實驗室保存）；SPF級BALB/c雌性小鼠購于廣東省醫學實驗動物中心（廣東佛山）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工抗原的制備與鑒定采用活潑酯法［16］將半抗原FFD（圖2）分別與載體蛋白BSA和OVA偶聯制備免疫原FFD－BSA和包被原FFD－OVA，并采用紫外掃描法和三硝基苯磺酸法（TNBS）對抗原進行鑒定和偶聯比測算［17］。

圖2 抗原合成路線圖Fig.2 Synthetic routes of antigens FFD－BSA and FFD－OVA

1.2.2 單克隆抗體的制備與評價參照文獻［18］，使用免疫原FFD－BSA平行免疫3只6～8周齡的雌性Balb/c小鼠，3免后對小鼠進行尾靜脈取血，通過間接競爭酶聯免疫吸附分析方法（icELISA）對抗血清性能進行評價，選用免疫應答最好的小鼠的脾臟與SP2/0進行融合［19－20］，將篩選到的細胞株進行體外培養和腹水制備，經飽和硫酸銨沉淀法［21］分離純化后保存至－20℃冰箱備用。采用酶聯免疫吸附分析方法（ELISA）對抗體效價和抑制率進行測定評價。

1.2.3 icELISA方法的建立 參考文獻［18］，采用棋盤法選擇A450nm在1.0 ～1.5 之間的包被原質量濃度（0.125 、0.083 、0.0625 、0.05 μg/mL）和抗體質量濃度（0.167 、0.125 、0.1 、0.083 μg/mL）組合進行抑制曲線繪制，并根據IC50確定最佳包被原質量濃度與抗體質量濃度；然后，采用單因素實驗優化藥物和抗體稀釋液（PBST、T液、P液、PBS）、抗體稀釋液吐溫－20含量（0.05 %、0.1 %、0.2 %、0.5 %）、一抗競爭反應時間（20、30、40、50min）、酶標二抗稀釋液（P液、T液、PBST、PBS）、初始質量濃度為1μg/mL的酶標二抗稀釋倍數（4000、5000、6000、7000倍）、酶標二抗反應時間（20、30、40、50min）等影響因素。最佳反應條件應具備適當的吸光值（Amax）、較低的IC50和較高的Amax/IC50比值。Amax/IC50越高，IC50越低，即靈敏度越高，綜合最佳反應條件建立氟苯尼考的icELISA標準曲線，其中，縱坐標B、B0分別表示添加和未添加氟苯尼考時的吸光度，橫坐標為靶標藥物質量濃度。

1.2.4 抗體的特異性以抗體對標準品靶標藥物的IC50值為參照，采用以下公式測算結構及功能類似物的交叉反應率（CR）：

CR（%）=［IC50（FF）/IC50（FF類似物）］×100%

1.2.5 穩定性試驗精密度與穩定性是評價免疫檢測試劑盒可靠性與應用性的重要參數。取不同時間包被的酶標板在同一時間進行icELISA實驗，考察方法的精密度；同時將試劑盒置于37℃進行保存時間測試實驗，在第0、2、4、6d各測定一次并繪制標準曲線，考察方法的穩定性。分別計算不同批次板和不同存放時間的IC50、Amax、IC20～IC80。

1.2.6 前處理及加標回收實驗肉組織樣品：稱取3g打碎后的空白肉樣于15mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯和適量NaCl沉淀蛋白，振蕩混勻5min后4000r/min離心5min，共提取2次。合并的上清液經氮氣吹干后加入3mL PBS及3mL正己烷，混勻后4000r/min離心5min，PBS層備用。

飼料樣品：稱取空白動物飼料1g于15mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯，混勻后于4℃下4000r/min離心10min，共提取2次。合并上清液經氮氣吹干后加入1mL正己烷和1mL PBS，振蕩混勻后4000r/min離心10min，PBS層備用。

根據所建立icELISA方法的靈敏度與樣品處理情況，將上述制備的空白樣品分別添加高、中、低3種濃度水平的氟苯尼考標準品，按照3孔平行，以icELISA進行測定，計算加標回收率及相對標準偏差（RSD）。

1.2.7 儀器確證方法比對采用中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準（SN/T1865－2016）［22］和農業部2483號公告－8－2016的HPLC－MS/MS方法［23］，對樣品中的氟苯尼考進行檢測，并與icELISA方法結果進行確證比對。

2 結果與討論

2.1 人工抗原制備與鑒定

載體蛋白和半抗原在紫外掃描下會表現出各自不同的特征吸收峰，半抗原成功偶聯載體蛋白后，分子間通過共價鍵產生共軛與電子轉移，導致峰形或峰位發生一定變化，基于此可判斷人工抗原是否偶聯成功［16］。UV－Vis圖譜顯示（圖3），免疫原FFD－BSA的特征吸收峰變寬，且從BSA的280nm紅移至287nm；包被原FFD－OVA的特征吸收峰也變寬，并從OVA的280nm紅移至286nm，峰形及峰位與半抗原、載體蛋白區別明顯。說明免疫原和包被原均合成成功。另外，用TNBS法測得標準載體蛋白BSA和OVA氨基消耗數量的標準曲線分別為y=0.1181 x（r2=0.9981 ）和y=0.0516 x（r2=0.9913 ），經測算得到人工抗原FFD－BSA和FFD－OVA的偶聯比分別為12∶1和17∶1。

圖3 半抗原、載體蛋白及人工抗原的紫外光譜Fig.3 Ultraviolet spectra of haptens，carrier protein and synthesized antigens

2.2 抗血清評價與單克隆抗體制備

第3次免疫后，檢測鼠抗血清效價和抑制率［17］。結果顯示，在1μg/mL包被原和1μg/mL氟苯尼考藥物濃度下，3只平行實驗小鼠抗血清的效價/抑制率分別為128k/74%、64k/75%和128k/70%。效價和抑制率越高，說明該抗血清的親和力和識別氟苯尼考的靈敏度越好。因此，選取效價/抑制率為128k/74%的小鼠進行細胞融合。通過ELISA篩選，獲得了細胞上清效價/抑制率為128k/92%的細胞株，并進一步通過細胞體外培養、腹水制備、純化得到氟苯尼考單克隆抗體，用于后續實驗。

2.3 標準曲線的建立

以Amax/IC50、IC50和Amax值作為考察依據［17］，確定最佳工作條件為：包被抗原質量濃度為0.05 μg/mL，抗體質量濃度為0.1 μg/mL（稀釋10000倍），最佳藥物、抗體和二抗稀釋液均為PBST，抗體稀釋液的最佳吐溫－20含量為0.05 %，競爭反應時間為30min，二抗質量濃度為0.167 μg/mL（稀釋6000倍），二抗反應時間為30min。在該最佳條件下，建立氟苯尼考的icELISA標準曲線（圖4），其對氟苯尼考的IC50為9.48 ng/mL，線性檢測范圍（IC20～IC80）為1.75 ～51.36 ng/mL，檢 出 限（IC10，LOD）為0.64 ng/mL。

圖4 氟苯尼考的icELISA標準曲線（n=3）Fig.4 Dose?response curve for florfenicol in icELISA（n=3）

2.4 特異性分析

測定抗體對類似物的交叉反應率（CR）可以評價抗體的特異性，CR越小說明抗體對靶標藥物的特異性越高。實驗結果表明，以氟苯尼考為參照，所建立的icELISA方法與氟苯尼考的CR為100%，與其它結構功能類似物氯霉素、氟苯尼考胺、恩諾沙星、西諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、呋喃他酮、呋喃西林、四環素、磺胺二甲嘧啶基本不存在交叉反應，說明所建立的icELISA方法對氟苯尼考具有良好特異性。

2.5 精密度與穩定性

按照“1.2.5 ”考察icELISA方法的精密度和穩定性。結果表明，批次間IC50的平均值為5.19 ng/mL，Amax平均值為1.13 ，RSD＜7.5 %；不同存放天數間的IC50平均值為5.25 ng/mL，Amax平均值為1.36 ，RSD＜7.5 %。上述實驗結果說明所建立的方法精密度和穩定性良好。

2.6 基質干擾效應消除

樣品經“1.2.6 ”前處理后用PBST稀釋適當倍數，以氟苯尼考做標準品進行icELISA測定并繪制標準曲線，考察基質效應消除情況。結果表明：豬肉、雞飼料和豬飼料基質用PBST稀釋5倍，牛肉、雞肉基質用PBST稀釋10倍后，基質條件下抑制曲線與氟苯尼考標準曲線均能基本重合，樣品基質效應基本消除。

2.7 加標回收實驗

選擇豬肉、雞肉、牛肉、雞飼料和豬飼料5種陰性空白樣品，添加高、中、低3個濃度水平，按“1.2.6”處理后將提取液稀釋相應倍數，用icELISA方法和HPLC－MS/MS法分別檢測其回收率。結果表明（表1）：icELISA方法的加標回收率為88.1 %～107%，RSD＜15%，與HPLC－MS/MS結果一致。說明建立的icELISA方法測定結果準確可靠。

表1 氟苯尼考樣品的加標回收率及相對標準偏差（n=3）Table1 Recoveries and RSDs of florfenicol in blank samples（n=3）

2.8 盲樣檢測

在當地超市及市場隨機購買豬肉、雞肉、牛肉、雞飼料和豬飼料共15份樣品，前處理后進行檢測，其中4份檢出氟苯尼考殘留，但均低于50μg/kg，小于國家標準規定的最低限量值100μg/kg［5］，因此均可判定為陰性。該結果與HPLC－MS/MS的測判結果一致，說明建立的icELISA方法可用于真實樣品中氟苯尼考殘留量的測定。

3 結 論

本研究基于特異性單克隆抗體，建立了畜禽肉及與飼料樣品中氟苯尼考殘留的icELISA檢測方法，其檢出限達0.64 ng/mL，且與其它結構功能類似物無明顯交叉，特異性良好。樣品的加標回收率為88.1 %～107%，與HPLC－MS/MS法檢測結果一致，適用于動物源性食品及飼料中氟苯尼考的快速檢測。