實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用于新型冠狀病毒檢測(cè)的效果分析

袁紅福

(甘肅省金昌市疾病預(yù)防控制中心，甘肅 金昌 737100)

自2019 年12 月開(kāi)始，湖北武漢及我國(guó)其他地區(qū)相繼爆發(fā)一種以發(fā)熱、乏力、干咳為主要癥狀的呼吸系統(tǒng)疾病，后通過(guò)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，確定病原體是一種新冠病毒。新冠病毒感染所致的肺炎即新冠肺炎在各年齡段普遍易感，傳播途徑主要是經(jīng)飛沫及密切接觸傳播。2020 年1 月30 日發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療快速建議指南(標(biāo)準(zhǔn)版)》指出[1]，呼吸道或血液標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反 應(yīng)（quantitative Real -time polymerase chain reaction，qPCR）檢測(cè)新冠病毒或病毒基因測(cè)序與已知的新冠病毒高度同源兩者滿足其一便可確診病例。病原學(xué)檢測(cè)為確診新冠病毒的金標(biāo)準(zhǔn)，但其檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，步驟繁瑣，且對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求相對(duì)較高，故使得qPCR 的核酸檢測(cè)成為現(xiàn)階段新冠肺炎診斷中最為廣泛應(yīng)用的一種手段[2]。本研究將qPCR 應(yīng)用于疾控中心新冠病毒檢測(cè)中的情況匯報(bào)如下。

1 材料

1.1 標(biāo)本來(lái)源

采集篩查2020 年2 月至6 月疫情期間有發(fā)熱癥狀、有湖北工作、旅居史者的咽拭子標(biāo)本15650份，其中男性9359 例，女性6291 例；年齡7～79 歲，平均（48.31±8.09）歲。

1.2 試劑與儀器

核酸提取儀采用江蘇碩世Smart64 核酸提取儀和西安天隆Smart32 核酸提取儀。擴(kuò)增儀采用安捷倫Mx3000 P 型和賽默飛ABI Q5 型PCR 儀。

1.3 方法

1.3.1 采樣

采集受檢者咽拭子樣本，通過(guò)使用植絨拭子于咽峽深部反復(fù)刮取得到。采樣成功后，將咽拭子置于細(xì)胞保存液并及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。因采集樣本質(zhì)量與核酸檢測(cè)結(jié)果直接相關(guān)，故應(yīng)確保采集操作準(zhǔn)確，如把握采集力度、采集部位正確等。

1.3.2 核酸提取及qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)

通過(guò)使用磁珠法對(duì)核酸進(jìn)行提取，所用儀器為西安天隆基因的Smart32 核酸提取儀和江蘇碩士基因的Smart64 核酸提取儀，試劑盒包含裂解液、蛋白酶K 溶液、磁珠分散液、洗滌液、洗脫液。應(yīng)用qPCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qPCR，相關(guān)操作均嚴(yán)格依照試劑盒說(shuō)明書(shū)開(kāi)展，每種病毒的qPCR 體系均使用PCR反應(yīng)液20μL（包含A17μL、B3μL）及核酸提取液5μL。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所的官網(wǎng)于2020 年1 月21 日發(fā)布自行設(shè)計(jì)的新冠病毒核酸檢測(cè)引物和熒光探針序列，其第一對(duì)、第二對(duì)引物與探針?lè)謩e針對(duì)ORF1ab 及N 基因所設(shè)計(jì)，詳見(jiàn)表1。用ABIQ5 型，MXX3000PPCR 儀對(duì)新冠病毒進(jìn)行qPCR 核酸檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：50℃15 min，95℃15min，1 個(gè)循環(huán)；94℃15s，55℃45s，40 個(gè)循環(huán)。

表1 新型冠狀病毒核酸檢測(cè)引物與探針序列

1.3.3 結(jié)果判定

實(shí)驗(yàn)要設(shè)置一個(gè)陰性質(zhì)控及一個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控。用ABIQ5 型，安捷倫Mx3000P 型qPCR 儀及自配的軟件來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并做分析。如無(wú)Ct 值或Ct 值在40 以上則判定為陰性；如Ct 值在37 以下則判定為陽(yáng)性；如Ct 值為37～40，則建議再做一次實(shí)驗(yàn)，如實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct 值在40 以下，且擴(kuò)增曲線起峰明顯，則判定為陽(yáng)性，反之判定為陰性[3]。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)室安全監(jiān)管

正確使用防護(hù)服、KN95 防護(hù)口罩、護(hù)目鏡、防護(hù)手套、鞋套等安全防護(hù)用品，并按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)工作流程進(jìn)行制定，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行合理的功能分區(qū)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的垃圾一律視為傳染性垃圾，用雙層黃色醫(yī)療垃圾袋密閉包裝后帶出實(shí)驗(yàn)室，并交給專人予以高壓滅菌等處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示。

2 結(jié)果

15650份檢測(cè)標(biāo)本中，陽(yáng)性1例，陽(yáng)性率0.0064%。

3 討論

人體在受到新冠病毒感染后一般會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、干咳、乏力等癥狀，部分重癥患者可出現(xiàn)膿毒癥休克、代謝性酸中毒、多器官功能衰竭等，可致其生命受到極大威脅。因此，應(yīng)及早發(fā)現(xiàn)新冠肺炎進(jìn)行隔離治療，使患者獲得理想預(yù)后，阻斷病毒的大范圍傳播。qPCR 是一種具有超靈敏度、超特異性、成本低等優(yōu)勢(shì)的核酸檢測(cè)技術(shù)，在新冠肺炎診斷中應(yīng)用頻度較高[4]。本研究利用qPCR 方法篩查有湖北工作、旅居史者，以及羈押人員、住院病人、海鮮產(chǎn)品銷(xiāo)售等有關(guān)人員咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新冠病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為0.0064%。

自我國(guó)對(duì)外公布新冠病毒的基因組序列數(shù)據(jù)后，一些公司競(jìng)相研發(fā)對(duì)新冠病毒基因組實(shí)現(xiàn)有效檢測(cè)的qPCR 體系。qPCR 體系關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)出靈敏度高、特異性強(qiáng)的引物與探針序列，既實(shí)現(xiàn)對(duì)新冠病毒基因組序列的高效擴(kuò)增，又將新冠病毒基因組同229E、OC43、NC63 等既往流行的冠狀病毒與流感病毒的基因組有效區(qū)分開(kāi)[5-6]。香港大學(xué)與北京疾病預(yù)防控制中心針對(duì)新冠病毒建立了qPCR 體系，其2 套引物與探針?lè)謩e針對(duì)新冠病毒的ORF1ab 及N 基因所設(shè)計(jì)。qPCR 體系檢測(cè)靈敏度較強(qiáng)，可檢測(cè)出拷貝數(shù)低至10 的DNA 分子。利用此體系檢測(cè)1例新冠病毒感染者的咽拭子標(biāo)本，結(jié)果呈陽(yáng)性。而其他常見(jiàn)冠狀病毒的采集標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果呈陰性，提示特異性較好[7]。

現(xiàn)階段，已有多家企業(yè)生產(chǎn)新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒。盡管基于qPCR 體系的核酸檢測(cè)試劑盒的使用原理大致相似，但其性能存在一定差別。如某研究小組采集1 例弱陽(yáng)性患者咽拭子標(biāo)本，利用6種國(guó)產(chǎn)核酸檢測(cè)試劑盒開(kāi)展平行檢測(cè)，結(jié)果顯示[8]，僅有2 種試劑盒可同時(shí)擴(kuò)增ORF1ab、N 基因等2段基因序列，而其余幾家核酸檢測(cè)試劑盒僅能擴(kuò)增1 段基因序列。且6 家試劑盒批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)的結(jié)果不相同，變異系數(shù)最差為0.23，最佳為5.84。伴隨病情發(fā)展，僅有3 家試劑盒能定量反映出病毒拷貝數(shù)的增加。提示各家核酸檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)能力仍有進(jìn)步上升的空間。另外，為盡可能減少假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，需做到如下幾點(diǎn)：（1）安排技術(shù)水平高的人員進(jìn)行新冠病毒檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)改進(jìn)標(biāo)本采集的手段及其運(yùn)輸條件等，分析病情所處的階段[9]；（2）盡量選擇獲得國(guó)家藥械注冊(cè)證的試劑盒，在使用早期，不宜盲目信任一家生產(chǎn)的試劑盒，而將其他家生產(chǎn)的試劑盒全盤(pán)否認(rèn)，而是應(yīng)綜合考量[10]。

綜上所述，基于qPCR 的核酸檢測(cè)在新冠肺炎診斷中起著重要作用，可有效準(zhǔn)確檢測(cè)出咽拭子標(biāo)本中的新冠病毒核酸，對(duì)于檢疫防疫工作的開(kāi)展大有助益。