實時熒光定量PCR 用于新型冠狀病毒檢測的效果分析

袁紅福

(甘肅省金昌市疾病預防控制中心，甘肅 金昌 737100)

自2019 年12 月開始，湖北武漢及我國其他地區相繼爆發一種以發熱、乏力、干咳為主要癥狀的呼吸系統疾病，后通過實驗室分離鑒定，確定病原體是一種新冠病毒。新冠病毒感染所致的肺炎即新冠肺炎在各年齡段普遍易感，傳播途徑主要是經飛沫及密切接觸傳播。2020 年1 月30 日發布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療快速建議指南(標準版)》指出[1]，呼吸道或血液標本實時熒光定量聚合酶鏈反 應（quantitative Real -time polymerase chain reaction，qPCR）檢測新冠病毒或病毒基因測序與已知的新冠病毒高度同源兩者滿足其一便可確診病例。病原學檢測為確診新冠病毒的金標準，但其檢驗周期長，步驟繁瑣，且對檢測人員的技術要求相對較高，故使得qPCR 的核酸檢測成為現階段新冠肺炎診斷中最為廣泛應用的一種手段[2]。本研究將qPCR 應用于疾控中心新冠病毒檢測中的情況匯報如下。

1 材料

1.1 標本來源

采集篩查2020 年2 月至6 月疫情期間有發熱癥狀、有湖北工作、旅居史者的咽拭子標本15650份，其中男性9359 例，女性6291 例；年齡7～79 歲，平均（48.31±8.09）歲。

1.2 試劑與儀器

核酸提取儀采用江蘇碩世Smart64 核酸提取儀和西安天隆Smart32 核酸提取儀。擴增儀采用安捷倫Mx3000 P 型和賽默飛ABI Q5 型PCR 儀。

1.3 方法

1.3.1 采樣

采集受檢者咽拭子樣本，通過使用植絨拭子于咽峽深部反復刮取得到。采樣成功后，將咽拭子置于細胞保存液并及時送往實驗室檢測。因采集樣本質量與核酸檢測結果直接相關，故應確保采集操作準確，如把握采集力度、采集部位正確等。

1.3.2 核酸提取及qPCR 擴增反應

通過使用磁珠法對核酸進行提取，所用儀器為西安天隆基因的Smart32 核酸提取儀和江蘇碩士基因的Smart64 核酸提取儀，試劑盒包含裂解液、蛋白酶K 溶液、磁珠分散液、洗滌液、洗脫液。應用qPCR檢測試劑盒進行qPCR，相關操作均嚴格依照試劑盒說明書開展，每種病毒的qPCR 體系均使用PCR反應液20μL（包含A17μL、B3μL）及核酸提取液5μL。中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所的官網于2020 年1 月21 日發布自行設計的新冠病毒核酸檢測引物和熒光探針序列，其第一對、第二對引物與探針分別針對ORF1ab 及N 基因所設計，詳見表1。用ABIQ5 型，MXX3000PPCR 儀對新冠病毒進行qPCR 核酸檢測，擴增反應參數：50℃15 min，95℃15min，1 個循環；94℃15s，55℃45s，40 個循環。

表1 新型冠狀病毒核酸檢測引物與探針序列

1.3.3 結果判定

實驗要設置一個陰性質控及一個陽性質控。用ABIQ5 型，安捷倫Mx3000P 型qPCR 儀及自配的軟件來繪制標準曲線并做分析。如無Ct 值或Ct 值在40 以上則判定為陰性；如Ct 值在37 以下則判定為陽性；如Ct 值為37～40，則建議再做一次實驗，如實驗結果Ct 值在40 以下，且擴增曲線起峰明顯，則判定為陽性，反之判定為陰性[3]。

1.3.4 實驗室安全監管

正確使用防護服、KN95 防護口罩、護目鏡、防護手套、鞋套等安全防護用品，并按照國家標準要求對核酸檢測實驗室的檢測工作流程進行制定，并對實驗室進行合理的功能分區。實驗室內的垃圾一律視為傳染性垃圾，用雙層黃色醫療垃圾袋密閉包裝后帶出實驗室，并交給專人予以高壓滅菌等處理。

1.4 統計學方法

應用SPSS20.0 軟件處理數據，計數資料用百分率（%）表示。

2 結果

15650份檢測標本中，陽性1例，陽性率0.0064%。

3 討論

人體在受到新冠病毒感染后一般會出現發熱、干咳、乏力等癥狀，部分重癥患者可出現膿毒癥休克、代謝性酸中毒、多器官功能衰竭等，可致其生命受到極大威脅。因此，應及早發現新冠肺炎進行隔離治療，使患者獲得理想預后，阻斷病毒的大范圍傳播。qPCR 是一種具有超靈敏度、超特異性、成本低等優勢的核酸檢測技術，在新冠肺炎診斷中應用頻度較高[4]。本研究利用qPCR 方法篩查有湖北工作、旅居史者，以及羈押人員、住院病人、海鮮產品銷售等有關人員咽拭子標本進行檢測，發現新冠病毒核酸檢測陽性率為0.0064%。

自我國對外公布新冠病毒的基因組序列數據后，一些公司競相研發對新冠病毒基因組實現有效檢測的qPCR 體系。qPCR 體系關鍵在于設計出靈敏度高、特異性強的引物與探針序列，既實現對新冠病毒基因組序列的高效擴增，又將新冠病毒基因組同229E、OC43、NC63 等既往流行的冠狀病毒與流感病毒的基因組有效區分開[5-6]。香港大學與北京疾病預防控制中心針對新冠病毒建立了qPCR 體系，其2 套引物與探針分別針對新冠病毒的ORF1ab 及N 基因所設計。qPCR 體系檢測靈敏度較強，可檢測出拷貝數低至10 的DNA 分子。利用此體系檢測1例新冠病毒感染者的咽拭子標本，結果呈陽性。而其他常見冠狀病毒的采集標本進行檢測時，結果呈陰性，提示特異性較好[7]。

現階段，已有多家企業生產新冠病毒核酸檢測試劑盒。盡管基于qPCR 體系的核酸檢測試劑盒的使用原理大致相似，但其性能存在一定差別。如某研究小組采集1 例弱陽性患者咽拭子標本，利用6種國產核酸檢測試劑盒開展平行檢測，結果顯示[8]，僅有2 種試劑盒可同時擴增ORF1ab、N 基因等2段基因序列，而其余幾家核酸檢測試劑盒僅能擴增1 段基因序列。且6 家試劑盒批內重復檢測的結果不相同，變異系數最差為0.23，最佳為5.84。伴隨病情發展，僅有3 家試劑盒能定量反映出病毒拷貝數的增加。提示各家核酸檢測試劑盒的檢測能力仍有進步上升的空間。另外，為盡可能減少假陰性、假陽性結果的出現，需做到如下幾點：（1）安排技術水平高的人員進行新冠病毒檢測，同時應改進標本采集的手段及其運輸條件等，分析病情所處的階段[9]；（2）盡量選擇獲得國家藥械注冊證的試劑盒，在使用早期，不宜盲目信任一家生產的試劑盒，而將其他家生產的試劑盒全盤否認，而是應綜合考量[10]。

綜上所述，基于qPCR 的核酸檢測在新冠肺炎診斷中起著重要作用，可有效準確檢測出咽拭子標本中的新冠病毒核酸，對于檢疫防疫工作的開展大有助益。