基于網絡藥理學和分子對接分析三七-紅花藥對抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制

王路瑤，杜廷海，靳新悅，李俊楠，張露苗

急性心肌梗死是一種嚴重的心血管疾病，最終會導致心肌的缺血性壞死，目前最有效的治療措施是及時進行心肌血流灌注，以顯著減少心肌梗死面積，改善臨床預后。但有時缺血后再灌注不僅不能使組織器官功能恢復，反而會出現心肌能量代謝障礙、超微結構的變化和血管無復流等現象，加重功能障礙和結構損傷，這種現象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。迄今為止，MIRI仍是臨床上難以解決的問題。中醫學中活血化瘀類中藥對心血管疾病療效顯著，研究活血化瘀類中藥對MIRI的相關機制及作用靶點為治療此類疾病開辟了新的思路。三七為五加科植物三七 Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根，味甘、微苦，性溫，歸肝、胃經，具有化瘀止血、活血定痛之效，可用于人體內各種出血，尤以有瘀滯者為宜；現代研究發現三七具有抗血小板聚集、溶栓、抗心律失常等作用[2]。紅花為菊科植物紅花 Carthamus tinctorius L.的籬狀花冠，味辛，性溫，歸心、肝經，具有活血通經、祛瘀止痛之效，可用于胸痹心痛、血瘀腹痛、癥瘕積聚等證；現代研究發現紅花具有增加冠狀動脈流量、改善心肌缺血、縮小心肌梗死范圍、抗心律失常等作用[2]。網絡藥理學是以系統生物學為基礎，在疾病-基因-靶點-藥物相互作用網絡的基礎上通過網絡分析，系統綜合地揭示多分子藥物協同作用于人體的機制，進而指導藥物研發及藥理作用研究。分子對接技術是通過化學計量學方法模擬分子的幾何匹配和能量匹配，來尋找小分子(配體)與生物大分子(受體)之間最佳結合模式的過程，分子對接在中藥活性成分的虛擬篩選和確定作用靶標等方面已展現出獨特的優勢[3]。本研究采用網絡藥理學方法從系統、整體水平探究三七-紅花藥對抗MIRI“多因、多效、多靶點”的作用機制，并通過分子對接技術對藥物活性成分和疾病核心靶點進行分子對接，以期為深入開展三七-紅花藥對抗MIRI的基礎實驗研究及臨床合理應用提供研究思路。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)是一個融合了藥物化學、藥代動力學、藥物-靶標-疾病網絡的藥理學平臺，包含了499味草藥以及29 384種化合物成分、3 311種作用靶點和837種相關疾病[4]。Uniprot數據庫是國際上序列數據最完整、注釋信息最豐富的非冗余蛋白質序列數據庫。通過檢索TCMSP數據庫得到三七和紅花的所有化合物成分，通過頁面的過濾器圖標自定義篩選結果，選擇化合物分子的篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，篩選出活性成分較高的化合物，利用TCMSP平臺得到有效成分的靶點蛋白，并在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)將預測出的靶點蛋白名轉換為基因名。

1.2 MIRI相關靶點獲取 人類基因數據庫(GeneCards，https://www.Genecards.org/)是一個全面提供所有有關人類基因注釋和預測信息的基因數據庫，在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/)是涵蓋關于人類遺傳病和基因等信息的數據庫。通過檢索GeneCard數據庫、OMIM 數據庫收集與MIRI相關的所有靶點，數據庫以關鍵詞“myocardial ischemia reperfusion injury”進行搜索，收集整合與MIRI相關的靶點基因。

1.3 藥物-疾病靶點網絡構建及可視化分析 為明確“三七-紅花”與MIRI潛在靶點間的相互作用，利用Venn在線軟件將藥物與疾病靶點取交集，通過Venn圖的形式展現藥物靶點與疾病靶點間的潛在靶點基因，運用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析并繪制網絡圖。

1.4 靶點蛋白交互作用(protein protein interaction，PPI)網絡的構建 基于String數據庫獲取高置信度的交集PPI信息，運用Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI網絡，利用Network Analyzer工具進行拓撲學分析。根據介度(betweenness centrality，BC)、緊密度(closeness centrality，CC)及連接度(Degree)的中位數來篩選化合物-靶點網絡核心節點。

1.5 成分-靶點分子對接驗證 分別從三七和紅花的有效成分中選取度值排名前5位成分(1個成分重復)與度值排名前10位的核心靶點進行分子對接，從RCSB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載相關蛋白的結構，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock軟件進行加氫、加電子等操作。從ChemicalBook數據庫(https://www.chemicalbook.com/)中下載化合物結構，并使用AutoDock軟件進行加氫、加電子、加ROOT等操作，得到結果中每個蛋白結合能最低的兩組，使用Pymol軟件對得到的最佳結果進行繪圖。

1.6 基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 以人類為研究對象，利用Bioconductor R軟件包對不同模塊的靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析，分析不同模塊靶點基因的生物學意義，從而分析藥物治療疾病的可能機制。

2 結 果

2.1 “三七-紅花”的有效成分及作用靶點 TCMSP數據庫中共篩選出30個候選化合物，其中三七8個、紅花22個，去除重復項，共得到27個候選化合物，詳見表1。利用TCMSP數據庫獲得有效成分的相應靶點蛋白，并在Uniprot數據庫將預測出的靶點蛋白名轉換為基因名，去除重復項并刪除非人源靶點后，最終得到三七-紅花藥對有效成分相應靶點基因203個。

表1 三七-紅花的有效活性成分

2.2 MIRI靶點的篩選 通過GeneCards數據庫得到MIRI相關靶點1 223個，通過篩選設置relevance score≥6，最終獲得472個相關靶點。從OMIM數據庫得到與MIRI相關靶點52個，篩重后共獲得疾病相關靶點511個。

2.3 化合物-靶點的網絡構建及可視化分析 利用Venny在線分析軟件將“三七-紅花”的活性化合物對應的203個藥物靶點與MIRI的511個疾病靶點取交集，通過Venn圖(見圖1)的形式得到81個共同靶點。將81個共同靶點通過Cytoscape 3.7.2軟件構建三七和紅花“化合物-靶點”的可視化網絡圖(見圖2)。由圖2可見，節點分別表示三七-紅花的活性成分與疾病作用靶標，而圖中多個靶標可對應相同的活性成分，一個靶標也可與不同的活性成分相對應，說明三七-紅花藥對抗MIRI具有多成分、多靶標的特點。

圖1 三七-紅花有效成分靶點和MIRI相關靶點關系的Venn圖

圖2 化合物-靶點可視化網絡圖

2.4 靶點蛋白PPI網絡的構建及核心靶點的篩選 利用String數據庫和Cytoscape 3.7.2軟件構建的高置信度交集靶點蛋白PPI網絡見圖3，網絡共有81個節點和1 425條邊。拓撲學分析結果顯示，網絡Degree中位數為35，BC中位數為0.002 888 82，CC中位數為0.640 000 00，滿足上述參數卡值的靶點分別為趨化因子CC基元配體(CCL2)、白細胞介素6(IL-6)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、基質金屬肽酶9(MMP9)等39個靶點可作為治療作用的核心靶點，在治療作用中可能發揮了重要作用。詳見表2。

圖3 三七-紅花藥對抗MIRI相關靶點的PPI網絡

表2 三七-紅花藥對抗MIRI相關靶點蛋白PPI網絡中核心靶點拓撲學分析結果

2.5 分子對接結果 篩選的度值排名前10位的核心靶點與9個關鍵藥效成分對接結果見圖4，表3中詳細列出9個關鍵藥效成分的基本信息。其中，胡蘿卜素(beta-carotene)因分子量太大，無法與大分子蛋白對接。其中橫坐標為靶蛋白，縱坐標為化合物，顏色的深淺代表最低結合能的大小。所有分子與標靶蛋白的最低結合能都小于0，說明配體與受體可以自發結合，最低結合能越小說明分子與靶點蛋白結合越好。對接結果顯示，IL-6、AKT1、MMP9、CCL2最低結合能小于-5.0 kJ/mol，說明以上9個核心活性成分與以上靶點蛋白結合較好。對三七-紅花與上述核心靶點蛋白對接結果進行可視化，三七-紅花9個關鍵藥效成分中baicalein和靶點IL-6、木犀草素(luteolin)和靶點MMP9、甘草素(Liquiritigenin)與靶點CCL2分別形成氫鍵的數目為3個、5個、2個，而豆甾醇(Stigmasterol)和靶點AKT1之間沒有氫鍵相互作用。詳見圖5。

圖4 靶點-活性成分最低結合熱圖

表3 三七-紅花9個核心成分基本信息

圖5 4個核心蛋白分子與9個核心成分對接結果可視化

2.6 三七-紅花藥對抗MIRI的GO功能和KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析 利用Bioconductor R軟件包對81個靶點進行GO富集分析，以P<0.01為篩選標準，得出1 284個生物學過程(biological process，BP)，主要包括對氧含量的反應、對脂多糖的反應、氧化應激反應、凋亡信號通路的調控、循環系統中的血管過程、凝血、止血等；32個細胞組成(cellular component，CC)，包括局灶性粘連、細胞-基質黏附連接、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、轉錄因子復合物、線粒體外膜等；67個分子功能(molecular function，MF)，包括細胞因子受體結合、泛素樣蛋白連接酶結合、支架蛋白結合、半胱氨酸型內肽酶活性與細胞凋亡的關系、受體配體活性、DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、內肽酶活性等，各類別前20位的通路見圖6，表明三七-紅花藥對可以通過參與調控多種生物學過程而發揮抗MIRI作用。

2.6.2 KEGG通路富集分析 利用Bioconductor R軟件包對81個靶點進行KEGG通路富集分析，以P<0.01為篩選標準，共富集125條通路，排名前20位的通路見圖7。主要富集的通路為流體剪切應力與動脈粥樣硬化、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號通路、核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)樣受體信號通路、腫瘤壞死因子信號途徑、細胞凋亡、C型凝集素受體信號通路、Toll樣受體信號通路、Janus激酶2/信號轉導及轉錄激活因子3(JAK2/STAT3)信號通路，并與胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、小細胞肺癌等癌癥通路有相關性。將篩選出來的前20個KEGG信號通路和靶點基因導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“靶點-通路”的可視化網絡圖，詳見圖8。以上研究結果表明，三七-紅花藥對的活性成分靶點分布于不同的路徑，可通過各通路協調發揮抗MIRI作用。

圖7 三七-紅花作用靶點KEGG富集分析的前20條通路

圖8 關鍵靶基因KEGG通路富集分析

3 討 論

中醫學沒有MIRI的相關描述，根據其病位和臨床表現可以歸屬于“胸痹”“心悸”“真心痛”等范疇。MIRI的中醫病機屬于各種病因所致的心脈痹阻，常虛實夾雜[5]，但以氣虛為本，貫穿整個MIRI的病理過程，血瘀、痰飲為標，其中血瘀為重，痰飲為輕[6]，故治療上應以補虛為主，兼以活血化瘀、豁痰宣痹，其中活血化瘀治法有重要作用，三七-紅花為此治法的有效藥對之一。三七功善化瘀止血、活血定痛之效；紅花功善活血通經、祛瘀止痛；二藥相合，共增活血化瘀之功效?，F代臨床研究發現三七-紅花有效組分復方通過抗炎和抗凋亡發揮對心肌梗死大鼠的保護作用[7]，可提高對人肝微粒體中UDP-葡萄糖醛酸轉移酶的3種主要同工型的抑制能力[8]。但是對于三七-紅花藥對抗MIRI的所有潛在靶標、相關機制及分子層面的研究仍有欠缺。本研究基于多成分、多靶點作用的研究思路，應用網絡藥理學技術和分子對接技術，分析和驗證三七-紅花藥對抗MIRI的作用機制。

本研究共收集“三七-紅花”主要活性成分27個，包括皂苷類、木脂素、黃芩素、黃芩苷、槲皮素、山奈酚、木犀草素等。相關研究表明人參皂苷Rh2可改善高脂大鼠氧化應激與炎癥水平，增加大鼠心肌缺血再灌注后外周血內皮祖細胞數量，從而保護受損心肌[9]；槲皮素可降低MIRI大鼠的乳酸脫氫酶水平、心室期前收縮、心動過速、心室顫動的數量和持續時間以及心律不齊的嚴重程度，說明槲皮素在MIRI過程中具有抗心律失常作用[10]。實驗研究發現木脂素可能通過抑制中性粒細胞浸潤或影響血脂代謝而對高脂血癥大鼠MIRI有一定的保護作用[11]。黃芩素具有很強的抗氧化作用，黃芩素聯合棕櫚酰乙醇酰胺治療可減少心肌組織損傷、中性粒細胞浸潤、肥大細胞活化表達的標志物(糜酶和類胰蛋白酶)和促炎性細胞因子的產生[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)]，降低應激氧化并調節核因子-κB(NF-κB)和細胞凋亡途徑[12]。黃芩苷通過促進PI3K釋放一氧化氮來保護MIRI大鼠的心肌微血管內皮細胞[13]。山奈酚通過降低晚期糖基化產物(AGE)-晚期糖基化終末產物受體(RAGE)/MAPK誘導的氧化應激和炎癥反應減輕糖尿病大鼠的MIRI[14]。木犀草素可通過內皮一氧化氮合酶相關的抗氧化反應減輕糖尿病心臟的缺血/再灌注損傷[15]。本研究基于String交互作用網絡數據庫構建三七-紅花藥對抗MIRI靶點交互作用網絡，篩選出39個核心靶點，分析發現IL-6、白蛋白(ALB)、AKT1、血管內皮生長因子A(VEGFA)、MAPK8、MMP9、半胱氨酸蛋白酶3基因(CASP3)等是網絡關鍵核心靶點，可能在三七-紅花藥對抗MIRI中發揮重要作用。結合分子對接結果，發現9個關鍵藥效成分與IL-6、AKT1、MMP9、CCL2對接結合能都小于-5.0 kJ/mol，說明9個關鍵藥效成分與以上靶點蛋白結合較好，推測三七-紅花藥對有效成分可能通過這些靶點發揮作用。IL-6是重要的炎性因子，心肌缺血再灌注時IL-6及其受體表達明顯增加，并且IL-6具有雙重作用，既能誘導中性粒細胞、心肌細胞表達黏附因子CD11b/CD18和細胞間黏附分子1(ICAM-1)而損傷心肌，又能通過Janus激酶激活信號傳導轉錄激活因子STAT1和STAT3，激活細胞信號過程，抑制再灌注心肌細胞凋亡，減少梗死面積[16]。AKT1是在心肌組織中高表達的1個亞型，研究表明AKT1介導的糖原合成酶激酶-3(GSK-3)活性抑制對于MIRI后的心臟保護至關重要[17]?；|金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)是一組依賴于鋅離子且以降解細胞外基質成分作為底物的蛋白水解酶，研究發現MMPs快速參與缺血再灌注損傷等氧化應激反應，同時發現其抑制劑能有效抑制MIRI的發生。MMP9是MMPs家族中的主要成員，研究發現血清中MMP9濃度的增加與冠狀動脈事件發生的危險程度呈正相關[18]。CC趨化因子受體2(CCR2)缺乏可減輕小鼠MIRI引起的氧化應激，縮小梗死面積[19]。在三七-紅花藥對抗MIRI的GO分析中，得出1 284個生物學過程，其中對氧含量的反應、對脂多糖的反應、氧化應激反應、凋亡信號通路的調控、循環系統中的血管過程等生物過程大部分都與MIRI相關。KEGG通路富集分析結果顯示，三七-紅花藥對抗MIRI主要涉及IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路、JAK2/STAT3信號通路等。在MIRI過程中，白細胞介素-23(IL-23)、IL-17炎性因子表達明顯增高，而且阻斷IL-23、IL-17都能明顯減輕MIRI，說明IL-17信號通路與MIRI的發生及發展密切相關[20]。PI3K/Akt信號通路在細胞內發揮著抑制凋亡、促進增殖的關鍵作用，近年來，研究發現該信號通路與多種心血管疾病的發生與轉歸有著密切的關系。多項實驗證明中藥復方可通過激活PI3K/Akt途徑保護心肌細胞免受缺血/再灌注損傷[21-22]。研究表明Toll樣受體信號轉導通路介導的先天免疫和炎癥反應在加重心肌缺血的損傷中起關鍵作用，其通過激活下游NF-κB、PI3K等信號通路，促進炎性因子釋放，從而介導心肌細胞損傷[23]。JAK2/STAT3信號通路是炎癥反應中的經典通路，可通過對下游眾多靶點發揮調控作用，如GSK-3、NF-κB、雷帕霉素靶蛋白、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)及TNF-α等。多項實驗證明中藥成分及中藥復方可通過調控JAK-STAT3信號通路保護MIRI[24-26]。因此，推測三七-紅花藥對活性成分可能通過作用于這些信號通路中的關鍵因子達到抗MIRI的目的。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法研究了三七-紅花藥對抗MIRI的主要作用靶點，構建了三七-紅花藥對抗MIRI的靶點交互作用網絡，運用分子對接方法對關鍵靶點進行驗證，通過對三七-紅花活性成分抗MIRI作用靶點的生物過程及通路富集，闡述了三七-紅花藥對通過多靶點、多通路作用發揮抗MIRI的作用，為進一步深入探討其臨床作用機制提供了先導信息和基礎。