來源于Mangifera indica L.C-糖基轉移酶MiCGTb的大腸桿菌原核表達、純化、結晶化以及晶體學研究

樊帥，呂廣新，劉凡，金媛媛，楊兆勇

作者單位：100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所微生物代謝工程研究室

糖苷是一類具有生物活性的天然產物[1]。與常見的O-糖苷相比，C-糖苷是自然界中極其少見的一類。不同于O-糖苷鍵在體內易被水解，C-糖苷鍵穩定性高，一些天然藥物C-糖基化修飾后提高了生物利用度和改善了藥理活性[2]。這些C-糖苷廣泛分布于植物中，具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]、降血糖[5-6]和保健[7]等功效。在C-糖苷的生物合成途徑中，C-糖基轉移酶可催化C-糖苷類化合物的 C-C鍵的形成，進而合成具有重要生物學功能的各類次級代謝產物。另外通過酶催化制備C-糖苷類化合物不僅能夠克服化學合成環境污染、產率低和苛刻反應條件等不利因素，還具有催化立體選擇性和區域選擇性等特點。

現階段，C-糖基轉移酶主要來源于微生物和植物，其中微生物來源的 C-糖基轉移酶主要為來源于Escherichia coliCFT073 的 IroB[8]、來源于Streptomyces griseoflavus的 gilGT[9]和來源于Streptomyces fradiae的 UrdGT2[10]。已知植物來源的C-糖基轉移酶存在于Oryza sativa[11]、Zea mays[12]、Fagopyrum esculentum[13]、Glycine max[14]、Gentianatrifloral[15]。糖基轉移酶的三維結構分為GT-A 和 GT-B 兩種類型，目前大部分糖基轉移酶的結構生物學研究主要集中在O-糖基轉移酶，對于C-糖基轉移酶，尤其植物來源的C-糖基轉移酶報道較少，目前僅有來源于Glycyrrhiza glabra的GgCGT[16]和Fagopyrum esculentum的 UGT708C1[17]等少數幾個C-糖基轉移酶有結構報道。

來源于Mangifera indicaL.的C-glycosyltransferase MiCGTb（EC：2.4.1.-）[18]能夠位置選擇性地將酰基間苯三酚 2-O-糖苷轉化為3-C-糖苷[18-19]，還能催化 di-C-糖基化反應[20]。其催化機制的解析需要 MiCGTb 的空間結構作為基礎，因此，本研究主要對 MiCGTb 的空間結構進行研究，構建 MiCGTb 截短蛋白 MiCGTb1（Asn8-Lys465）原核表達載體，利用大腸桿菌表達系統進行 MiCGTb1 蛋白的異源表達，經 Co2+親和層析、離子交換層析和分子排阻色譜純化后，對MiCGTb1 進行晶體培養獲得晶體，應用生物大分子 X 射線衍射技術獲得 MiCGTb1 晶體結構數據并進行解析，為今后闡述C-糖基轉移酶的催化機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

MiCGTb 表達菌株 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL購自美國 Agilent Technologies 公司；表達質粒pET-28a(+) 購自美國 Novagen 公司；Co2+-NTA 填料購自 Takara 中國公司；30 K 超濾濃縮管購自美國 Millipore 公司；HiTrapDEAE HP 和 Superose12 10/300GL 購自美國 Cytiva 公司；結晶初篩試劑盒Crystal ScreenTM-HR2-110 Scoring Sheet 和 Crystal ScreenTM-HR2-112 Scoring Sheet 購自美國 Hampton Research 公司；Wizard CRYO 1 Tubes 和 Wizard CRYO 2 Tube 購自美國 Rigaku Reagents 公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達質粒構建 MiCGTb 表達質粒由中國醫學科學院藥物研究所戴均貴課題組饋贈，截短MiCGTb （ MiCGTb1 ， Asn8-Lys465 ） 由引物MiCGTb1-F ： CGGGATCCAACTCCTATCCACAT（下劃線部分為BamH I 酶切位點），MiCGTb1-R：CCCAAGCTTCTTCTTCCAATTCTCTATG（下劃線部分為Hind III 酶切位點），經 PCR 擴增和BamH I/HindIII 雙酶切處理后，連入已被BamH I/HindIII 雙酶切 pET-28a(+) 構建表達質粒pET-28MiCGTb1，利用基因測序確認 MiCGTb1 序列準確無誤。

1.2.2 MiCGTb/MiCGTb1 表達與純化 將pET-28MiCGTb/MiCGTb1 質粒轉化至 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL 表達菌株并接種于 3 L 含50 μg/ml 卡那霉素，30 μg/ml 四環素和氯霉素的LB 培養基中。37 ℃、200 r/min 培養至OD6000.8～1.0，加入 1 mol/L IPTG 至終濃度為 0.5 mmol/L，在 18 ℃、200 r/min 繼續振蕩培養 12 h。用緩沖液lysis buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.4）重懸菌體，利用高壓均質機破碎，18 000 r/min、4 ℃ 離心 30 min，收集上清后勻速緩慢地加入已平衡好的 Co2+-NTA柱，再用 washing buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 7.4）5 倍柱體積沖洗，最后用 elution buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脫目的蛋白，目的蛋白除鹽后，上樣于弱陰離子交換柱 HiTrapDEAE HP 進行離子交換層析純化，利用洗脫液（20 mmol/L Tris，pH 8.0，2 mol/L NaCl）進行梯度洗脫，收集出峰樣品經SDS-PAGE 檢測后將目的蛋白用 30 K 超濾濃縮管進行脫鹽濃縮后備用。

1.2.3 MiCGTb/MiCGTb1 結晶初篩與優化 將MiCGTb/MiCGTb1 濃度調至 8 mg/ml，使用商業化篩選矩陣 Crystal ScreenTM-HR2-110 Scoring Sheet、Crystal ScreenTM-HR2-112 Scoring Sheet、Wizard CRYO 1 Tubes 和 Wizard CRYO 2 Tube，采用懸滴蒸汽擴散法在 23℃ 培養晶體，在 24 孔板中將 MiCGTb1 與池液 1:1 混合懸滴。對有晶體出現的池液 pH、沉淀劑濃度和蛋白濃度、結晶溫度進行優化，最終獲得可用于 X-射線衍射分析的蛋白質晶體。

1.2.4 X-射線數據收集 由于蛋白沉淀劑為 40%MPD，可將優化好的晶體直接用 loop 環撈取后直接凍存于液氮中，經凍存的晶體在上海同步輻射光源 BL18U1 線站經檢測器 Pilatus3 6M 收集衍射數據，衍射數據通過 HKL3000 軟件包進行數據還原。

2 結果

2.1 MiCGTb 異源表達

MiCGTb 來源于Mangifera indicaL.，所以異源表達的菌株采用含有稀有密碼子可提高真核基因在原核表達水平的宿主 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL，采用 Co2+親和層析純化后發現 MiCGTb在室溫下不穩定，容易降解（圖 1），這不利于后續結晶實驗。通過 Protein DisOrder prediction System（ http://prdos.hgc.jp/cgi-bin/top.cgi ） 分析MiCGTb 氨基酸序列發現，MiCGTb 序列兩端的混亂度較高（圖 2），在三維結構上柔性較高，有可能造成蛋白質的不穩定，且不利于結晶。因此，通過將其氨基端的 7 個氨基酸和羧基端的 5 個氨基酸去掉，重新克隆構建 MiCGTb 的截短序列MiCGTb1 來進行后期的純化和結晶。

圖1 Co2+ 親和層析純化 MiCGTb 的 SDS-PAGE 分析Figure 1 SDS-PAGE analysis of MiCGTb purified by Co2+affinity chromatography

圖2 MiCGTb 蛋白混亂度預測結果Figure 2 The prediction result of protein disorder

2.2 MiCGTb1 表達載體構建及表達純化

以 MiCGTb 表達質粒為模板，MiCGTb1-F 和MiCGTb1-R 為引物擴增得到micgtb1基因。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，micgtb1 基因序列的理論長度為 1374 bp，克隆得到目的片段大小約為 1400 bp（圖 3），克隆結果與預期值相符。BamH I 和Hind III 雙酶切后，連入同樣BamH I 和Hind III雙酶切的 pET-28a(+) 質粒構建 MiCGTb1 表達質粒 pET-28MiCGTb1，通過測序驗證序列的準確性。

圖3 micgtb1 基因 PCR 擴增結果Figure 3 PCR amplification results of micgtb1 gene

通過重組質粒轉化，成功表達截短的 MiCGTb1重組蛋白。經低溫 IPTG 誘導發酵、破碎和 Co2+親和層析，成功獲得可溶性 MiCGTb1。目的蛋白上樣至 HiTrapDEAE HP 弱陰離子交換柱，經洗脫液（20 mmol/L Tris，2 mol/L NaCl，pH 8.0）梯度洗脫，收集出峰樣品進行 SDS-PAGE 分析，結果如圖 4所示，收集純度較好的峰尖管（2 和 3 管），濃縮后備用。

圖4 弱離子交換純化 MiCGTb1 的 SDS-PAGE 分析Figure 4 SDS-PAGE analysis of MiCGTb1 purified by DEAE ion-exchange chromatography

2.3 MiCGTb1 結晶初篩

將 MiCGTb 濃度調至 7 mg/ml，使用蒸氣擴散法，將 MiCGTb 與池液 1:1 混合，蛋白溶液和池液體積均為 1 μl，池液分別使用 Crystal ScreenTM-HR2-110 Scoring Sheet、Crystal ScreenTMHR2-112 Scoring Sheet、Wizard CRYO 1 Tubes 和Wizard CRYO 2 Tube 等試劑盒內的每種溶液進行結晶條件的初篩，初篩結果如圖 5所示。對于條件 1（0.2 mol/L ZnAc2，0.1 mol/L 二甲胂酸鈉 pH 6.5，18% w/v PEG 8000）長出的晶體呈堆疊的片狀；條件 2（0.2 mol/L MgCl2，0.1 mol/L Tris pH 8.5，3.4 mol/L 1,6-己二醇）長出的晶體呈麥芒狀；條件 3（0.2 mol/L MgCl2，0.1 mol/L 咪唑 pH 8.0，40%MPD）長出的晶體呈片狀。

圖5 MiCGTb1 結晶條件初篩結果（A：池液條件 0.2 mol/L ZnAc2，0.1 mol/L 二甲胂酸鈉 pH 6.5，18% w/v PEG 8000；B：池液條件 0.2 mol/L MgCl2，0.1 mol/L Tris pH 8.5，3.4 mol/L 1,6-己二醇；C：池液條件 0.2 mol/L MgCl2，0.1 mol/L 咪唑pH 8.0，40% MPD）Figure 5 Crystallization-condition screening of MiCGTb1 (A:Reservoir condition 0.2 mol/L ZnAc2,0.1 mol/L sodium cacodylate pH 6.5,18% PEG 8000;B:Reservoircondition 0.2 mol/L MgCl2,0.1 mol/L Tris pH 8.5,3.4 mol/L 1,6-hexanediol;C:Reservoir condition 0.2 mol/L MgCl2,0.1 mol/L imidazole pH 8.0,40% MPD)

對初篩條件中的 pH、蛋白濃度、沉淀劑濃度、結晶溫度和添加劑進行優化，最終在蛋白濃度為8 mg/ml，池液條件為 0.2 mol/L MgCl2，0.1 mol/L Tris pH 8.0，40% MPD，結晶溫度為 23 ℃，添加劑為乙二醇（0.75%v/v），結晶條件最優，晶體如圖 6所示。

圖6 優化后 MiCGTb1 晶體Figure 6 The optimized MiCGTb1 crystals

將優化后的晶體液氮凍存，用 X 射線衍射儀篩選衍射分辨率高的晶體，得到一批衍射分辨率較高的晶體送至上海光源（SSRF）BL18U1 線站采集數據，衍射具體參數為：波長 0.97915 ?，掃描步長為 1°，曝光時間 0.5 s，檢測器距離 350 mm，收集 180 張衍射圖（圖 7），并使用 HKL3000進行數據處理，MiCGTb1 晶體結構空間群為P21，晶胞參數為：a=285.158 ?，b=135.918 ?，c=286.924 ?，α=90.000°，β=117.216°，γ=90.000°。衍射數據的統計結果見表 1。衍射數據的分辨率為 3.30 ?。

圖7 自我回轉函數計算結果Figure 7 The result of self rotation function

表1 MiCGTb1 晶體數據Table 1 Crystal data of MiCGTb1

3 討論

本文利用大腸桿菌表達系統異源高效表達來自Mangifera indicaL.的截短蛋白 MiCGTb1，采用 Co2+親和層析、離子交換層析和分子排阻色譜進行純化得到可用于結晶的目的蛋白，通過結晶條件的初篩和結晶條件的優化得到最優結晶條件，經上海同步輻射光源 BL18U1 線站收集得到分辨率為 3.30 ? 的 X 射線衍射數據，屬于單斜晶系，空間群為P21。從自我回轉函數計算的結果來看，κ=60° 有明顯的高峰存在，表明晶體的最小非對稱單位里存在非晶軸平行的 6 重旋轉軸或螺旋軸，因此最小非對稱單位里含有的分子數為 36 或42（6 的整數倍）是合理的，如果蛋白質形成 6 聚體，其中沒有形成 3 重或 6 重旋轉對稱的話，最有可能的是最小非對稱單位里的分子數是 36 個，即 6 個 6 聚體。對于數據解析來說分辨率仍需提高，后期實驗可通過添加劑篩選或添加底物等方式來提高結晶質量，爭取將分辨率提高至 3 ? 以內，為以后解析C-糖基轉移酶的空間結構乃至闡述催化機制奠定堅實的基礎。