PROTAC技術在抗病毒感染中的應用前景

劉杏，夏宇，李鑫，滿榮勇，王煒，曹建中

作者單位：410208 長沙，湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室（劉杏、夏宇、李鑫、曹建中），藥學院（王煒）；418000 懷化，湖南省懷化市第一人民醫院神經內科與醫學實驗中心（滿榮勇）

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）[1-2]暴發后在全球造成大流行，促使人們再一次重視傳染病的危害和防治。尤其新發呼吸道病毒傳染性強，一旦暴發，傳播迅速，由于沒有有效治療方法，往往致死率高，嚴重危害人類健康，并造成嚴重經濟損失。其他常見危害人類的病毒性疾病有病毒性肝炎、流感、艾滋病、狂犬病等，尤其艾滋病和病毒性肝炎患者需要長期服藥，患者精神和經濟壓力大。在傳染性疾病中，病毒感染約占 75%，所以對病毒性疾病的控制一直是生物醫學界的一大難點。

藥物依然是當前控制病毒感染的主要方法，其抑制病毒生活史的某個環節，如直接抑制或殺滅病毒、阻止病毒侵入細胞、抑制病毒基因組復制、病毒顆粒釋放或增強宿主抗病毒能力等。以 SARS-CoV-2 為例，目前臨床使用的抗 SARS-CoV-2 藥物如核苷酸類似物法匹拉韋和瑞德西韋等[3]，靶向 RNA 依賴性 RNA 聚合酶（RdRp），阻斷病毒RNA 的合成；阿比朵爾[4]則是通過靶向 S 蛋白與其受體ACE2 的結合，阻止病毒進入細胞。這些藥物均只能部分抑制病毒復制，無法終止病毒感染，因此尋找新的有效的能夠直接終止病毒復制的藥物一直是病毒學研究的努力方向。最近興起的利用細胞各種蛋白酶降解系統降解病理蛋白的技術在腫瘤和神經性疾病等領域取得了很大進展，尤其以 26S蛋白酶系統為基礎的蛋白質靶向降解嵌合體（proteolysis targeting chimera，PROTAC）技術或藥物進展迅速，已經進入臨床 II 期試驗[5-6]，有望成為研發抗病毒藥物的利器。現將 PROTAC技術的原理、現狀和在抗病毒方面的應用前景作一個介紹。

1 PROTAC技術的原理與應用

PROTAC 分子或藥物是一個異質雙功能小分子，由一個結合靶蛋白的配體小分子和一個結合 E3 連接酶的配體小分子通過一個小分子鏈構成[7]。PROTAC 分子進入細胞后，同時與靶蛋白和 E3 連接酶結合，利用 E3 連接酶招募 E2 對靶蛋白進行泛素化修飾，修飾后的靶蛋白通過26S 蛋白酶系統降解為氨基酸，釋放出來的 PROTAC 分子可以重復使用（圖 1）。PROTAC技術是一個顛覆傳統藥物概念的新技術，但是其應用場景與傳統蛋白抑制劑一致。該技術最早發表于 2001年，此后一直由耶魯大學 Crews教授實驗室推動并在近幾年得到其他藥物研發實驗室跟蹤。和傳統藥物不同的是，PROTAC 藥物不是抑制靶蛋白活性，而是直接降解靶蛋白，因此其控制靶蛋白活性的效果優于抑制劑。泛素-蛋白酶系統的正常生理功能是負責清除細胞中的變性、突變或有害蛋白[5]。一旦靶蛋白、PROTAC 分子、E3 泛素連接酶三元復合物形成，E2 泛素結合酶把泛素轉移到靶蛋白表面上的賴氨酸殘基，細胞內 26S 蛋白酶體識別賴氨酸多聚泛素化信號進而促進了靶蛋白的降解（圖 1）。目前，PROTAC技術已經用于靶向多種細胞蛋白，如轉錄因子、骨架蛋白、酶和調節蛋白等[6]。在癌癥和神經元疾病等領域，PROTAC 分子在細胞和動物實驗中表現優異，部分 PROTAC 藥物已經進入臨床 I 期或 II 期。這些進展促使全球頂級制藥公司聯手新成立了 PROTAC 公司，開展PROTAC 藥物研發，相信不久的將來 PROTAC 藥物會不斷出現，用于治療人類的各種疾病。

圖1 PROTAC 原理

2 PROTAC技術的優勢

PROTAC 的作用機制使得 PROTAC 分子在降解靶蛋白過程中具有兩個重要特征。首先是形成靶蛋白、PROTAC和 E3 泛素連接酶的三元復合物。PROTAC 分子對靶蛋白的降解具有濃度依賴性[8]：在 PROTAC 分子濃度較低時，靶蛋白被降解的程度隨濃度升高而逐漸提高；PROTAC分子濃度過高時，反而會出現靶蛋白水平回升。這是由于靶蛋白和 E3 泛素連接酶均被小分子占據，形成了二元復合物，降低了靶蛋白的降解效率。其次，PROTAC 分子對蛋白的降解起催化作用[9]，靶蛋白通過 26S 蛋白酶途徑降解后，PROTAC 分子被釋放出來，繼續參與降解下一個靶蛋白。因此，只需催化量的 PROTAC 分子就可以誘導靶蛋白降解。

大量研究發現，PROTAC技術具有以下顯著優勢：①用量小；②較低的藥物暴露量降低了脫靶效應產生的可能性，減少毒副作用；③不會引起耐藥；④不依賴于蛋白活性中心親和力，可選擇性高；⑤沒有抑制劑和靶蛋白復合物堆積；⑥較少給藥次數；⑦更重要的是，由于 PROTAC 只需要結合活性，觸發靶蛋白與 E3 酶結合從而引發降解這一事件，屬于“事件驅動”，與傳統的小分子抑制劑的“占位驅動”不同，不需要直接抑制靶蛋白的活性，藥物不需要與靶蛋白長時間和高強度的結合，因此可以靶向傳統難以成藥的蛋白[10]。

目前，Pubmed 上已經發表了 500 多篇關于 PROTAC技術的研究性論文，研究重點集中在腫瘤治療領域。2021年3月，美國 Arvinas 公司宣布其開發的用于治療前列腺癌的雄激素受體 AR 降解藥物 ARV-110 和 ARV-471 進入II 期臨床試驗，標志著 PROTAC技術的研究進入新的階段。表 1 總結了已經報道的重要 PROTAC 小分子化合物，以及對應的靶蛋白和 E3 配體分子[11]。

表1 在研 PROTAC 藥物

3 PROTAC 在中藥抗病毒中的應用前景

根據文獻查詢，PROTAC技術尚沒有引起中醫藥領域的重視，尚未見在中醫藥方面的應用，因此我們針對中藥抗病毒的作用靶點，探討 PROTAC技術在中藥抗病毒中的應用前景。

中藥治療病毒性疾病尤其急性感染的效果很好，且副作用相較化學藥物來說要小很多，然而也面臨很大挑戰。首先，關于中藥抗病毒作用的有效成分鑒定及潛在靶點的報道很多，然而有關生物學機制探討不多；其次，對于 HIV-1 和HBV 這類慢性感染，缺少有效根治方法，患者需終身服藥，精神和經濟壓力大。利用 PROTAC技術改造中藥抗病毒小分子可以提高藥物療效。現有抗病毒中藥小分子主要是抑制劑，通過改造成 PROTAC 藥物，理論上可以使用較小的劑量，直接降解靶蛋白，從而終止病毒復制。PROTAC技術聯合質譜以及 CRISPR/Cas9 基因編輯技術可以發現藥物靶標，為進一步探討藥物作用機制、提高療效提供基礎。一些中藥小分子具有結合病毒非酶類蛋白的功能，然而這種結合對于病毒的治療有何作用尚不清楚，利用 PROTAC 改造后的小分子藥物可以直接降解這些靶標蛋白，明確藥物靶點。PROTAC 和酶抑制劑不一樣，其藥物分子能反復利用，對于慢性感染具有特別的意義，可以降低服藥次數，減少副作用。針對某些感染，PROTAC 藥物可以和中藥方劑聯用，提高其治療效果。

以葉下珠這一中藥為例，研究表明其通過活性成分沒食子酸葡萄糖苷結合核衣殼蛋白 preC 而抑制乙肝病毒的復制[32]，如果將沒食子酸葡萄糖苷改造成 PROTAC 分子，就可以直接降解 preC，改善患者癥狀。

要充分發揮 PROTAC技術在中藥小分子藥物抗病毒中的潛力，需要面對以下挑戰。首先，篩選合適的靶標和藥物。目前在體外抑制病毒復制的中藥活性成分有很多，部分藥物的分子結構已經鑒定（表 2）。由于 PROTAC 分子依然是小分子，所以分子量小的生物利用度相對較高，比如大黃酸、麻黃素、氧化苦參堿等最有可能利用 PROTAC 改造，成為療效更好的抗病毒藥物。對于病毒感染尤其慢性感染，靶向病毒復制有關酶類如蛋白酶和復制酶，抗病毒效果會比較理想。其次，病毒感染往往引起機體炎癥反應，過多的炎癥和細胞因子“風暴”會導致組織與器官損傷，因此控制炎癥和細胞因子在適當水平是非常重要的，利用 PROTAC 藥物靶向炎癥因子有可能達到需要的目標。

表2 抗病毒中藥小分子

最后，如表 1所示，除了靶標，PROTAC 藥物的 E3酶及其配體也是影響藥物效果的重要因素，人類基因組編碼超過 400 個 E3 酶，目前研究較多的不到 10 個，有合適配體而且用在 PROTAC 藥物上面的以 CRBN、IAP 和VHL 為主，這些酶在病毒感染細胞中的表達水平尚沒有報道，因此研究清楚這些酶在病毒感染細胞中的動態變化，對于采用合理的 E3 酶及其配體設計中藥 PROTAC 小分子治療病毒性疾病具有重大意義。

PROTAC技術是目前生物醫藥領域的一大革命性技術，在中藥抗病毒領域具有非常好的前景，不僅可以解決靶標不清的問題，而且具有極大地提高療效的潛力。利用這一技術，可以進一步提高中醫藥在抗病毒領域的價值，為人類健康做出更大貢獻。