不同熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體組合及不同抗凝劑對(duì)流式測(cè)定食蟹猴T淋巴細(xì)胞亞群的影響

姜華，劉麗，李路路，苗玉發(fā)，文海若，孫立，王欣，張穎麗，李偉，霍艷，耿興超

作者單位：100176 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院/國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心藥物非臨床安全評(píng)價(jià)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

流式細(xì)胞術(shù)是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一，在細(xì)胞分子水平上可通過熒光標(biāo)記的單克隆抗體對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物因子進(jìn)行多參數(shù)、快速、準(zhǔn)確的定量分析。目前新藥非臨床研究中運(yùn)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞及其亞群檢測(cè)是新藥安全性評(píng)價(jià)的重要組成部分，尤其是對(duì)于具有潛在免疫毒性的藥物。T 淋巴細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的重要類型，分為輔助性 T 淋巴細(xì)胞（T helper cells，Th）和細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），可發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能。測(cè)定 T 淋巴細(xì)胞亞群對(duì)于評(píng)價(jià)藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響有重要意義。T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果主要與種屬、性別、年齡、病原體感染、免疫狀態(tài)等有關(guān)[1-4]，此外，用流式方法檢測(cè)時(shí)涉及到多種處理因素，包括使用不同的熒光標(biāo)記 CD3、CD4和 CD8 檢測(cè)抗體，檢測(cè)過程可能使用不同的血液抗凝劑、固定液，有無凝血、溶血情況，這些因素可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響。目前這方面的報(bào)道較少，并且很少在 GLP 實(shí)驗(yàn)室開展[5-7]。

本研究在 GLP 實(shí)驗(yàn)室條件下分別應(yīng)用兩組不同的熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體組合測(cè)定食蟹猴外周血 T淋巴細(xì)胞亞群；此外，分別采用流式試驗(yàn)中常用的兩種抗凝劑肝素鈉和乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）處理全血樣本，通過比較不同條件下食蟹猴外周血 T 淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定結(jié)果，分析以上因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，為相關(guān)檢測(cè)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4 歲食蟹猴 320 只，雌雄各半，普通級(jí)，由廣西桂東靈長(zhǎng)類開發(fā)實(shí)驗(yàn)有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為 SCXK（桂）2011-0001 和 SCXK（桂）2016-0001。飼養(yǎng)于國(guó)家藥物安全評(píng)價(jià)監(jiān)測(cè)中心的普通級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，單籠飼養(yǎng)，自由飲水，每天定量給飼料和水果（各 150 g），自由攝取。飼養(yǎng)溫度和濕度分別控制在 16～26 ℃和 40%～70%，每小時(shí)換氣次數(shù)不少于 8 次，照明時(shí)間是每天 12 h，飼養(yǎng) 3 周，適應(yīng)環(huán)境后采血測(cè)定。

1.1.2 儀器與試劑 FACSCalibur 流式細(xì)胞儀，分析軟件 Cell QuestTM，流式儀校準(zhǔn)微球（BD CalibriteTM 3-color、APC bead），流式檢測(cè)抗體異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗 CD8 抗體 FITC-CD8（批號(hào)：7312538）、PE-CD4（批號(hào)：9172628）、FITC-CD4（批號(hào)：519762）、PE-CD8（批號(hào)：7191542）、PerCP-CD3（批號(hào)：8124735）和 EDTA-K2抗凝管（貨號(hào)：365974，批號(hào)：8156867）均購(gòu)自美國(guó) BD公司；H-60R 高速離心機(jī)為日本 Kokusan 公司產(chǎn)品；紅細(xì)胞裂解液主要成分氯化銨（批號(hào)：20161208）、碳酸氫鉀（批號(hào)：20150924）、乙二胺四乙酸二鈉（批號(hào)：20140328）和多聚甲醛（批號(hào)：20150120）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；磷酸鹽緩沖液（批號(hào)：AD22391274、AE29005278）購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；多聚甲醛（批號(hào)：20150120）使用前經(jīng) PBS 稀釋為 1% 的應(yīng)用液；肝素鈉抗凝管購(gòu)自江蘇康健醫(yī)療用品有限公司（貨號(hào)：KJ020SH，批號(hào)：190101）。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集

1.2.1.1 用于比較不同熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)結(jié)果的血樣采集和抗凝處理 食蟹猴前臂靜脈采血，采集0.3～0.5 ml 全血，加入到有肝素鈉的抗凝管中混勻，每種檢測(cè)抗體組合采血?jiǎng)游飻?shù) 160 只，雌雄各半。

1.2.1.2 用于比較不同抗凝劑處理后檢測(cè)結(jié)果的血樣采集和抗凝處理 食蟹猴前臂靜脈采血，采集0.3～0.5 ml 全血，采血?jiǎng)游飻?shù) 22 只，雌雄各半。各取 22 只猴血樣分別加入到有肝素鈉或 EDTA-K2的抗凝管中混勻。

1.2.2 樣本制備和分析

1.2.2.1 比較不同檢測(cè)抗體組合對(duì) T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果影響的樣本制備和分析 分別取熒光檢測(cè)抗體組合 PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4（檢測(cè)抗體組合 1）和 PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8（檢測(cè)抗體組合 2）各 5 μl，與 1.2.1.1 中肝素鈉抗凝血 50 μl 混合，在室溫下避光孵育 20～30 min后，在管中加入紅細(xì)胞裂解液，將其混勻，裂解時(shí)間為 5～8 min， 200 ×g離心 5 min，棄去上清液，加入 PBS 清洗一次，加入 PBS-1% 多聚甲醛重懸細(xì)胞，上機(jī)測(cè)定。上機(jī)檢測(cè)前，先用流式儀的校準(zhǔn)微球做質(zhì)控，質(zhì)控通過后上樣。需要在散點(diǎn)圖上設(shè)門，圈住淋巴細(xì)胞群，用空白或同型對(duì)照管、單熒光管來調(diào)節(jié)電壓和熒光補(bǔ)償，每個(gè)樣品收集淋巴細(xì)胞 5000 個(gè)，分析 CD3+CD4+和 CD3+CD8+T 淋巴細(xì)胞亞群百分比和平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

1.2.2.2 比較不同抗凝劑對(duì) T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果影響的樣本制備和分析 將 22 份肝素鈉抗凝血 50 μl 或 22 份 EDTA-K2抗凝血 50 μl分別與兩組檢測(cè)抗體組合進(jìn)行孵育，樣本制備和分析方法同 1.2.2.1。所有血樣均在采集后 4 h 內(nèi)進(jìn)行制備與測(cè)定分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以±s的形式表示， 采用TOXSTAT2006 統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，在符合正態(tài)性的情況下，進(jìn)行方差分析（F檢驗(yàn)），如果為等方差，進(jìn)行 Student-t檢驗(yàn)；如果為異方差，在 n1=n2 時(shí)，進(jìn)行 Aspin-Welch 檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體對(duì)淋巴細(xì)胞亞群分類結(jié)果的影響

雌性食蟹猴 CD3+CD4+淋巴細(xì)胞百分比、CD3+CD8+淋巴細(xì)胞百分比及 CD4+/CD8+比值在兩組檢測(cè)抗體組合均有顯著性差異（表 1，均P<0.01）。用 FITC 標(biāo)記抗體檢測(cè)到的 CD4+淋巴細(xì)胞（FITC-CD4+）百分比顯著低于用 PE 標(biāo)記抗體檢測(cè)到的 CD4+淋巴細(xì)胞（PE-CD4+）百分比，降低的幅度為 13%，同時(shí)，F(xiàn)ITC-CD4+淋巴細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度 MFI 顯著低于 PE-CD4+淋巴細(xì)胞MFI，僅約為后者的 4%。PE-CD8+淋巴細(xì)胞百分比顯著高于 FITC-CD8+淋巴細(xì)胞百分比，增加的幅度為 18%，同時(shí)，F(xiàn)ITC-CD8+淋巴細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度 MFI 顯著低于 PE-CD8+淋巴細(xì)胞 MFI，僅約為后者的 9%；應(yīng)用檢測(cè)抗體組合 2 的CD3+CD4+/CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比值顯著低于應(yīng)用檢測(cè)抗體組合 1 的，降低的幅度為 24%。雄性食蟹猴也有相似檢測(cè)結(jié)果（表 1，P<0.05 或P<0.01），細(xì)胞百分比變化的幅度低于雌性動(dòng)物，而MFI 的變化幅度與雌性動(dòng)物非常接近。分別應(yīng)用兩種檢測(cè)抗體組合測(cè)定的食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群分布區(qū)間結(jié)果與統(tǒng)計(jì)結(jié)果的趨勢(shì)相符合（表 2 和表 3）。

表1 兩組熒光檢測(cè)抗體組合食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果比較（±s）Table 1 Data comparison of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys determined by two fluorescence detection antibody combinations (±s)

表1 兩組熒光檢測(cè)抗體組合食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果比較（±s）Table 1 Data comparison of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys determined by two fluorescence detection antibody combinations (±s)

注：檢測(cè)抗體組合 2 與檢測(cè)抗體組合 1 組比較，*P <0.05，**P <0.01；檢測(cè)抗體組合 1：PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4；檢測(cè)抗體組合 2：PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8；CD3+CD4+ 百分比：CD3+CD4+ 淋巴細(xì)胞占 T 淋巴細(xì)胞的百分比；CD3+CD8+ 百分比：CD3+CD8+ 淋巴細(xì)胞占 T 淋巴細(xì)胞的百分比。Notes:Comparing between the data using two fluorescence detection antibody combinations,*P <0.05,**P <0.01;Detection antibody combination 1:PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4;Detection antibody combination 2:PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8;CD3+CD4+ percent:Percent of CD3+CD4+ lymphocyte in total T lymphocytes;CD3+CD8+ percent:Percent of CD3+CD8+ lymphocyte in total T lymphocytes.

組別例數(shù)CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+/CD8+平均熒光強(qiáng)度性別Gender Groups Cases百分比（%）CD3+CD4+percent (%)百分比（%）CD3+CD8+percent (%)Mean fluorescence intensity CD4+ 細(xì)胞CD4+ cell CD8+ 細(xì)胞CD8+ cell雌性Female檢測(cè)抗體組合 1 Detection antibody combination 1檢測(cè)抗體組合 2 Detection antibody combination 2 80 54.94 ± 7.78 38.55 ± 7.55 1.52 ± 0.50 1556.77 ± 321.84 196.18 ± 92.14 80 47.94 ± 10.05**45.52 ± 10.19**1.15 ± 0.48**61.45 ± 16.16** 2212.35 ± 399.26**雄性Male檢測(cè)抗體組合 1 Detection antibody combination 1 80 49.80 ± 8.34 43.20 ± 7.90 1.23 ± 0.45 1555.03 ± 276.15 194.73 ± 81.78檢測(cè)抗體組合 2 Detection antibody combination 2 80 46.80 ± 9.04* 46.72 ± 9.00** 1.08 ± 0.44* 61.22 ± 12.09** 2246.61 ± 360.02**

表2 檢測(cè)抗體組合 1 組食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果分布區(qū)間Table 2 Data distribution interval of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys determined by detection antibody combination 1

表3 檢測(cè)抗體組合 2 組食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果分布區(qū)間Table 3 Data distribution interval of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys determined by detection antibody combination 2

2.2 不同抗凝劑處理對(duì)淋巴細(xì)胞亞群百分比的影響

應(yīng)用抗體組合 1（PerCP-CD3/FITC-CD8/PECD4）檢測(cè)時(shí)，與肝素鈉抗凝組相比，EDTA-K2抗凝劑組 CD3+CD4+淋巴細(xì)胞百分比顯著增加（表 4，P<0.05），增加的幅度為 13%；CD3+CD8+淋巴細(xì)胞百分比顯著降低（表 4，P<0.01），下降的幅度為 52%；CD3+CD4+/CD3+CD8+淋巴細(xì)胞比值顯著增加，均值從 1 增加到 3.27（表 4，P<0.01）。應(yīng)用抗體組合 2（PerCP-CD3/FITC-CD4/PECD8）檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩種抗凝劑組的 CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴細(xì)胞百分比及比值無顯著性差異。

表4 兩種抗凝劑處理組食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群百分比和比值結(jié)果（±s）Table 4 Percentage and ratio of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys using two anticoagulants (±s)

表4 兩種抗凝劑處理組食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群百分比和比值結(jié)果（±s）Table 4 Percentage and ratio of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys using two anticoagulants (±s)

注：EDTA-K2 與肝素鈉抗凝劑組比較，*P <0.05，**P <0.01；檢測(cè)抗體組合 1：PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4；檢測(cè)抗體組合 2：PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8；CD3+CD4+ 細(xì)胞百分比：CD3+CD4+ 淋巴細(xì)胞占 T 淋巴細(xì)胞的百分比；CD3+CD8+ 細(xì)胞百分比：CD3+CD8+ 淋巴細(xì)胞占 T 淋巴細(xì)胞的百分比。Notes:Comparing between the data obtained using anticoagulant EDTA-K2 or heparin sodium,*P <0.05,**P <0.01;Detection antibody combination 1:PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4;Detection antibody combination 2:PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8;CD3+CD4+ cell percent:Percent of CD3+CD4+lymphocyte in total T lymphocytes;CD3+CD8+ cell percent:Percent of CD3+CD8+ lymphocyte in total T lymphocytes.

組別Groups抗凝劑Anticoagulants例數(shù)Cases CD3+CD4+ 百分比（%）CD3+CD4+ percent (%)CD3+CD8+ 百分比（%）CD3+CD8+ percent (%)CD4+/CD8+檢測(cè)抗體組合 1 Detection antibody combination 1 EDTA-K2 22 49.47 ± 9.61* 22.87 ± 12.42** 3.27 ± 2.92**肝素鈉 Heparin sodium22 57.35 ± 9.52 33.36 ± 8.63 1.92 ± 0.88肝素鈉 Heparin sodium22 43.80 ± 8.96 47.48 ± 9.55 1.00 ± 0.44檢測(cè)抗體組合 2 Detection antibody combination 2 EDTA-K2 22 54.18 ± 9.49 34.98 ± 9.93 1.74 ± 0.74

2.3 不同抗凝劑處理對(duì)于淋巴細(xì)胞亞群 MFI 的影響

應(yīng)用抗體組合 1（PerCP-CD3/FITC-CD8/PECD4）檢測(cè)時(shí)，EDTA-K2抗凝劑組 FITC-CD8+MFI顯著低于肝素鈉抗凝組（表 5，P<0.01，圖 1 和圖 2），僅為肝素鈉抗凝組的 13%。應(yīng)用抗體組合 2（PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8）檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)有相同的變化趨勢(shì)，即 EDTA-K2抗凝劑組 PE-CD8+MFI 比肝素鈉組顯著降低（表 5，P<0.01，圖 1和圖 2），僅為肝素鈉抗凝組的 16%；EDTA-K2組比肝素鈉組 FITC-CD4+MFI 顯著升高（表 5，P<0.05），但升高的幅度不大，僅為 8%；未見其他顯著性變化。

圖1 肝素鈉抗凝檢測(cè)抗體組合 1（PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4）（A）和抗體組合 2（PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8）（B）食蟹猴 CD3+CD4+ 和 CD3+CD8+ T 淋巴細(xì)胞 MFIFigure 1 MFI of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ T lymphocytes in cynomolgus monkeys determined by detection antibody combination 1 (PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4) (A) and combination 2 (PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8) (B) with heparin sodium as anticoagulant

圖2 EDTA-K2 抗凝檢測(cè)抗體組合1（PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4）（A）和抗體組合2（PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8）（B）食蟹猴 CD3+CD4+ 和 CD3+CD8+ T 淋巴細(xì)胞 MFIFigure 2 MFI of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ T lymphocytes in cynomolgus monkeys determined by detection antibody combination 1 (PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4) (A) and combination 2 (PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8) (B) with EDTA-K2 as anticoagulant

表5 兩種抗凝劑處理組食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群 MFI 結(jié)果（±s）Table 5 MFI of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys using two anticoagulants (±s)

表5 兩種抗凝劑處理組食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群 MFI 結(jié)果（±s）Table 5 MFI of T lymphocyte subsets in cynomolgus monkeys using two anticoagulants (±s)

注：EDTA-K2 與肝素鈉抗凝劑組比較，*P <0.05，**P <0.01；檢測(cè)抗體組合 1：PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4；檢測(cè)抗體組合 2：PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8；CD3+CD4+ 細(xì)胞 MFI：CD3+CD4+ 細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度；CD3+CD8+ 細(xì)胞 MFI：CD3+CD8+ 細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。Notes:Comparing between the data obtained using anticoagulant EDTA-K2 or heparin sodium,*P <0.05,**P <0.01;Detection antibody combination 1:PerCP-CD3/FITC-CD8/PE-CD4;Detection antibody combination 2:PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8;CD3+CD4+ cell MFI:Mean fluorescence intensity of CD3+CD4+ lymphocyte;CD3+CD8+ cell MFI:Mean fluorescence intensity of CD3+CD8+ lymphocyte.

組別Groups抗凝劑Anticoagulants例數(shù)Cases CD3+CD4+ 細(xì)胞 MFI CD3+CD4+ cell MFI CD3+CD8+ 細(xì)胞 MFI CD3+CD8+ cell MFI檢測(cè)抗體組合 1 Detection antibody combination 1 EDTA-K2 22 1702.02 ± 144.54 33.72 ± 8.52**肝素鈉 Heparin sodium 22 102.50 ± 9.85 2731.26 ± 342.93肝素鈉 Heparin sodium 22 1750.01 ± 144.13 264.87 ± 33.26檢測(cè)抗體組合 2 Detection antibody combination 2 EDTA-K2 22 110.82 ± 13.77* 432.46 ± 186.40**

3 討論

CD3、CD4 和 CD8 分別是總 T 淋巴細(xì)胞、Th 細(xì)胞和 CTL 細(xì)胞的主要表面標(biāo)志物，Th 細(xì)胞可誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，CTL 細(xì)胞具有抑制體液免疫和殺傷靶細(xì)胞的功能，各亞群協(xié)同作用，共同維護(hù)機(jī)體的正常免疫功能。當(dāng) T 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量或比例發(fā)生異常，機(jī)體免疫可能會(huì)出現(xiàn)紊亂[1-3]。在流式細(xì)胞術(shù)中，標(biāo)記抗體所用的熒光素一般為 FITC、R-藻紅蛋白（R phycoerythrin，PE）、異藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）、葉綠素蛋白（phyllochlorin，PerCP）、Alexa Fluor、藻紅蛋白-花菁染料 Cy7 復(fù)合熒光（PE-Cy7）、藻紅蛋白-花菁染料 Cy5 復(fù)合熒光（PE-Cy5）等[4,8]。選用不同熒光標(biāo)記抗 CD3、CD4 或 CD8 抗原的抗體，通過與相應(yīng)細(xì)胞上的表面標(biāo)志物結(jié)合，可檢測(cè) T 淋巴細(xì)胞亞群。作為非人靈長(zhǎng)類，食蟹猴與人的免疫系統(tǒng)較為接近，是生物技術(shù)藥物安全性評(píng)價(jià)的常用動(dòng)物種屬。本研究在 GLP 實(shí)驗(yàn)室條件下分別應(yīng)用兩組不同的三色熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體組合（PerCPCD3/FITC-CD8/PE-CD4）（檢測(cè)抗體組合 1）和PerCP-CD3/FITC-CD4/PE-CD8（檢測(cè)抗體組合 2）測(cè)定食蟹猴外周血 T 淋巴細(xì)胞亞群 CD3+CD8+細(xì)胞和 CD3+CD4+細(xì)胞，篩選更優(yōu)的熒光標(biāo)記檢測(cè)抗體，提高研究結(jié)果可靠性。

研究發(fā)現(xiàn)，在雌、雄食蟹猴，無論 CD4+或CD8+T 淋巴細(xì)胞，用 FITC 熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，相應(yīng)細(xì)胞百分比均顯著低于用 PE 熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)的結(jié)果，雌性動(dòng)物差異更為明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，用 FITC 標(biāo)記抗體檢測(cè)的 CD4+或 CD8+淋巴細(xì)胞的 MFI 顯著低于用 PE 標(biāo)記抗體檢測(cè)的相應(yīng)細(xì)胞 MFI，前者僅為后者的 4% 或 9%。已有研究顯示，F(xiàn)ITC 與 PE 的熒光強(qiáng)度、穩(wěn)定性以及熒光淬滅衰減速率等特性存在差異。FITC 具有優(yōu)良的熒光量子產(chǎn)率和良好的水溶性，是生物學(xué)中應(yīng)用非常廣泛的一種熒光素，其最大吸收光波長(zhǎng)為 490～495 nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為 520～530 nm，在藍(lán)光激發(fā)下呈綠色熒光，但由于綠光與藍(lán)光的斯托克位移小，存在一定的背景光干擾。另外 FITC 較 PE 容易淬滅，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下會(huì)產(chǎn)生葡萄糖酸，葡萄糖酸可以淬滅FITC[9]。PE 是一種從海藻中提取出來的水溶性捕光色素蛋白，吸收光波長(zhǎng)為 490～560 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為 595 nm，激發(fā)后呈明亮的紅色熒光，發(fā)射光受激發(fā)光影響小，熒光幾乎不受生物質(zhì)本底熒光影響。PE 含有更多的色基基團(tuán)，具有保守、相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，不易淬滅，具有良好的生物相容性、較高的 pH 穩(wěn)定性、高摩爾消光系數(shù)、高熒光量子產(chǎn)率等性能。1 個(gè)分子的 PE 熒光強(qiáng)度在可比波長(zhǎng)內(nèi)至少相當(dāng)于 30 個(gè) FITC 或 100 個(gè)羅丹明分子，檢測(cè)靈敏度顯著高于傳統(tǒng)的熒光染料，檢測(cè)限可達(dá) pmol/L[10-12]。有研究者進(jìn)行了 PE 和 FITC分別標(biāo)記抗豬瘟病毒熒光抗體檢測(cè)靈敏度比較。PE標(biāo)記的熒光抗體探針檢測(cè)陽性微球均呈明亮的橘黃色熒光，檢測(cè)的靈敏度是 FITC 標(biāo)記抗體探針檢測(cè)靈敏度的 10 倍[13]。另有研究者發(fā)現(xiàn) PE 標(biāo)記熒光抗體探針檢測(cè)禽流感病毒的靈敏度是 FITC 標(biāo)記抗體探針檢測(cè)的 5 倍[14]。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致或接近。由于 PE 和 FITC 處在同一波長(zhǎng)上，利用一種光源系統(tǒng)就能觀察到兩種顏色，而且兩者所激發(fā)的熒光顏色成鮮明的對(duì)比，因此可以用于流式細(xì)胞儀的雙重或多重免疫染色定量分析[13]。本研究結(jié)果中 FITC 標(biāo)記抗體檢測(cè)細(xì)胞百分比的降低，可能是由于 FITC 熒光強(qiáng)度低、存在背景光干擾和容易淬滅的特性，也可能是 FITC 標(biāo)記抗體與 CD3+CD4+細(xì)胞或 CD3+CD8+細(xì)胞的結(jié)合均弱于 PE 熒光標(biāo)記抗體與相應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合。

目前，在新藥非臨床安全性評(píng)價(jià)中用流式方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞型時(shí)，對(duì)于抗凝劑的選擇沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究分別考察了使用抗凝劑肝素鈉和EDTA-K2檢測(cè)食蟹猴外周血 T 淋巴細(xì)胞亞群的結(jié)果，以優(yōu)化試驗(yàn)條件，減少抗凝劑因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。肝素鈉和 EDTA-K2是流式試驗(yàn)中常用的兩種外周血抗凝劑。肝素鈉的抗凝機(jī)制是能夠與抗凝血酶（antithrombin，AT）結(jié)合，催化滅活凝血因子 IIa、IXa、Xa、Xia 和 XIIa。AT 有一個(gè)精氨酸反應(yīng)中心可以和前述凝血因子的絲氨酸活化中心共價(jià)結(jié)合，從而使其失去活性，肝素鈉與 AT 的結(jié)合可加速這種抗凝血作用。EDTA-K2的抗凝機(jī)制是能與血液中的 Ca2+螯合，使凝血酶原無法轉(zhuǎn)化成有活性的凝血酶，同時(shí)抑制血小板聚集，從而起到抗凝作用[15]。

本研究結(jié)果顯示，與肝素鈉抗凝組相比，EDTA-K2抗凝劑組 CD8+淋巴細(xì)胞百分比和 CD8+細(xì)胞 MFI 均顯著降低，下降的幅度很大。兩種抗凝劑分別處理后 CD4+淋巴細(xì)胞百分比和 CD4+細(xì)胞 MFI 均無非常顯著差異。提示肝素鈉抗凝劑對(duì)于用熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)食蟹猴外周血樣本中T 淋巴細(xì)胞亞群沒有明顯影響，而 EDTA-K2抗凝劑對(duì)于 FITC 或 PE 熒光標(biāo)記的抗 CD8 抗體檢測(cè)食蟹猴外周血 CD8+T 淋巴細(xì)胞有非常明顯的干擾作用，出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是由于 T 淋巴細(xì)胞激活需要將鈣離子攝取到細(xì)胞內(nèi)[16-18]，而EDTA-K2抗凝的原理是螯合血液中鈣離子，這種競(jìng)爭(zhēng)作用會(huì)抑制 T 淋巴細(xì)胞的活性，但是否會(huì)抑制細(xì)胞表面 CD8 抗原的表達(dá)及是否與上述結(jié)果直接相關(guān)需要進(jìn)一步研究。也有可能是 EDTA-K2影響抗 CD8 抗體與食蟹猴外周血 CD8+T 淋巴細(xì)胞的結(jié)合。本研究提示對(duì)于流式分析中外周血淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記，肝素鈉抗凝劑優(yōu)于 EDTA-K2抗凝劑。有研究者比較肝素鈉、EDTA-K2和枸櫞酸鈉三種抗凝劑對(duì)于 6 份豬外周血 CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD3+CD4+T 細(xì)胞、CD3+CD8+T 細(xì)胞測(cè)定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)在第 1、2、4 天檢測(cè)時(shí)，三種抗凝劑組前述細(xì)胞數(shù)量無顯著差異，結(jié)合更長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果綜合分析，肝素鈉抗凝管測(cè)定結(jié)果優(yōu)于EDTA-K2和枸櫞酸鈉抗凝[5]。另有研究選用 10 個(gè)健康人外周血，比較肝素鈉和 EDTA-K2抗凝后不同時(shí)間、溫度下的 CD3+、CD4+和 CD8+T 細(xì)胞、CD19+B 淋巴細(xì)胞百分比及絕對(duì)計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDTA-K2和肝素抗凝的標(biāo)本在 4 ℃ 及室溫保存至48 h 時(shí)，各類淋巴細(xì)胞百分比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[6]。這與本研究結(jié)果不同，可能是抗凝劑對(duì)人體和食蟹猴外周血淋巴細(xì)胞的影響存在種屬差異，另外人外周血試驗(yàn)樣本數(shù)也較少。

綜上所述，本研究針對(duì)常用的兩組三色熒光檢測(cè)抗體和兩種抗凝劑進(jìn)行了食蟹猴外周血 T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果比較分析，提示 FITC 熒光標(biāo)記抗 CD4 抗體和抗 CD8 抗體檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞百分比和熒光強(qiáng)度均小于 PE 熒光標(biāo)記的抗體，在應(yīng)用這兩種熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行 T 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響和合理分析。使用 EDTA-K2抗凝對(duì)食蟹猴外周血 CD8+淋巴細(xì)胞測(cè)定結(jié)果有明顯影響，在進(jìn)行食蟹猴 T 淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定時(shí)宜使用肝素鈉抗凝劑。本次研究只針對(duì)常用的兩組三色熒光檢測(cè)抗體進(jìn)行了比對(duì)，今后可進(jìn)一步對(duì)其他檢測(cè)抗體組合做相關(guān)研究。目前多色流式分析儀如 FACSCanto、FACSAria 和 LSRFortessa 等已經(jīng)得到較多應(yīng)用，確定不同熒光標(biāo)記抗體對(duì)同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)胞是否有影響對(duì)于進(jìn)行可靠的流式分析有重要意義，需要進(jìn)行更多的關(guān)注和研究。