去泛素化酶BAP1在肝細胞癌發展中的功能研究

仲彤，王艷雙，王嬋娟，張曉莉，王澤，張令強，崔春萍

作者單位：100850 北京，軍事科學院軍事醫學研究院生命組學研究所

原發性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是危害人類健康的重大疾病，在中國的癌癥死亡率中排名第二[1]。我國是病毒性肝炎高發區，HCC 的發病率位居世界首位，每年死于 HCC 的患者占全球 HCC 死亡人數的 50% 以上[2]。近年來，隨著多種治療方法和藥物在臨床上的應用，肝癌患者的預后得到了明顯改善，但由于頻繁的術后復發和治療抵抗的發生，總體來看治療效果仍然不盡人意。因此，深入研究肝癌發病機制并發展新的治療策略是關系我國人民健康的重大科學問題。

去泛素化酶（deubiqutinase，DUB）是泛素化修飾途徑中一類重要的調節分子，能夠通過特異性剪切或加工泛素鏈來控制底物蛋白的穩定性和

生物活性，進而參與機體的生理和病理過程。目前報道的 DUB 家族成員超過 100 個，根據其功能和結構特點分為 6 個亞家族（USP、UCH、OUT、MJD、JAMM 和 MCPIP），但目前對其結構、功能和作用的分子機制了解并不多[3]。近年來的研究顯示，DUB 成員在 DNA 損傷修復[4]、機體生長發育[5]、免疫調控[6]以及腫瘤發生發展[7]等重要生理和病理過程中發揮功能。BAP1（BRCA1 association protein 1），即 BRCA1（breast cancer type 1 susceptibility protein）結合蛋白 1，是定位于細胞核中的一個 UCH（ubiquitin carboxyl hydrolase）亞家族去泛素化酶。目前的大部分研究顯示 BAP1 在腎透明細胞癌、葡萄膜黑素瘤、胸膜間皮瘤、膽管癌等腫瘤中突變或缺失，且其過表達能夠抑制腫瘤細胞的生長，被認為是一個抑癌基因[8-9]。而近期的研究則報道 BAP1 能夠通過調控 KLF5 的去泛素化，促進乳腺癌的生長[10]。因此，BAP1 在不同類型腫瘤中可能有著不同的功能和作用機制。Jhunjhunwala 等[11]通過分析 30 例 HCC 病人的外顯子測序數據，2014年首次報道了 HCC 存在BAP1 突變（D84V）。同年，Janku 等[12]分析了14 例高轉移 HCC 病人腫瘤組織的二代測序數據，并報道了兩個 BAP1 突變。目前對 BAP1 突變和表達變化的臨床意義及其功能和調控的分子機制的報道仍然較少。Hirsch 等[13]采用 RNAseq和全基因組或全外顯子組測序方法分析了 151 例肝腫瘤，包括 126 例 HCC，15 例 FLC 和 10 例混合 FLC/HCC。經 Western blot 實驗驗證并對比TCGA 數據庫后，鑒定出由 BAP1 驅動的 HCC亞組，其具有纖維狀樣特征和 PKA 途徑失調，這可能是 BAP1 腫瘤與 DNAJB1-PRKACA FLC 之間臨床和組織學相似性的根源。Ningarhari 等[14]在1502 例患者（978 例 HCC）的腫瘤和非腫瘤肝組織中測量了 TL，并通過基因組、外顯子組、靶向或 RNA 測序分析了 TERT 改變和 HCC 的表達、臨床和分子特征，發現在肝中長端粒的肝癌通常是具有祖細胞特征和 BAP1 突變的 TERT 野生型。雖然 BAP1 失活可能通過表觀遺傳調控在 TERT表達中起作用[15]，但其研究結果提示，TERT 的弱表達表明 BAP1 失活可能與端粒維持的另一機制相關，尚待確定。因此，深入研究 BAP1 表達及突變與 HCC 的臨床相關性，闡明 BAP1 調控肝癌細胞生物學特性的功能作用，探索其作用的分子機制具有重要意義。

本文通過分析 TCGA 數據庫中 375 例 HCC病人的基因組和轉錄組數據，發現與正常肝組織相比，BAP1 在 HCC 組織樣本中突變差異顯著，且BAP1 突變與病人預后良好密切相關。細胞學實驗顯示敲低 HCC 細胞中 BAP1 表達能夠顯著抑制細胞的生長和遷移。而 BAP1 的錯義點突變導致其促腫瘤生長的功能喪失。該研究提示 BAP1 作為一個促癌基因調控 HCC 生長，可能是 HCC 治療的一個潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞培養器材購自美國 Costar 公司；實驗用6～7 周齡 BALB/c 裸鼠購自北京維通利華公司；Anti-BAP1（SC-28383）購自美國 Santa 公司；G418 購自美國 Thermo Scientific 公司；小牛血清購自美國 Gibco 公司；胰蛋白酶購自美國 Sigma公司；DMEM 培養基購自美國 Hyclone 公司；點突變試劑盒購自日本 Toyobo 公司；電泳儀、電轉儀購自美國 Bio-Rad 公司；transwell 小室購自美國康寧公司；其他試劑均為國產分析純試劑。肝癌細胞系 LO2、HepG2、SK-Hep2、PLC-PRF-5、SMMC7721 、 Bel7402 、 Huh7 、 MHCC-97L 、MHCC-97H、MHCC-LM3 均為本實驗室凍存；質粒：pcDNA-BAP1、pcDNA-BAP1C91S、GST-BAP1、shBAP1#3、shBAP1#6 由中國科學院陳策實教授實驗室贈予。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 細胞于 10% 小牛血清DMEM 培養基中貼壁培養，于 37 ℃、5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養。

1.2.2 BAP1 點突變體構建 首先將引物稀釋為10 pmol/L：滅菌蒸餾水 35 μl，10 × Buffer for iPCR 5 μl，2 mmol/L dNTPs 5 μl，引物 1（10 pmol/μl）1.5 μl，引物 2（10 pmol/μl）1.5 μl，質粒 DNA 1 μl，KOD-Plus 1 μl；總體積 50 μl。用 DnpI 對模板質粒 DNA 進行消化；PCR 結束后，加入 2 μl DpnI，37 ℃ 反應 1 h。PCR 產物自身環化：DnpI 處理后 PCR 產物 2 μl，滅菌蒸餾水 7 μl，高效連接試劑 5 μl，T4 Polynucleotide Kinase 1 μl；總體積15 μl。16 ℃ 反應 1 h。轉化：取出 100 μl DH5α 感受態細胞，置于冰上溶解；然后取出自身環化產物10 μl，加入感受態細胞中，輕輕混勻并于冰上放置30 min；42 ℃ 熱激 90 s，然后冰浴放置 2 min；加入 900 μl 無雙抗的 LB 培養基，37 ℃ 振蕩培養 1 h；取適量涂布于適當的抗生素 LB 平板；最后置于 37 ℃ 培養箱中培養過夜約 6 h。突變體的確認：挑取 4～8 個菌落用內切酶處理后電泳，根據酶切圖片確認是否突變；對必要片段測序以確定序列。質粒提?。菏杖?16 h 前搖的菌，置于離心機離心 15 min，轉速 4000 r/min，棄去上清液；每管加入含有 RNA 酶的重懸液 250 μl，輕輕重懸；再加入 250 μl 的裂解液，輕輕上下翻轉 10 次混勻，靜置 4 min；最后加入中和液中和，輕輕上下翻轉 10 次混勻，并于離心機離心 15 min，轉速12 000 r/min；將上清置于質粒吸附柱中，于離心機離心 1 min，轉速 12 000 r/min，并重復此步驟；加入 500 μl 洗液洗第一次，離心機離心 1 min，轉速 12 000 r/min；再加入 700 μl 洗液洗第二次，離心機離心 1 min，轉速 12 000 r/min；室溫靜置5 min 晾干，往吸附柱中加入 50 μl 去離子水，離心機離心 2 min，轉速 12 000 r/min；收集質粒并檢測質粒濃度。

1.2.3 回轉穩定株構建 將 shRNABAP1#3、shBAP#6 轉入到 pLKO.1-puro 慢病毒載體中，載體骨架為 pCMV-Myc，用 pLKO.1-puro-shBAP1逆轉錄病毒感染 SMMC7721 和 Bel7402 細胞；48 h 后，使用終濃度為 3 μg/ml 的嘌呤霉素篩選1 周，收集穩定的 BAP1 敲低細胞系；然后，將pcDNA3.1(-)-Myc-BAP1WT、pcDNA3.1(-)-Myc-BAP1G45R、pcDNA3.1(-)-Myc-BAP1C91S、pcDNA3.1(-)-Myc-BAP1H169Q、pcDNA3.1(-)-Myc-BAP1F170V、pcDNA3.1(-)-Myc-BAP1W196G 和pcDNA3.1(-)-Myc-BAP1W202L 質粒加入到SMMC7721 和 Bel7402 BAP1 穩定敲低的細胞系中；使用終濃度為 350 mg/ml G418 篩選 3 周，得到過表達 BAP1 點突變的穩定株；最后進行Western blot 驗證。

1.2.4 克隆形成實驗 取對數生長期的細胞，加入胰蛋白酶消化，輕輕吹打；使用細胞計數儀對細胞進行計數，每個六孔板鋪 1000 個細胞；置于含有 CO2的細胞培養箱中靜置培養 2～3 周，每隔2 天換液一次；當六孔板中出現較大的細胞克隆時，棄去培養液；先用 PBS 洗 3 次，加入 4% 的多聚甲醛固定 15 min；棄去固定液，使用 0.1% 結晶紫染色液染色 25 min；最后用肉眼直接計數克隆形成率。

1.2.5 細胞遷移實驗 將 SMMC7721 細胞或Bel7402 細胞以 1 × 105個/孔接種在 transwell 板小室的上室中，加入 100 μl 無血清 α-MEM 培養基，底部加入 200 μl 含有高濃度血清（20%）的DMEM；使細胞在含有 5% CO2的細胞培養箱中遷移 12～18 h。將 transwell 小室取出，將靠近下室膜那一面的細胞用棉簽輕輕擦去；另一面的細胞用 4% 多聚甲醛室溫固定 30 min，結晶紫染色20 min，用 PBS 清洗 3 遍；最后在顯微鏡下觀察并計數。

1.2.6 免疫印跡分析 用預冷的 1 ml PBS 洗滌細胞，加入預冷的細胞裂解液（106個/50 μl）；4 ℃ 放置 30 min 以上使細胞徹底裂解，隨后12 000 r/min、4 ℃ 離心 30 min，收集上清。蛋白定量后，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白轉移至 PVDF 膜上，置于 5% 脫脂牛奶中封閉，然后用一抗 4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗滌 3 次，每次5 min，加二抗孵育 1 h，TBST 洗滌 3 次，每次15 min，ECL 顯色，放射自顯影。

1.2.7 裸鼠成瘤實驗 選用 6～7 周齡，雄性裸鼠18 只，分為 3 組，每組 6 只；裸鼠接種后分籠飼養，皮下瘤接種的細胞量為 2 × 106個/只；接種的體積為 100 μl，細胞懸液的濃度為 2 × 107個/ml；腫瘤細胞注射使用 1 ml 的注射器，接種時，針頭在裸鼠皮下組織進針約 1 cm 深度；接種后一周左右可見到皮下開始出現腫塊，皮下成瘤的周期為35 d；不同的細胞類型和接種的細胞數量會影響皮下成瘤的時間，使用游標卡尺定期測量腫瘤的大小，每 3 天測一次，腫瘤不宜生長過大，一般不要超過 1000 mm3；當腫瘤長到合適大小時處死裸鼠并進行解剖，對接種瘤進行觀察、測量，記錄；多聚甲醛固定，用于后期的免疫組化、免疫熒光等實驗。

1.2.8 臨床數據分析 從 TCGA（https://gdcportal.nci.nih.gov/）下載肝癌臨床指標數據（包括腫瘤分期、分化程度）及術后生存期數據；利用χ2test檢測候選基因突變、表達量與腫瘤分期、分化程度等臨床指標的相關性；利用 log rank test、cox 回歸分析檢測候選基因突變、表達量與術后生存期的相關性；從 TCGA 下載肝癌體細胞突變數據文件（376 個）；統計 100 個基因在 376 個樣本中的突變頻率，篩選高頻突變基因。

1.2.9 外顯子序列分析 從 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）查詢 BAP1 外顯子序列，利用NCBI 中 BLAST 工具將實驗所用人正常肝細胞LO2 及 9 種肝癌細胞系 BAP1 外顯子序列測序結果與 NCBI 查詢到的 BAP1 外顯子理論序列進行對比分析，確定實驗用肝癌細胞系的 BAP1 外顯子是否發生突變。

2 結果

2.1 TCGA 數據中 BAP1 的突變頻率、類型及其表達變化的分析

利用 TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫，分析了 100 個 DUBs 在人 HCC 樣本中的突變情況。我們一共獲得了 375 例 HCC 患者的364 個有效樣本，共 44 845 個體細胞突變數據，利用 Maftools 軟件繪制基因突變圖譜。在突變圖譜中，TP53 突變率最高，約為 28%，而顯著突變的 DUBs 家族成員只有 BAP1，突變率約為5.31%，如圖 1所示。

圖1 TCGA 數據庫中 HCC 樣本突變基因圖譜Figure 1 Mutant gene map of HCC samples in TCGA database

利用 Maftools 軟件分析 BAP1 基因突變的分布情況，如圖 2所示，375 例肝癌樣本（包含2 例復發的樣本）中有 22 例出現突變，其中包含2 個突變缺失、9 個移碼突變、5 個無義突變、6 個錯義點突變。具體分析發現，6 個錯義點突變，分別為 G45R、C91S、H169Q、F170V、W196G 和W202L，其中有 5 個錯義點突變位于 BAP1 的UCH（ubiquitin C-terminal hydrolases）結構域。

圖2 TCGA 數據庫中 BAP1 基因突變位點注釋Figure 2 Annotation of BAP1 gene mutation site in TCGA database

2.2 BAP1 的突變及表達變化與臨床病理指標的相關性分析

生存分析結果顯示，BAP1 錯義點突變與HCC 患者較好的預后相關（圖 3A）（P=0.0316)，即 BAP1 突變的 HCC 病例中存活期顯著高于無BAP1 突變的病例。分析表達量（RNA-Seq）數據顯示 BAP1 突變的 HCC 組織中，其 mRNA 水平均顯著下降（圖 3B）。

圖3 BAP1 突變與患者預后的相關性（A：BAP1 突變患者預后良好，n=365；B：BAP1 mRNA 在 HCC 組織中表達量分析，n=371）Figure 3 Correlation between BAP1 mutation and patient outcome (A:Patients with BAP1 mutation had a good prognosis,n=365;B:Analysis of expression level of BAP1 mRNA in HCC tissues,n=371)

進一步分析發現，在 371 例 HCC 樣本中BAP1 mRNA 呈高表達（圖 3B），而且在男性中的表達水平顯著高于女性（圖 4A），生存分析顯示BAP1 mRNA 高表達與患者較差的預后密切相關（P=0.0207)（圖 4B）。

圖4 HCC 組織中 BAP1 mRNA 表達及其與患者預后相關性（A：BAP1 mRNA 表達存在性別差異；B：BAP1 mRNA 高表達提示預后差）Figure 4 BAP1 mRNA expression in HCC tissues and its correlation with patient prognosis (A:Sex difference in BAP1 mRNA expression;B:High expression of BAP1 mRNA pointed the poor prognosis)

2.3 BAP1 敲低抑制 HCC 細胞的生長和遷移

為了研究 BAP1在肝癌細胞中的功能，首先檢測了 BAP1 在人正常肝細胞 LO2 和不同肝癌細胞系中的表達情況，Western blot 結果顯示，BAP1 在 8 種肝癌細胞系中呈高表達，而在 Huh7細胞系中表達缺失（圖 5A）。同時，對實驗使用的人正常肝細胞和 9 種肝癌細胞系中 BAP1 的外顯子進行了測序比對，結果顯示 9 種肝癌細胞系及人正常肝細胞均表達野生型 BAP1，結合 q-PCR結果，顯示 Huh7 中 BAP1 的 mRNA 表達水平并未下降（圖 5B），提示 Huh7 細胞系中 BAP1 的表達缺失可能涉及到蛋白質翻譯后修飾的調控。

圖5 BAP1在肝癌細胞系中的表達變化（A：蛋白表達水平；B：mRNA 表達水平）Figure 5 Expression changes of BAP1 in hepatoma cell lines (A:Protein expression level;B:mRNA expression level)

根據 BAP1 在不同肝癌細胞系中的基礎表達水平，利用 shRNA 技術，成功建立了BAP1 穩定敲除的 SMMC7721 和 Bel7402 肝癌細胞系（圖6A）。利用 CCK8 檢測試劑盒檢測細胞增殖情況，發現 BAP1 敲低抑制肝癌細胞的增殖（圖 6B）。Transwell 實驗證實 BAP1 敲低抑制肝癌細胞遷移（圖 6C）。

圖6 BAP1 敲低抑制肝癌細胞的生長和遷移（A：SMMC7721 和 Bel7402 細胞系 BAP1 敲低穩定株構建成功；B：細胞增殖檢測；C：細胞遷移、侵襲檢測和統計學分析；*P <0.05，**P <0.01）Figure 6 BAP1 knockdown inhibited the growth and migration of HCC cells (A:SMMC7721 and Bel7402 cell lines BAP1 were successfully constructed;B:Cell proliferation detection;C:Cell migration,invasion and statistical analysis;*P <0.05,**P <0.01)

2.4 BAP1 敲低抑制 HCC 細胞在裸鼠皮下的成瘤能力

利用裸鼠皮下移植瘤模型檢測 BAP1 在體內對肝癌細胞生長的影響，發現與對照組（NTC 組）相比較，BAP1 敲除的 SMMC7721 細胞在裸鼠皮下的生長變慢（圖 7），提示 BAP1 敲低顯著抑制腫瘤細胞生長。

圖7 BAP1 敲低抑制肝癌細胞在裸鼠皮下的生長[A：使用公式（長度 × 寬度2）/2 將平均腫瘤體積作為時間的函數作圖，（*P <0.05、**P <0.01、***P <0.001），與對照組 BAP1 NTC 腫瘤進行比較；B：小鼠切除的腫瘤；C：腫瘤重量統計分析（*P <0.05、**P <0.01），與對照組 BAP1 NTC 腫瘤進行比較]Figure 7 BAP1 knockdown inhibits subcutaneous growth of hepatocellular carcinoma cells in nude mice[A:Plot average tumor volume as a function of time using the formula (length × width2 × 1/2) (*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001) to compare with BAP1 NTC tumors in the control group;B:Tumors resected in mice;C:Statistical analysis of tumor weight (*P <0.05,**P <0.01) to compare with BAP1 NTC tumors in the control group]

2.5 BAP1 錯義點突變抑制其促腫瘤生長的功能

為了進一步分析 BAP1 錯義點突變對其功能的影響，構建了攜帶 BAP1 野生型及不同的突變體（包括 BAP1G45R、BAP1C91S、BAP1H169Q、BAP1F170V、BAP1W196G 和 BAP1W202L）的真核表達載體。分別將野生型和不同突變體的 BAP1過表達質粒轉染致BAP1 敲低的 Bel7402 細胞和Huh7 細胞（BAP1 表達缺失）中。通過 G418 連續篩選，獲得穩定過表達 BAP1 野生型和不同突變體的 Bel7402 和 Huh7 細胞系（圖 8）。

圖8 穩定過表達野生型和不同突變體 BAP1 的肝癌細胞系的建立Figure 8 Establishment of HCC cell lines stably overexpressing wild-type and different mutants of BAP1

利用經典的克隆形成實驗分析錯義點突變對BAP1 促細胞增殖的影響。細胞培養 3 周后進行平板計數，發現 BAP1 敲低細胞增殖受到抑制，而當過表達入 pcDNA3.1(-) 載體的 BAP1WT 質粒后，細胞增殖數目有所增多，而過表達 BAP1G45R、

BAP1C91S、BAP1H169Q、BAP1F170V、BAP1W196G

和 BAP1W202L 這 6 個突變體后，Bel7402 細胞的增殖能力受到明顯抑制（P<0.01）（圖 9A）。同時，利用 Huh7 細胞檢測錯義點突變對 BAP1 功能的影響。細胞培養 3 周后統計克隆形成率，檢測這 9 種細胞的增殖能力，發現與對照組（BAP1 WT）相比，BAP1 突變的細胞株增殖能力受到明顯抑制（圖 9B）。

圖9 BAP1 錯義點突變對肝癌細胞生長的影響[A：Bel7402 克隆形成實驗檢測細胞增殖和統計學分析（**P <0.01）；B：Huh7 克隆形成實驗檢測細胞增殖和統計學分析（**P <0.01）]Figure 9 Effects of BAP1 missense point mutation on the growth of hepatoma cells[A:Cell proliferation and statistical analysis by Bel7402 clone formation assay (**P <0.01);B:Huh7 clone formation assay to detect cell proliferation and statistical analysis (**P <0.01)]

2.6 BAP1 錯義點突變抑制其促腫瘤遷移的功能

利用 transwell 實驗檢測細胞的遷移能力，結果顯示 BAP1 敲低細胞遷移能力受到抑制，而當過表達入 pcDNA3.1(-) 載體的 BAP1WT 質粒后，細胞遷移能力增強，過表達 BAP1G45R、BAP1C91S、BAP1H169Q 、 BAP1F170V 、 BAP1W196G 和BAP1W202L 這 6 個突變體后，Bel7402 細胞的遷移能力受到明顯抑制（P<0.01）（圖 10A）。同時利用 Huh7 細胞系檢測細胞遷移能力，結果顯示G45R 和 W196G 突變顯著抑制了 BAP1 促進細胞遷移的能力（圖 10B）。

圖10 BAP1 錯義點突變對肝癌細胞遷移能力的影響[A：Bel7402 transwell 檢測細胞遷移和統計學分析（**P <0.01）；B：Huh7 transwell 檢測細胞遷移和統計學分析（**P <0.01，***P <0.001）]Figure 10 Effects of BAP1 missense point mutation on migration of hepatoma cells[A:Bel7402 transwell assay for cell migration and statistical analysis (**P <0.01);B:Huh7 transwell assay for cell migration and statistical analysis (**P <0.01,***P <0.001)]

2.7 BAP1 錯義點突變抑制其促進裸鼠成瘤的能力

為進一步在體內驗證錯義點突變對 BAP1 功能的影響，利用裸鼠皮下移植瘤實驗，檢測過表達野生型 BAP1 和突變型 BAP1（G45R 和 W196G）對肝癌細胞 Bel7402 裸鼠皮下移植瘤生長能力的影響。選用 6～7 周齡的裸鼠皮下注射穩定過表達BAP1 野生型和突變體的肝癌細胞，通過兩個參數——腫瘤體積生長速率（mm3/d）和最終腫瘤體積（mm3）分析。腫瘤細胞注射 35 d 后，發現 BAP1 WT 組腫瘤體積最終達到 138 mm3，而 BAP1G45R組和 RAP1W196G 組最終體積分別為 37 mm3和48 mm3，顯著小于對照組（WT），提示 G45R 和W196G 位突變抑制了 BAP1 的促瘤作用，如圖 11所示。

圖11 BAP1 錯義點突變對肝癌細胞在裸鼠皮下生長的影響[A：腫瘤重量統計分析 **P <0.01，與 WT BAP1 腫瘤進行比較；B：裸鼠成瘤；C：小鼠切除的腫瘤；D：使用公式（長度 × 寬度2）/2 將平均腫瘤體積作為時間的函數作圖，*P <0.05、**P <0.01，與 WT BAP1 腫瘤進行比較]Figure 11 Effect of BAP1 missense point mutation on subcutaneous growth of hepatocellular carcinoma cells in nude mice[A:Statistical analysis of tumor weight **P <0.01,compared with WT BAP1 tumors;B:Tumor formation in nude mice;C:Tumors resected in mice;D:Average tumor volume plotted as a function of time using the formula (length × width2 × 1/2),*P <0.05,**P <0.01,compared with WT BAP1 tumors]

3 討論

人類 BAP1 基因定位于 3 號染色體（3p21），在很多腫瘤細胞中該區域都會出現缺失或重排[16]。BAP1 作為一個 DUBs，可通過與多種蛋白形成三元復合體結構，在不同類型的細胞中發揮調節細胞生理活動、促進細胞增殖和細胞周期的功能[17-18]，干擾細胞中的 BAP1 表達時，會出現細胞 G1/S期過度延遲；敲除 BAP1 后，細胞生長減緩[19]。近年來盡管有研究報道 BAP1 在 HCC 組織中存在突變，但其突變和表達的臨床意義以及在 HCC發生發展中的功能作用未見任何報道。

在本研究中，我們闡明了 BAP1 體細胞突變和表達與 HCC 的臨床相關性，通過分析 TCGA 數據庫 375 例 HCC 患者的 377 個樣本（包含 2 例復發的樣本），共 44 845 個體細胞突變數據，發現與正常肝組織相比，BAP1 在 22 例 HCC 組織樣本中存在顯著突變，此外，我們結合 BAP1 的 RNA表達量（RNA-Seq）數據分析，發現 BAP1 mRNA在 HCC 組織中高表達，生存分析數據顯示 BAP1 mRNA 高表達與病人預后差密切相關。結合TGCA臨床數據發現，BAP1 突變的 HCC 組織中，mRNA水平均顯著下降，生存分析數據顯示 BAP1 突變與病人良好預后密切相關，提示 BAP1 突變抑制腫瘤的生長，BAP1 突變在 HCC 中作為一個抑癌因子發揮功能。同時，經過 Western blot 檢測了BAP1 在多種肝癌細胞中高表達。進而建立了BAP1 穩定敲低的肝癌細胞系，發現 BAP1 敲低能夠抑制細胞增殖、遷移能力以及抑制裸鼠的成瘤等生物學特性，提示 BAP1 在 HCC 組織中發揮一定的促癌功能。

然而本研究仍然有很多問題沒有解決，比如缺乏本地肝癌樣本測序數據對 BAP1 的突變頻率、類型與其表達的變化的分析，缺乏 PDTX（patient-derived tumor xenograft）小鼠模型[20]對BAP1 突變的 HCC 樣本在體內生長、轉移及耐藥特性的分析；在 BAP1 作用機制方面，BAP1 為何在腫瘤細胞中高表達、其具體的機制是什么、BAP1突變發揮抑癌作用的具體機制是什么、是否依賴其去泛素化功能發揮作用？這些問題需要我們進一步篩選并鑒定肝癌細胞中 BAP1 相互作用蛋白，揭示其作用的分子機制，探索 BAP1 突變對其去泛素化酶功能及其靶蛋白泛素化狀態的影響，BAP1 的突變及其影響的靶蛋白去泛素化在HCC生長轉移中的作用。

雖然目前 BAP1 在 HCC 中的作用機制尚未明確，但是我們可以通過了解 BAP1 已知的底物及作用機制作為研究的理論基礎。BAP1 和 ASXL1可組成多梳組抑制去泛素化復合物（polycomb group repressive deubiquitinase complex，PR-DUB），參與調節基因沉默。敲除 BAP1 基因，會明顯影響 PcG基因的表達。PcG 蛋白是形成多種蛋白復合物的一組蛋白，參與多種生理學進程，由兩個核心復合體PRC1（polycomb repressive complex 1）和 PRC2（polycomb repressive complex 2）組成，分別負責組胺泛素化和甲基化。PRC2 中的催化亞基 EZH2組胺甲基轉移酶可催化組胺 H3 賴氨酸 27 三甲胺（H3K27me3），這個與染色質轉錄阻抑相關，是PcG 蛋白引起基因沉默的標志，并為 PRC1 的識別和結合提供位點。PRC1 中 BMI-1/RING1 的E3 連接酶亞基使組胺 H2A 的賴氨酸 119 泛素化（H2AK119Ub1），可修復抑制狀態的染色質和使基因沉默。H2AK119Ub1 被認為通過誘導染色質結構的改變來抑制 RNA 多聚合酶復合物的穩定性，最終導致轉錄沉默[21]。這些發現提示 BAP1 轉錄失調是一種潛在的致癌機制[22]。目前已知的 BAP1的另一底物是 HCF-1（hot cell factor-1），HCF-1 由HCF-1N 和 HCF-1C 組成，參與眾多組胺修飾活動，調控細胞周期進程[23]。

BAP1 在其他類型腫瘤中作用機制的研究方法和結論同樣也值得我們學習參考。例如：童也等[24]在 2020年通過對從 GEO 數據庫中獲取的BAP1 敲低的骨肉瘤細胞芯片數據集的研究分析發現，與骨肉瘤細胞比較，BAP1 敲低的骨肉瘤細胞中共篩選出差異表達基因 461 個，其中上調64 個、下調 397 個，主要富集的信號通路有細胞周期和 DNA 復制相關通路，BAP1 敲低的骨肉瘤細胞差異表達基因蛋白互作網絡中度值的核心基因是 CDK1。在 BAP1 抑制條件下，骨肉瘤細胞CDK1 表達同時下調，兩者協同影響骨肉瘤的發生、發展。Liu 等[25]通過在 6 個頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）細胞系、3 個人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）陰性和 3 個 HPV 陽性中過表達、敲除和保留了 BAP1，并在體外和在 HNSCC小鼠異種移植模型中檢測其對放射敏感性的影響印證了 BAP1 可能通過 H2Aub 的泛素化和 HR的調節而誘導 HNSCC 細胞的輻射抗性，且與HNSCC 患者預后差有關，可能是治療 HNSCC 的潛在靶點。Jha 等[26]為研究 BAP1 與葡萄膜黑色素瘤的關系，將 69 例患者分為 a 組（lbd >15 mm &tumor thickness ≥ 8 mm）和 b 組（lbd ≤ 15 mm &tumor thickness <8 mm），接受免疫組織化學治療，評估了 BAP1 蛋白的表達，對每組 5 例標本進行BAP1 基因突變分析。研究發現，ATM 與 BAP1 的丟失是一個獨立的預后標志物，會導致轉移風險的增加。

本研究為我們深入理解去泛素化酶調控肝細胞癌的發生發展的作用和分子機制積累數據，可為臨床 HCC 靶向治療藥物的設計提供理論依據，為臨床腫瘤的診斷、治療等提供新思路，具有重要的科學意義。