SMARCC1的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

沈曉瑩，劉晶晶，陳曲波，亓垚，陳明敏，楊國(guó)翠，金杰，孟影，何紅梅，袁鴿，郜恒駿

作者單位：201203 上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國(guó)家工程研究中心（沈曉瑩、劉晶晶、亓垚、陳明敏、楊國(guó)翠、金杰、孟影、何紅梅、袁鴿、郜恒駿）；510120 廣州，廣東省中醫(yī)院生物資源中心（陳曲波）

腦膠質(zhì)瘤是最常見和最致命的顱內(nèi)腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、惡性高、進(jìn)展快等特點(diǎn)，通常表現(xiàn)為對(duì)正常腦組織的破壞以及對(duì)整個(gè)大腦的廣泛侵襲，常規(guī)的治療方法不能對(duì)其產(chǎn)生較好的療效[1-2]。世界衛(wèi)生組織（WHO）根據(jù)其組織病理學(xué)將膠質(zhì)瘤分為四級(jí)（I～I(xiàn)V）。即使是得到最佳治療，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（IV 級(jí)）的中位生存期僅為 12～15 個(gè)月[3-4]。因此，尋找新的靶點(diǎn)和深入了解分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)于開發(fā)更有效的腦膠質(zhì)瘤治療策略是非常必要的。

SMARCC1（SWI/SNF related,matrix associated,actin dependent regulator of chromatin subfamily c member 1），也稱為 BAF155，連同 SMARCA4、SMARCA2 和 SMARCB1 等均屬于 SWI/SNF 蛋白質(zhì)家族。SMARCC1 是一種螺旋酶和 ATP 酶，可以通過改變基因周圍的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄。SMARCC1 是 ATP 依賴的 SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物的一部分，它含有一個(gè)亮氨酸拉鏈基序，可以與許多典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[5-6]。前期的文獻(xiàn)報(bào)道顯示，SMARCC1的表達(dá)與前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥有關(guān)，但是研究結(jié)論卻并不一致[7-17]。例如，Heeb?ll等[7]證實(shí) SMARCC1 的蛋白表達(dá)與前列腺癌的Gleason 評(píng)分、臨床 T 分期和復(fù)發(fā)時(shí)間等均顯著正相關(guān)，有明顯染色的患者更容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，這證實(shí)了 SMARCC1 的促癌功能。但是，Hansen 等[8]卻發(fā)現(xiàn) SMARCC1 對(duì)前列腺癌有抑制作用，免疫組化陽性的臨床局限性前列腺癌患者的無病生存期顯著長(zhǎng)于陰性患者。類似的，SMARCC1 在結(jié)腸癌的研究也顯示了相互矛盾的結(jié)論[9-11]。而關(guān)于SMARCC1 在腦膠質(zhì)瘤的研究鮮有報(bào)道。

本文采用免疫組化實(shí)驗(yàn)研究了 SMARCC1 蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤樣本的臨床指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性；隨后利用 siRNA 技術(shù)降低了 SMARCC1 基因表達(dá)，以檢測(cè)目標(biāo)基因?qū)τ谀[瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；最后，采用 qPCR 技術(shù)檢測(cè)了增殖和凋亡相關(guān)基因 ki67 和Bcl2 在 SMARCC1 下調(diào)前后的細(xì)胞中的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片 腦膠質(zhì)瘤組織芯片（HBraG180Su01）來源于上海芯超生物科技有限公司，包含 180 例腦膠質(zhì)瘤石蠟組織。病人的手術(shù)時(shí)間為 2008年2月到 2011年10月，隨訪到 2017年7月，隨訪時(shí)間 69～113 個(gè)月；失訪1 例。大部分病人提供性別、年齡、病理分級(jí)、復(fù)發(fā)狀況等臨床信息（表 1）。

表1 SMARCC1 表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤樣本的臨床資料相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between SMARCC1 expression and clinical data of glioma samples

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 一抗 SMARCC1（AB22355）購自英國(guó) Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的二抗（DM827）和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）購自 Dako 公司；腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG 和 U87MG 購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；10% 胎牛血清（10099141C）和 DMEM 培養(yǎng)液（12430054）購自美國(guó) Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000（11668019）和逆轉(zhuǎn)錄酶 SuperScript IV Reverse Transcriptase（18090010）均購自美國(guó) Thermo Fisher 公司；針對(duì) SMARCC1 的小干擾 RNA（small interfering RNAs）siRNA-SMARCC1（簡(jiǎn)稱 si-SMARCC1）和對(duì)照 siRNA-NC（簡(jiǎn)稱 NC）（A10001）由基因制藥公司合成；檢測(cè)細(xì)胞增殖的 CCK8 試劑盒（A311-01）購自 Vazyme 公司；凋亡染色液 Hochest和 PI（C1052）采購于 Beyotime Biotechnology 公司；Trizol 試劑（T9424-200 ml）購自美國(guó) Sigma公司；qPCR 反應(yīng)試劑 SYBR?預(yù)混料 Ex-Taq? II（Tli RNaseH Plus）（RR820Q）購自 Takara 公司；各基因的 qPCR 引物由上海生工合成。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2培養(yǎng)箱（HCP-80）購自海爾公司；酶標(biāo)儀（ARM-100）購自 All For Life Science 公司；ACUMEN 掃描儀（ACUMEN eX3）購自 TTP-LabTech 公司；LightCycler480 熒光定量PCR 儀購自羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 組織芯片先經(jīng)過脫蠟和抗原修復(fù)，再加入稀釋好的一抗 SMARCC1（1:10 000）在 4 ℃ 下孵育過夜，然后使用 HRP標(biāo)記的二抗孵育，用 PBST 緩沖液沖洗，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。結(jié)果判讀：每個(gè)組織點(diǎn)的不同區(qū)域隨機(jī)選擇三個(gè)視野，每個(gè)視野判讀 100 個(gè)細(xì)胞，記錄這些細(xì)胞的平均染色強(qiáng)度和染色百分率。染色強(qiáng)度計(jì)分為：無染色（0 分）、弱染色（1 分）、中等染色（2 分）和強(qiáng)染色（3 分）。染色百分率計(jì)分為：0%（0 分）、1%～20%（1 分）、21%～40%（2 分）、41%～60%（3 分）、61%～80%（4 分）、81%～100%（5 分）。總評(píng)分=染色強(qiáng)度計(jì)分 × 染色百分率計(jì)分。得到的總評(píng)分的區(qū)間為0～15 分。將腦膠質(zhì)瘤樣本按照總評(píng)分分成兩組：IHC 總評(píng)分 ≥ 12 分為 SMARCC1 高表達(dá)組，IHC 總評(píng)分 <12 分為 SMARCC1 低表達(dá)組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過細(xì)胞核型鑒定的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG 和 U87MG 接種于含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃ 的 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，重新調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至 200 000/ml；每孔加入 0.5 ml 細(xì)胞懸浮液，37 ℃ 培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后，去除原培養(yǎng)基；按照說明書加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 和 siRNA 的混合物，37 ℃ 轉(zhuǎn)染 6 h 后更換為包含 90% DMEM 培養(yǎng)基和 10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染時(shí)，2 個(gè)細(xì)胞株都分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別轉(zhuǎn)染 siRNA-NC（簡(jiǎn)稱NC）和 siRNA-SMARCC1（簡(jiǎn)稱 si-SMARCC1）。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染 24 h 的細(xì)胞接種在 96 孔板中，每孔 100 μl 細(xì)胞懸浮液；繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，每孔加入 10 μl CCK8 在 37 ℃ 孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在 450 nm 測(cè)定吸光度。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值–空白組OD值）/（對(duì)照組OD值–空白組OD值）× 100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染 24 h 的細(xì)胞接種在 96 孔板中，每孔 100 μl 細(xì)胞懸浮液；繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后加入 100 μl 的染色液 Hochest/PI，37 ℃避光染色 20 min。用 ACUMEN 儀器掃描細(xì)胞染色結(jié)果并輸出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.5 RNA 抽提和熒光定量 PCR 實(shí)驗(yàn) 腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染 siRNA 48 h 后被消化和收集。使用 Trizol 試劑提取總 RNA，使用 SuperScript?IV逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA。采用熒光定量 PCR（qPCR）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的 SMARCC1、ki67 和 Bcl2 的mRNA 表達(dá)，Actin 作為參考基因。每個(gè)樣品的反應(yīng)總體積為 50 μl，其中包括 2 μl 0.4 μmol/L 引物混合物、25 μl SYBR 綠色母料混合物、4 μl DNA 模板和 16 μl 無 RNase/Dnase 無菌水。qPCR 程序設(shè)置：初始變性在 95 ℃ 下進(jìn)行 30 s；在 95 ℃ 下進(jìn)行 5 s，60 ℃ 下進(jìn)行 30 s，40 個(gè)循環(huán)，在 60 ℃延伸階段收集熒光數(shù)據(jù)；在 95 ℃ 下進(jìn)行 5 s，60 ℃ 下進(jìn)行 1 min，95 ℃ 結(jié)束，在 60～90 ℃ 階段收集熒光數(shù)據(jù)。各基因的 qPCR 引物序列見表 2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

排除在實(shí)驗(yàn)中脫落的組織病例，實(shí)際獲得170 例病人的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)納入SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用 Spearman 相關(guān)分析法計(jì)算SMARCC1 蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。生存期單因素分析采用 Kaplan-Meier 法和 log-rank 檢驗(yàn)，將單因素分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入COX 多元回歸生存分析。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和 qPCR 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)等均采用 GraphPad 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMARCC1 蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)、復(fù)發(fā)及預(yù)后等臨床指標(biāo)相關(guān)性

免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SMARCC1 主要定位在腦膠質(zhì)瘤組織的細(xì)胞核，且所有組織樣本均顯示了細(xì)胞核的陽性表達(dá)（圖 1）。相關(guān)染色計(jì)算成總評(píng)分后納入 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Spearman's rho 分析顯示，SMARCC1 核染色分組分別和腦膠質(zhì)瘤患者的病理分級(jí)、復(fù)發(fā)等臨床指標(biāo)顯著正相關(guān)（r=0.197，P=0.010）（r=0.188，P=0.014），而和性別、年齡等臨床指標(biāo)沒有相關(guān)性（P>0.05）（表 1）。生存期單因素分析顯示，SMARCC1 高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤病人擁有顯著更短的總生存期（OS）（54.7% 比 74.3%，P=0.012）和無病生存期（DFS）（34.4% 比 54.3%，P=0.010）（圖 2）。生存期多因素分析顯示，SMARCC1 核染色分組并不是預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（P>0.05），而年齡、病理分級(jí)等分別是腦膠質(zhì)瘤病人的總生存期和無病生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（P<0.01）（表 3，表 4）。

圖2 采用 Kaplan-Meier 法和 log-rank 法分析 SMARCC1 表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤病人的總生存期（OS）及無病生存期（DFS）的相關(guān)性Figure 2 Kaplan-Meier method and log-rank were used to analyze the correlation between SMARCC1 expression and overall survival (OS) as well as disease-free survival (DFS) of glioma patients

2.2 降低 SMARCC1 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、凋亡的相關(guān)性

轉(zhuǎn)染 48 h 后，我們使用 qPCR 技術(shù)檢測(cè)SMARCC1 在細(xì)胞株的表達(dá)變化。檢測(cè)結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比較，SMARCC1 的基因表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 的兩株細(xì)胞 U251MG 和 U87MG中分別下調(diào)了 68.1% 和 69.2%（P<0.001，P<0.001）（圖 3A）。

圖3 qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 顯著降低了 SMARCC1（A）、ki67（B）和 Bcl2（C）在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)（*P <0.05，**P <0.01，***P <0.001）Figure 3 The qPCR results indicated that the expression of SMARCC1 (A),ki67 (B) and Bcl2 (C) were all down-regulated significantly in glioma cells after si-SMARCC1 transfection (*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001)

隨后的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與對(duì)照組細(xì)胞相比較，si-SMARCC1 轉(zhuǎn)染 48 h 后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG 和 U87MG 的細(xì)胞增殖比率分別降低 14.4% 和 18.5%（P<0.01，P<0.001），而細(xì)胞凋亡比率分別提高了 42.6% 和 20.8%（P<0.0001，P<0.01）（圖 4）。

圖4 細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 顯著降低了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251MG（A）和 U87MG（B）的增殖比率而提高了凋亡比率（**P <0.01，***P <0.001，****P <0.0001）Figure 4 Results of cell functional test indicated that the proliferation of glioma cell lines U251MG (A) and U87MG (B) were decreased significantly while the apoptosis was increased after si-SMARCC1 transfection (**P <0.01,***P <0.001,****P <0.0001)

2.3 降低 SMARCC1 表達(dá)對(duì) ki67、Bcl2 表達(dá)的影響

為了研究 SMARCC1 表達(dá)與細(xì)胞增殖和凋亡等信號(hào)通路的相關(guān)性，利用 qPCR 方法檢測(cè)了SMARCC1 沉默 48 h 后的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的增殖凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染 si-SMARCC1 的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株不但抑制了 SMARCC1 的表達(dá)，同時(shí)也顯著降低了促增殖基因 ki67 和抗凋亡基因 Bcl2 的基因表達(dá)水平。其中，在 U251MG 細(xì)胞中，ki67、Bcl2 的mRNA 的表達(dá)水平分別降低了 60% 和 30%（P<0.001，P<0.01）；在 U87MG 細(xì)胞中，ki67、Bcl2的 mRNA 的表達(dá)水平分別降低了 41% 和 43%（P<0.01，P<0.05）（圖 3B、3C）。

3 討論

關(guān)于腦膠質(zhì)瘤組織芯片的免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，SMARCC1 蛋白主要定位在細(xì)胞核中。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，SMARCC1 核染色分組和腦膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)、復(fù)發(fā)等顯著正相關(guān)，且 SMARCC1 高表達(dá)的病人擁有顯著更差的總生存期和無病生存期，這提示了 SMARCC1 對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的促癌作用。

前期關(guān)于 SMARCC1 和各種癌癥的相關(guān)性研究雖然較多，但是結(jié)論卻不一致，甚至關(guān)于同一種癌癥的研究結(jié)果也互相矛盾。例如，Andersen 等[9]通過免疫組化對(duì)約 1000 例 I～I(xiàn)II 期大腸腺癌的分析表明，CBFB 和 SMARCC1 蛋白含量高的腫瘤患者的總生存率明顯高于低水平患者，提示SMARCC1 對(duì)于結(jié)腸癌具有抑癌作用。而 Ke 等[10]對(duì)于大腸癌的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)：SMARCC1 可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，是抑癌基因miR-202-5p 的直接靶點(diǎn)，且可以逆轉(zhuǎn) miR-202-5p對(duì)大腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用。值得一提的是，近幾年關(guān)于 SMARCC1 和肝癌、乳腺癌的研究均提示了該基因的促癌屬性。例如，Zhou 等[14]一次性研究了 15 個(gè) SWI/SNF 亞基在肝癌樣本的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)包括 SMARCC1 在內(nèi)的 14 個(gè)亞基在癌組織中顯著高表達(dá)，11 個(gè)亞基與病人的總生存率顯著相關(guān)。之后，他們確定了一個(gè) 4 基因的預(yù)后預(yù)測(cè)模型，包括 ACTL6A、ARID1A、SMARCC1和 SMARCD1，其過表達(dá)能有效預(yù)測(cè)更差的總生存期，提示 SMARCC1 對(duì)于肝癌預(yù)后的重要影響。

為了研究 SMARCC1 對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，我們培養(yǎng)了兩個(gè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U251MG和 U87MG，采用 siRNA 技術(shù)降低了 SMARCC1基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平。隨后的細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)顯示，與轉(zhuǎn)染 siRNA-NC 的對(duì)照組相比較，SMARCC1 基因的表達(dá)下調(diào)顯著抑制了腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。同時(shí)，qPCR 實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，腫瘤促增殖基因 ki67 和抗凋亡基因 Bcl2的 mRNA 表達(dá)水平也都出現(xiàn)了顯著下降，這與細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。由此我們推測(cè)，SMARCC1可能通過調(diào)節(jié)腫瘤增殖和凋亡相關(guān)基因而促進(jìn)了腦膠質(zhì)瘤的惡化，使其更容易復(fù)發(fā)和死亡；而病理分級(jí)差的病人表達(dá)了相對(duì)較高的目標(biāo)基因，也加速了疾病的進(jìn)展過程。

關(guān)于肝癌的研究文獻(xiàn)也證實(shí)了 SMARCC1 對(duì)于腫瘤細(xì)胞的促癌作用——SMARCC1 在肝癌細(xì)胞的表達(dá)下調(diào)能抑制細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào) MMP-2、MMP-9、Bcl2 表達(dá)而上調(diào) caspase3 表達(dá)有關(guān)[15-16]。同樣，下調(diào) SMARCC1 表達(dá)也能降低乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 的細(xì)胞增殖并提高了細(xì)胞凋亡比率，其機(jī)制可能與端粒酶活性被抑制有關(guān)[17]。這些文獻(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了我們對(duì)于 SMARCC1 的促癌機(jī)制的推測(cè)，并使我們更加有理由相信目標(biāo)基因的促癌機(jī)制可能涉及到更多更廣的基因通路，敲除或降低SMARCC1 在腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)可能對(duì)于病人的復(fù)發(fā)及預(yù)后有良好的影響。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn) SMARCC1 的表達(dá)和腦膠質(zhì)瘤病人的病理分級(jí)、復(fù)發(fā)及預(yù)后等臨床指標(biāo)顯著相關(guān)，降低 SMARCC1 基因的表達(dá)水平能顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)顯著減少了 ki67 和 Bcl2 等基因的表達(dá)水平。我們推測(cè)，SMARCC1 可能通過影響細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)信號(hào)通路來促進(jìn)癌癥進(jìn)展，是腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的重要標(biāo)記物。

志謝感謝實(shí)驗(yàn)室工作人員對(duì)于本研究實(shí)驗(yàn)過程的支持和協(xié)助；感謝綜合管理部對(duì)于本研究所用試劑耗材的采購和管理；最后，感謝國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃對(duì)本文的經(jīng)費(fèi)支持。