高效液相色譜-串聯質譜法定量測定大鼠血漿中LMV-12（HE003）及其代謝產物M4

劉淑潔，聞鎳，王宇，黃舒佳，淡墨，湯瑤，王曉霞，陶琳，耿興超，王三龍，劉麗

作者單位：100176 北京，中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監測中心藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室（劉淑潔、聞鎳、王宇、黃舒佳、淡墨、湯瑤、王曉霞、耿興超、王三龍、劉麗）；100022北京，國家藥品監督管理局藥品審評中心（劉淑潔）；330096 南昌，南昌弘益藥業有限公司（陶琳）

LMV-12（HE003）（以下簡稱 LMV-12）為小分子酪氨酸激酶抑制劑，靶向抑制 c-Met、VEGFR2及 RET 等信號通路而發揮抗腫瘤作用，殺死腫瘤細胞，減少轉移并抑制血管生成。本品是我國自主研發的創新型小分子抗腫瘤藥物，前期研究發現該化合物對人肺癌細胞和人胃癌細胞裸鼠皮下移植瘤均有明顯的生長抑制作用，但該化合物在動物體內的安全性尚待研究。同時前期藥代研究發現該化合物的代謝產物 M4 在體內暴露量較高，且與其抑制腫瘤的作用機制密切相關，故該代謝產物的安全性和體內暴露也值得關注[1-3]。在非臨床安全性研究中開展伴隨的毒代動力學研究能夠評價藥物暴露與毒性反應的關系，可靠的生物分析方法是開展毒代動力學研究的前提和基礎[1-3]。LMV-12 及其代謝產物在大鼠體內血藥濃度測定的生物分析方法及方法學驗證尚未開展，亟需建立有效可靠的分析方法、開展驗證以支持相關臨床前和臨床研究。

本研究優化樣品前處理和檢測條件，采用HPLC-MS/MS 方法，建立了同時實現 SD 大鼠血漿內 LMV-12 及代謝產物 M4 的定量研究方法，并開展了完整的方法學驗證，證明該方法的選擇性、殘留、標準曲線、定量下限、準確度與精密度、基質效應、稀釋可靠性等符合要求，并對生物基質中的待測物穩定性進行了考察。為 LMV-12 的藥代動力學和毒代動力學研究提供了可靠的生物分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物和內標 LMV-12（HE003），白色粉末，無臭，純度 99.6%；M4，類白色粉末，純度98.2%；CH3-LMV-12，白色粉末，純度 99.2%，均由南昌弘益藥業有限公司提供。

1.1.2 試劑 乙腈（HPLC 純）、甲醇（HPLC 純）、甲酸（LC/MS 純）均為美國 Fisher scientific 公司產品；甲酸銨（質譜純），Fluka；DMSO（GC 純）購自美國 Sigma 公司；超純水由 Millipore Milli-Q Advantage A10 超純水機當日制備。

生物基質：SD 大鼠混合血漿和 SD 大鼠空白個體血漿均自行制備，–70 ℃ 凍存。SD 大鼠混合血漿由 6 只以上 SD 大鼠空白個體血漿混合而得。

1.1.3 儀器 HPLC-MS/MS 儀（Accela 高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access 三重四級桿串聯質譜儀、電噴霧離子源（ESI）、Xcalibur 2.2 工作站）均購自美國 Thermo Fisher 公司；5415R 離心機購自 Eppendorf 公司；Milli-Q Advantage A10 型號超純水機購自 Millipore 公司；AX 205 和 PB 203-N型號電子天平購自 Mettler Toledo 公司；Vortex G560E 渦旋儀購自 Scientific Industries 公司。

1.2 方法

1.2.1 標準儲備液及標準工作液的配制 分別精密稱取適量 LMV-12 對照品、M4 對照品置于量瓶中，加稀釋液（50% 乙腈-水）使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為 0.2 mg/ml 的 LMV-12 對照品儲備液和 M4 對照品儲備液。儲備液用稀釋液系列稀釋后，得到系列標準工作液。

1.2.2 內標儲備液及工作液的配制 精密稱取CH3-LMV-12 對照品 10 mg，置 50 ml 量瓶中，加200 μl DMSO 溶解并用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為 0.2 mg/ml 的內標儲備液，進而用0.05% 甲酸-乙腈稀釋得到內標工作液（20 ng/ml）。1.2.3 質控儲備液及工作液的配制 質控儲備液獨立配制，配制方法同標準儲備液。用稀釋液系列稀釋后，得到目標濃度的質控樣品。

1.2.4 高效液相色譜條件 采用 ACQUITY HPLC?CSH C18 色譜柱（2.1 mm × 50 mm,1.7 μm），配有保護柱 Phenomenex C18（4.0 mm × 3.0 mm）；流動相：A 相：乙腈，B 相：0.3% 甲酸-40 mmol/L甲酸銨水溶液，梯度洗脫條件如表 1，柱溫 40 ℃；進樣量 3 μl。

表1 洗脫梯度設置表Table 1 Elution gradient settings

1.2.5 質譜條件 采用電噴霧離子化電離源（ESI），噴霧電壓 3500 V；加熱毛細管溫度 350 ℃；鞘氣氮氣，流速 45 Arb；輔助氣氮氣，流速 15 Arb；碰撞氣氬氣，流速 1.5 mTorr。LMV-12、M4 和內標的二級碰撞能量分別為 32、30 和 29 eV；正離子方式檢測；掃描方式為選擇反應監測（SRM），用于定量分析的離子反應為m/z674.300 → 169.200（LMV-12），m/z661.200 → 156.000（M4）和m/z688.200 → 183.000（CH3-LMV-12）；掃描時間為0.5 s。

1.2.6 標準樣品和質控（QC）樣品的制備 分別精密量取 SD 大鼠空白混合血漿，添加 LMV-12和 M4 系列標準工作液，得到 LMV-12 濃度為 20、50、100、200、500、1000、2000、5000、8000 ng/ml以及 M4 濃度為 5、12.5、25、50、125、250、500、1250、2000 ng/ml 的校正標樣。

質控樣品配制方法同標準樣品。質控樣品中LMV-12 濃度分別為 20、60、600、6000 ng/ml，M4 濃度分別為 5、15、150、1500 ng/ml。

1.2.7 血漿樣品前處理方法 采用蛋白沉淀方法[4-5]去除血漿中的蛋白，同時提取待測物質：準確吸取血漿樣本 50 μl，加入內標工作液 200 μl，渦旋 2 min 后，12 000 r/min、4 ℃ 離心 10 min，吸取上清液，轉移至進樣襯管中，進樣 3 μl 測定。

另取 SD 大鼠空白混合血漿（不添加任何物質）加入 0.05% 甲酸-乙腈 200 μl，渦旋 2 min 后，12 000 r/min、4 ℃ 離心 10 min，吸取上清液，作為空白樣品。

1.2.8 分析方法驗證項目及標準 按照《中國藥典》現行版《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[6]以及《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》[1]相關要求，參考 FDA《藥品和生物制品的分析程序和方法驗證行業指南》[7]、EMA《生物樣品分析方法驗證指導原則》[8]以及 ICH《M10：生物樣品分析方法驗證》[9]，開展完整方法學驗證，考察該方法的選擇性、殘留、標準曲線、準確度和精密度、基質效應、回收率、定量下限和稀釋可靠性，并考察樣品保存穩定性。

研究中±s用 Excel 進行計算，計算公式如下，判定標準按照現行版《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》[6]執行。

準確度：準確度用測定值與理論值的偏離程度，即偏差（Deviation，Diff%）表示；計算公式如下：Diff%=（測得濃度–標示濃度）/標示濃度 ×100%

精密度：精密度用多次測定數據的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD%）表示。

RSD%=測得濃度 SD 值/測得濃度均值 ×100%

1.2.9 SD 大鼠毒代動力學研究 SD 大鼠雌雄各 8 只，經口灌胃給予 LMV-12 受試物 28 d，每天一次，給藥劑量 15 mg/kg。于首次和末次給藥前、給藥后 0.5、1、2、4、6、8、24 h，共 8 個采血點采血。采集血液置于 EDTA 抗凝離心管中4000 r/min，4 ℃，10 min 離心后，收集血漿分裝2 管，其中 1 份保證在 200 μl 以上；剩余的全部置于另 1 個收集管中，置于–65 ℃ 以下條件保存待測。

2 結果

2.1 質譜條件的優化

由于 LMV-12 尚無同位素內標，故選取結構相似的 CH3-LMV-12 為內標。取 LMV-12、M4 和內標三種化合物的儲備液，分別稀釋至 0.1 mg/ml注入 ESI 離子源中，用正離子模式得到各自穩定的準分子離子峰與特征碎片離子。然后將 HPLC與串聯四極桿質譜儀連接，選擇各自的監測離子對，分別對離子傳輸管溫度、透鏡電壓、鞘氣壓、輔助氣壓等進行優化，使樣品的離子化效率達到最佳。最終確定了質譜條件。用于定量分析的離子反應為m/z674.300 → 169.200（LMV-12），m/z661.200 → 156.000（M4）和m/z688.200 → 183.000（內標）。

2.2 色譜條件的優化

良好的色譜條件對定量結果有重要意義。前期方法開發中發現 LMV-12 化合物表現極為特殊，其殘留嚴重，可達中濃度質控（MQC）水平，經探索發現其對所處溶液環境的極性極為敏感，本研究從液相條件如色譜柱的選擇、流動相、洗脫程序設計等方面分別優化。

經篩選，選用 Waters ACQUITY HPLC?CSH C18 色譜柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）。該色譜柱為新一代雜化顆粒的 HPLC 超高壓液相色譜柱，CSH 顆粒在橋式亞乙基雜化顆粒技術的基礎上在其表面控制少量電荷，這種修飾能夠改善離子化小分子的峰形、載量行為和峰容量，并且使得在LMV-12 的分離中表現出較低的殘留。

在流動相中的水相中適當添加甲酸及甲酸銨以提高待測物離子化效率，同時應避免流動相中離子濃度過高導致離子抑制，經過反復優化最終采用0.3% 甲酸-40 mmol/L 甲酸銨水溶液和乙腈為流動相。

洗脫程序中較大梯度變化將導致溶劑極性環境變化大而造成 LMV-12 的高殘留，采用 40%～60% 的弱梯度、較緩變化的梯度，可同時實現溶液中基質內源性物質以及多種化合物的有效分離，同時有效控制 LMV-12、M4 和內標三種化合物的殘留在指導原則規定的 20% 定量下限以下。

通常，較高的流速有利于尖銳和對稱的峰形，但本研究發現 LMV-12 在較高的流速下會因溶液極性變化快而出現高殘留，適當降低流速有利于降低殘留，經優化最終采用流速為 250 μl/min。最終梯度洗脫程序如表 1所示。

在最終色譜條件下 LMV-12 保留時間為1.13 min，M4 的保留時間約為 1.22 min，內標的保留時間約為 1.40 min，三種化合物均可實現較對稱色譜峰，峰形較窄且靈敏度高，同時殘留符合要求。

2.3 選擇性

采用來自 6 只個體 SD 大鼠的空白血漿樣品考察基質內源性物質對待測物及內標物的干擾。上述個體血漿經前處理后，按照已建立的分離檢測條件分析，空白基質在 LMV-12 保留時間處的響應不超過 1.55%，M4 保留時間處的響應不超過1.30%，內標處的響應不超過 0.01%（圖 1）。另外，分別單獨進樣 LMV-12、M4 和內標，結果顯示每種化合物對其他兩種組分的影響不超過 8.25%。本方法內源性組分對待測物干擾以及三種化合物之間的相互干擾均滿足《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》的要求[6-9]。

圖1 空白血漿中 LMV-12、M4 和內標的圖譜（A）和定量下限血漿樣品中 LMV-12、M4 和內標的圖譜（B）Figure 1 Spectrum of LMV-12,M4 and internal standard in blank plasma (A) and in LLOQ samples (B)

2.4 殘留

在注射定量上限（upper limit of quantification，ULOQ）標樣后，注射空白樣品，其中 LMV-12 的峰面積不大于注射定量下限（lower limit of quantification，LLOQ）中 LMV-12 峰面積的 0.13%，M4 的峰面積不大于 LLOQ 中 M4 峰面積的7.10%，內標峰面積不大于 LLOQ 內標峰面積的0.01%，滿足指導原則對于干擾組分不高于待測物LLOQ 峰面積 20%、內標峰面積 5% 要求[6-9]。

2.5 基質效應

6 批來自不同個體的 SD 大鼠空白血漿（其中含 2 個溶血血漿）提取后，分別加入低、高質控兩個濃度水平的 LMV-12、M4 及內標，分別與同濃度水平不含血漿基質的 LMV-12、M4 及內標純溶液的相應峰面積相比，絕對基質因子分別為0.98、0.93、1.08，LMV-12 和 M4 歸一化的基質因子分別為 0.92、0.86，RSD 分別為 9.40% 和12.98%，符合指導原則中 RSD 不大于 15% 的標準。本品不涉及影響脂質代謝，故未在臨床前研究中考察高脂基質的基質效應，建議后續臨床研究補充開展高脂基質的基質效應考察[7]。

2.6 標準曲線和靈敏度

以待測物與內標物峰面積比值為縱坐標（y），以待測物的理論濃度為橫坐標（x），采用線性最小二乘法（權重系數 1/x2）求得標準曲線，LMV-12和 M4 各評價 4 條標準曲線，所有標準曲線線性相關性良好（r2>0.99），符合接受標準。LMV-12 濃度范圍為 20～8000 ng/ml，M4 濃度范圍為 5～1500 ng/ml，代表性標準曲線擬合圖見圖 2。兩種待測物定量范圍可以大致覆蓋預期的大鼠毒性研究藥物血漿暴露濃度，描述 LMV-12 和 M4 的毒代動力學特征，靈敏度基本滿足測定需求。

圖2 血漿中 LMV-12（A）和 M4（B）定量分析標準曲線圖Figure 2 Calibration curve for quantitative analysis of LMV-12 (A) and M4 (B) in plasma

2.7 定量下限與準確度、精密度

定量下限及低、中、高水平的質控樣品（LMV-12 濃度分別為 20、60、600、6000 ng/ml，M4 濃度分別為 5、15、150、1500 ng/ml），每個添加水平重復測定 6 個樣品，連續測定 4 個分析批（3日內），以實測值與理論值之比計算方法的準確度，并計算批內與批間精密度（以 RSD% 計），具體結果見表 2。

表2 SD 大鼠血漿基質中的 LMV-12/M4 測定的準確度和精密度Table 2 Accuracy and precision of LMV-12/M4 in SD rat plasma matrix

經驗證，LLOQ 樣品中 LMV-12 的批內準確度偏差在–11.45%～9.06% 之間，精密度 RSD 不超過 17.86%；批間準確度偏差為 0.02%，批間精密度 RSD 為 8.53%。LLOQ 樣品中的 M4 的批內準確度偏差在–10.95%～3.87% 之間，精密度RSD 不超過 15.65%；批間準確度偏差為–3.19%，批間精密度 RSD 為 7.39%。LMV-12 的定量下限為 20 ng/ml，M4 的定量下限為 5 ng/ml。

低、中、高濃度質控樣品中 LMV-12 的批內準確度偏差在–9.4%～6.19% 之間，精密度 RSD不超過 9.70%；批間準確度偏差在–5.44%～–0.01%之間，批間精密度 RSD 不超過 4.73%。低、中、高濃度質控樣品中 M4 的批內準確度偏差在–12.18%～3.80% 之間，精密度 RSD 不超過8.69%；批間準確度偏差在–8.57%～–1.93% 之間，批間精密度 RSD 不超過 4.95%。上述結果符合指導原則對生物樣品測定分析方法驗證的要求[6-9]。

2.8 提取回收率

將低、中、高 3 個質控水平的血漿樣品（帶內標），與基質提取液（帶內標）中相應濃度待測物的峰面積相比，計算得到提取回收率，3 個批次 3 個濃度質控樣品中 LMV-12 的回收率在85.89%～88.77% 之間，各濃度回收率的相對標準偏差（RSD）不高于 5.82%。M4 的回收率在88.38%～93.24% 之間，各濃度回收率的 RSD 不高于 8.87%。內標的平均回收率為 109.72%，RSD為 5.31%。

2.9 稀釋可靠性

含 LMV-12 濃度 12 000 ng/ml、M4 濃度3000 ng/ml 的樣品分別稀釋 2 倍、5 倍、10 倍，各稀釋因子平行 5 個樣品，LMV-12 的準確度偏差在–9.45%～7.69% 之間，精密度 RSD 在 1.49%～2.13% 之間；M4 的準確度偏差在–2.91%～7.23% 之間，精密度 RSD 在 1.53%～2.61% 之間，表明 LMV-12 或 M4 的血漿樣品稀釋 2～10 倍后測得結果可靠。

2.10 穩定性

LMV-12/M4 在 SD 大鼠血漿樣本低、高濃度水平的樣品各 3 份，室溫放置 6 h，–70 ℃ 冰箱中保存 135 d，或者–70 ℃ 條件下保存 24 h 以上并經過 3 個凍融循環后，LMV-12/M4 測定結果（表 3）的準確度偏差均在標示值的 ±15% 內，符合指導原則要求。另外，研究結果顯示 LMV-12/M4的血漿樣品處理后的提取液于自動進樣器（4 ℃）中保存 96 h 后重新測定，準確度結果均符合指導原則穩定性要求，顯示樣品穩定。

表3 SD 大鼠血漿內 LMV-12 及 M4 穩定性測試結果Table 3 Stability of LMV-12 and M4 in SD rat plasma

2.11 毒代動力學樣品分析

將本方法應用于 SD 大鼠灌胃給予 LMV-12毒代動力學研究。將血漿樣品按已驗證方法前處理后，采用新鮮配制的標準曲線樣品并新鮮建立的標準曲線，同時分析高、中、低的 QC 樣品，根據當日標準曲線求算未知樣品濃度和 QC 樣品濃度。末次給藥后 LMV-12 和 M4 的血藥濃度藥-時曲線見圖 3，從圖中可以看出，LMV-12 的Cmax為201.77 ng/ml，出現在給藥后 2 h，M4 的Cmax為35.54 ng/ml，出現在給藥后 4 h，比 LMV-12 的時間滯后。測試過程分析批均滿足《生物樣品定量分析方法驗證指導原則》的要求[6-9]和毒代動力學研究的要求[1-3]。

3 討論

本研究針對創新型抗腫瘤化合物 LMV-12，建立了采用高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜同時測定血漿中 LMV-12 原型及其代謝產物 M4 的方法，通過對樣品前處理、色譜/質譜條件的優化，有效降低了殘留，完整方法學驗證結果顯示該方法操作簡單、回收率高、方法重現性好，各項驗證指標均滿足生物樣品定量分析[6-9]的要求。進一步將本方法應用于 LMV-12 大鼠毒代動力學研究，將為本品臨床前乃至臨床研究提供重要信息。