磷硫代siRNA的YAP基因沉默活性研究

唐 碩， 黃 震

(四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室， 成都 610065)

1 引 言

Yes相關蛋白(YAP)位于基因座11q22，是Hippo途徑的主要效應子，通過與靶基因相互作用來調節細胞增殖和凋亡[1-2].作為轉錄共激活因子，YAP在信號傳導中起著復雜的作用. 通常，YAP被認為是一種原癌基因，YAP的上調會導致未轉化的乳腺上皮細胞從上皮向間充質過渡，異常增殖并抑制細胞凋亡[3]. 此外，在大多數腫瘤細胞中，尤其是在卵巢癌，胃癌和肝細胞癌中，都觀察到了YAP過表達[4-7].但是，YAP還可以在散發性乳腺癌中起抑癌作用，其中已證明YAP可以正向調節p53家族成員[8]. 這些使YAP在腫瘤治療領域具有一定的研究價值.

RNA干擾(RNAi)技術在臨床治療中具有巨大的潛力，其中小干擾RNA(siRNA)是進行基因功能研究的有效工具[9-11].但是，未修飾的siRNA仍有一些缺陷，例如低效率、在循環系統中的快速清除等[12].為了改善siRNA的藥代動力學特性，人們采用了各種化學修飾方法，如2′-OMe，2′-F和通過硫代磷酸酯(PS)取代的磷酸二酯鍵修飾等[13-17].PS修飾是較成熟的方法，作為一種硫原子的單原子取代，其對siRNA結構的影響較小.然而，PS-siRNA的應用還面臨一些問題，在一些報道中，化學合成的PS-siRNA表現出嚴重的細胞毒性以及較差的沉默活性[11，18-20].這可能是由于PS中心具有手性(Rp或Sp)[21]，導致使用常規方法合成的PS-siRNA產物是一種非對映異構體混合物，其對RNA誘導沉默復合物(RISC)的加載效率較低[22]. 不幸的是，固相化學合成尚無法獲得純非對映體PS-siRNA(pPS-siRNA)，相比之下，人們已開發出了T7 RNA聚合酶轉錄策略來合成pPS-siRNA，此種方法得到的產物具備單一的R構型[17，23-25].因此，盡管產量相對較低，酶促合成法制備的 pPS-siRNA仍存在一定的研究價值[26].

圖1 化學結構(A)未修飾的RNA和硫代磷酸RNA的化學結構； (B)P-手性鏈接Fig.1 Chemical structures(A) unmodified RNA and phosphorothioate RNA； (B) P-chiral Linkages

為了探索YAP基因對癌細胞生長的影響及磷硫代siRNA的應用潛力，本文比較了pPS-siRNA和未修飾的siRNA(PO-siRNA)的基因沉默活性，研究了YAP在HeLa細胞系細胞周期和增殖中發揮的作用. 研究中使用的所有siRNA均來自T7 RNA聚合酶體外酶促合成. 結果表明pPS-siRNA在抑制YAP基因表達時比PO-siRNA更有效，并且沒有明顯的細胞毒性. 此外，YAP基因的下調一定程度上抑制了HeLa細胞的增殖，這提示了一種潛在的癌癥治療策略.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 細胞株 宮頸癌細胞株HeLa購自于ATCC細胞庫.

2.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)購自于Gibco生物公司；高糖培養基DMEM 和胰蛋白酶購自于Hyclone 生物公司；cDNA 合成試劑盒和顯影液(EasySee Western Blot Kit)購自全式金公司；RNA 提取試劑盒Eastep?Super Total RNA Extraction Kit購自于promaga 公司；Exfect?2000轉染試劑購自于諾唯贊生物科技股份有限公司；qPCR 試劑購自于Takara 生物公司；苯甲磺酰氟化物(PMSF)和RIPA裂解液均購自于索萊寶生物公司；脫脂奶粉，BSA，溴化噻唑藍四氮唑(MTT)等均購自上海生工生物；兔單克隆YAP抗體和鼠單克隆GAPDH抗體分別購自于Cell Signaling Technology及Proteintech公司；二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)及HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)購自于Proteintech 公司；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天.

2.2 方 法

2.2.1 細胞培養與轉染 HeLa細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中.該細胞培養在含5% CO2，37 ℃的細胞孵箱中，每2～3 d傳一次代，傳代比例為1∶6.使用Exfect?2000轉染試劑進行siRNA的轉染，操作步驟依照相應說明書進行.

2.2.2 寡核苷酸的制備 靶向YAP的siRNA的序列已經在之前的文獻中有過報道[27]，為5′-GGTGATACTATCAACCAAA-TT-3′.亂序siRNA的序列由本實驗室自行設計，為5′-TACAAATATCACGGTAAGCTT-3′.本研究中的所有siRNA均由T7 RNA聚合酶體外轉錄得到.對于PO-siRNA的合成，于EP管中加入2 μmol/L DNA模板，15 U/μL T7 RNA聚合酶，0.1 U/μL RNA酶抑制劑，10 mmol/L NTPs以及轉錄緩沖液[1x濃度：Hepes-KOH( 12 mmol/L，pH 8.5，MgCl2(4.6 mmol/L)，亞精胺(0.2 mmol/L)，BSA(0.01 mg/mL)]，于37 ℃水浴中孵育6 h.對于pPS-siRNA的合成，使用的NTPs為ATPαS、UTPαS、CTPαS及未修飾的GTP，其余與PO-siRNA相同.最后，酶促合成產物經凝膠純化并由酶標儀定量.

2.2.3 血清穩定性實驗 進行血清穩定性測定以確定酶促合成的PO-和pPS-siRNA的穩定性. siRNA溶液(雙鏈siRNA)均在10%FBS存在下于37 ℃孵育，隨后在不同時間間隔(0、2、4、6和8 h)取樣. 樣品在液氮中急凍，并儲存在-80 ℃下.最后，通過12.5%的非變性丙烯酰胺凝膠分析實驗結果.

2.2.4 qPCR實驗 轉染48 h之后收取HeLa細胞，并通過Eastep?Super Total RNA Extraction Kit提取總RNA.通過TransScript?All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR kit得到cDNA.qPCR引物如下：YAP正向引物5′-CCTGATGGATGGGAACAAGC-3′，反向引物5′-GCACTCTGACTGATTCTCTGG-3′[28]；GAPDH正向引物5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′.

2.2.5 Western blot實驗 轉染48 h后收取細胞，并使用RIPA裂解緩沖液于冰上裂解.蛋白定量后，進行10%的SDS-丙烯酰胺凝膠電泳，每孔上樣量20 μg.之后，在恒流260 mA的條件下轉膜90 min，將蛋白轉至PVDF膜上.將PVDF膜在5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h.洗膜后，將含YAP的PVDF膜與兔單克隆YAP抗體(Cell Signaling Technology，#14074)，含NADPH的PVDF膜與鼠單克隆GAPDH抗體(Proteintech，#60004)分別在4 ℃過夜孵育.第二天再次洗膜，并與相應的二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)及HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)室溫孵育2 h.最后，洗膜并使用EasySee Western Blot Kit化學發光檢測目的蛋白.分析及定量統計由ImageJ軟件完成.

2.2.6 MTT實驗 將HeLa細胞以每孔3×103個的數量鋪至96孔板中，每孔設置5個重復孔，共鋪4塊板.4 塊板同時進行一次給藥，給藥前將96孔板中的培養基換成新的含10%血清的DMEM 培養基.給藥之后，分別于第0 h、24 h、48 h、72 h 用MTT染料處理細胞，每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，混勻后于細胞孵箱中培養4 h.4 h后吸去培養液，每孔加入100 μL DMSO，使用酶標儀在560 nm 處測量顯色反應.最后，使用GraphPad Prism 7 軟件進行數據處理.

2.2.7 流式細胞術分析 轉染48 h后收取細胞，使用冰浴的PBS緩沖液清洗3次.之后，使用70%冰浴的乙醇于4 ℃過夜固定.隨后，再次清洗細胞并使用Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit根據其說明書為細胞染色.最終，樣品經BD FACScalibur流式細胞儀檢測，并通過ModFit軟件進行分析.

2.2.8 統計分析 使用GraphPad Prism 7軟件進行數據分析.兩組之間的差異通過t檢驗分析，P<0.05時認為具有統計學意義.

3 結果和討論

3.1 血清穩定性實驗

為了研究酶促合成的pPS-siRNA的血清穩定性，本文使用胎牛血清(FBS)進行了血清穩定性測定.將酶促合成的pPS-和PO-siRNA(均為雙鏈)與10%FBS溶液在37 ℃下孵育，在0、2、4、6和8 h取樣，并通過12.5%的非變性丙烯酰胺凝膠分析siRNA的穩定性. 研究發現PO-siRNA在孵育2 h后幾乎全部降解，而pPS-siRNA在同一時間還剩余約50%(圖2). 這表明pPS-siRNA比PO-siRNA具有更好的穩定性.

圖2 pPS-siRNA與未修飾的對應物PO-siRNA的核酸酶抗性對比Fig.2 Nuclease-resistance of pPS-siRNAs over PO-siRNAs, the canonical counterparts

3.2 沉默活性研究

本文通過qPCR和Western blot測定了HeLa細胞中PO-和pPS-siRNA的YAP基因沉默活性(圖3). 轉染并孵育48 h后，收取HeLa細胞，通過qPCR和Western blot分析樣品. 研究發現空白對照和亂序的PO-、pPS-siRNA組(PO-siScr和pPS-siScr)均未顯示出對YAP基因的抑制作用，而靶向YAP的PO-和pPS-siRNA(PO-siYAP和pPS-siYAP) 顯著抑制YAP的內源性表達. 此外， pPS-siYAP的YAP敲除效率比PO-siYAP更高(約高30%)，推測可能歸因于pPS-siRNA較高的細胞內穩定性，硫代磷酸酯修飾延長了siRNA的半衰期[19].相反，在J Winkleretal.的研究中，與未修飾的PO-siRNA相比，非對映體混合物PS-siRNA的基因沉默效果降低了[11,18]，這可能是由于非對映體混合物在RISC復合物中的負載較低所致[22].

圖3 轉染和孵育48 h后YAP基因的表達(A)qPCR檢測YAP mRNA水平，并將GAPDH用作內參; (B)Western blot進行分析，使用GAPDH作為內參. 對照組用PBS緩沖液轉染Fig.3 YAP gene expression after transfection and incubation for 48 h(A) Detected by qPCR, and GAPDH was used as an endogenous control; (B) analyzed by Western blot using antibodies against YAP, and GAPDH was used as an endogenous control. The control group was transfected with PBS buffer

3.3 細胞增殖試驗

為了研究pPS-siRNA的細胞毒性及其下調YAP表達后對HeLa細胞增殖的影響(圖4和5)，進行了MTT分析. 在下調YAP表達后，進行MTT細胞增殖實驗以研究酶促合成的pPS-siRNA的細胞毒性及其對HeLa細胞增殖的影響. 用MTT處理后，以0、24、48和72 h的時間間隔分析細胞，并繪制HeLa細胞的生長曲線. 對照組用PBS緩沖液轉染(圖4). 數據顯示PO-siScr和pPS-siScr組的增殖曲線與空白對照組相同，表明pPS-siRNA無明顯細胞毒性. 另外，PO-siYAP、pPS-siYAP組HeLa細胞的生長顯示出受到抑制的趨勢，相比PO-siYAP組，pPS-siYAP組的抑制效果更好. 結果表明，YAP的下調可以在一定程度上抑制HeLa細胞的生長，這與文獻報道是一致的[29-31]，其中pPS-siRNA抑制效果較好，并且沒有明顯的細胞毒性. 相反，在Z Y Lietal.的報道中，非對映體混合物PS-siRNA表現出更高的細胞毒性[32].

圖4 YAP基因表達的下調抑制HeLa細胞的增殖Fig.4 Down-regulation of YAP gene expression can decrease cell proliferation in HeLa cells

圖5 轉染和孵育48 h后酶促合成的siRNA對HeLa細胞形態的影響(A)用PBS緩沖液轉染的HeLa對照細胞； (B)HeLa-PO-siScr細胞； (C)HeLa-PO-siYAP細胞； (D)HeLa-pPS-siScr細胞； (E)HeLa-pPS-siYAP細胞. 實驗組細胞狀態良好，未觀察到對細胞形態的影響Fig.5 Effect of the transcribed siRNAs on the morphology of HeLa cells after transfection and incubation for 48 h(A) HeLa-control cells transfected with PBS buffer； (B) HeLa-PO-siScr cells； (C) HeLa-PO-siYAP cells； (D) HeLa-pPS-siScr cells； (E) HeLa-pPS-siYAP cells. The cells transfected with pPS-siRNA were in good condition and no effect on cell morphology was observed

3.4 細胞周期分析

為了研究YAP基因沉默對HeLa細胞周期的影響，進行了PI染色的流式細胞術檢測(圖6).轉染并孵育48 h后，收獲HeLa細胞并用PI染色，隨后用流式細胞儀進行分析. 對照組用PBS緩沖液轉染.研究發現，在YAP表達下調后，G0 / G1期的細胞蓄積增加，從57.6%(使用PBS對照)到62.7%(PO-siYAP)和65.4%(pPS-siYAP)，而 G2 / M期的細胞蓄積減少，從13.0%(對照)降至11.4%(PO-siYAP)和9.90%(pPS-siYAP). 這些結果表明，YAP的下調可能導致HeLa細胞的增殖在G0 / G1期停滯，這與MTT實驗結果以及YAP在促進細胞增殖和存活中的作用一致，并與多種腫瘤細胞的凋亡有關[28，33-34].然而，盡管呈現出一定趨勢，這種抑制在HeLa細胞中并不顯著，可能YAP對不同細胞生長的影響存在差異[33].

圖6 YAP基因下調表達后HeLa細胞的生長狀況Fig.6 Cell cycle of HeLa cells after down-regulation of YAP gene expression

4 結 論

研究表明，pPS-siRNA具有較高的核酸酶穩定性，無明顯的細胞毒性，并且在YAP基因沉默中比其PO-siRNA對應物更具活性. 酶法合成的pPS-siRNA克服了化學合成mPS-siRNA(非對映異構體混合物)的缺陷，該方法在基因功能研究和siRNA治療領域將具有重要價值. 此外，本文已經證實，YAP表達的下調可以抑制細胞增殖，表明其在腫瘤發生和發展中的重要作用，具有一定的研究價值.