北極新奧爾松地區(qū)可溶性無機(jī)氮鹽對根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

王瑜 韓文冰 朱倩 藺立棟 王能飛 張波濤

(1 青島大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 青島 266071; 2 自然資源部第一海洋研究所,山東 青島 266061)

提要 氮是植物生長的主要營養(yǎng)限制因子,為了探索北極近岸地區(qū)植物根際土壤細(xì)菌群落多樣性受氮元素的影響作用,采用16S rDNA 擴(kuò)增子測序分析了2014—2016年新奧爾松地區(qū)(Ny-?lesund,Arctic)的3 種典型植物根際土壤和本底土壤樣品。結(jié)果顯示,可溶性無機(jī)氮鹽(-N,-N,-N)與3 種植物根際土壤整體細(xì)菌群落呈顯著相關(guān)性(P ＜ 0.05)。Nitrosomonadaceae_uncultured (P ＜ 0.05,r2 = -0.77)和 Subgroup 6_norank (P ＜ 0.01,r2 = -0.87)是北極柳根際土壤的核心優(yōu)勢類群,與-N 密切相關(guān)。Subgroup 6_norank(P ＜ 0.01,r2 = -0.92)和JG34-KF-361_norank (P ＜ 0.05,r2 = 0.73)與珠芽蓼根際土壤的-N 顯著相關(guān)。抬頭地楊梅根際土壤中的Acidimicrobiales_norank (P ＜ 0.05,r2 = -0.74)和Anaerolineaceae_uncultured (P ＜ 0.01,r2 = 0.93)與-N 有明顯的相關(guān)性。研究表明,可溶性無機(jī)氮鹽對北極植物根際土壤細(xì)菌群落多樣性尤其是核心菌群的變化起到重要作用。

0 引言

當(dāng)前,全球環(huán)境面臨著一個重大挑戰(zhàn)—— 氣候變化迅速。北極氣候正在迅速變化,增加了諸如二氧化碳、甲烷和一氧化二氮等溫室氣體更快釋放的可能性[1-2]。Walker 等[3]對苔原生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行變暖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),氣溫升高使禾本科植物和落葉灌木數(shù)量增加,而苔蘚和地衣數(shù)量減少。氣候變化引起的生態(tài)環(huán)境變動正在逐漸影響陸地生物多樣性的分布,這是生物地球化學(xué)過程的關(guān)鍵驅(qū)動力[4]。微生物在極地陸地環(huán)境中占據(jù)主導(dǎo)地位,在驅(qū)動地球大部分氮循環(huán)的生物地球化學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。在生物多樣性方面,土壤微生物多樣性是植物群落動態(tài)的重要調(diào)控因子,也是陸地生態(tài)系統(tǒng)中植物多樣性和生產(chǎn)力的重要驅(qū)動力[7],并參與了土壤中大部分養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[8]。Chong 等[9-10]研究南極不同地區(qū)土壤微生物的分布格局,指出微生物多樣性的特殊性取決于環(huán)境的具體理化參數(shù)、植被的存在和海拔因素。在很大程度上,環(huán)境變化引起的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變在土壤理化因子的動態(tài)變化中有所體現(xiàn)[11]。因此,通過分析土壤中微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu),可以進(jìn)一步評估全球變暖對北極生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性和穩(wěn)定性的影響機(jī)制[12]。

北極的植被類型、生物豐富度和降水量均高于南極,并且北極受全球變暖影響的程度是地球上其他地區(qū)的2～4 倍。中國黃河站周圍多苔原和濕地,生長的低等植物主要為苔蘚和地衣,高等植物比較少,如發(fā)草及少數(shù)廖科植物,是研究高緯度北極土壤微生物的理想場所[13]。植物和土壤微生物是北極陸地生態(tài)系統(tǒng)的兩個重要組成部分,它們之間的相互作用是連接地上和地下生態(tài)系統(tǒng)的重要紐帶[14-15]。北極因其寒冷干燥的惡劣環(huán)境,很少能有生長季節(jié)超過40～50 天的植物生存,當(dāng)?shù)卣贾鲗?dǎo)地位的生產(chǎn)者主要是墊形植物、蓮座叢和簇狀禾本科植物[16]。除莎草以外的禾本科植物是極地半荒漠景觀的主要植物群落,維管植物覆蓋約10%～20%,隱花植物約覆蓋40%～70%[17]。

根際被認(rèn)為是植物的第二基因組,是研究根系、土壤和微生物相互作用的一個熱點(diǎn)。越來越多的研究證實(shí),根際微生物的多樣性和組成受植物物種[18-19]、土壤類型[20]和根系分泌物的影響[21],其中根系分泌物通過改變土壤的理化性質(zhì)的方式調(diào)節(jié)附近的微生物群落[22-23]。20 世紀(jì)末,研究報道土壤微生物種群可以對植物根部附近有機(jī)養(yǎng)分的釋放做出反應(yīng),北極地區(qū)的植物覆蓋區(qū)土壤具有更高的微生物多樣性[24]。Avery 等[25]的研究結(jié)果還表示環(huán)境紫外線輻射水平通過影響根分泌物的質(zhì)量或數(shù)量間接影響南極發(fā)草的根際微生物多樣性。Fierer 和Jackson[26]的研究表明,土壤pH值對微生物多樣性分布具有顯著性影響。Lemanceau 等[27]和Richardson 等[28]證實(shí)土壤中營養(yǎng)物質(zhì)(如鐵、磷酸鹽等)的缺乏也會影響微生物群落組成和結(jié)構(gòu)。Glanville 等[29]發(fā)現(xiàn)北極苔原生態(tài)系統(tǒng)溫度和含水量的變化對土壤微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)同樣具有控制作用。Bueno de Mesquita 等[30]指出,與苔蘚覆蓋的土壤相比,非植被覆蓋的極地土壤的微生物群更少。

而根際微生物進(jìn)行的生物化學(xué)過程也影響著土壤理化特性,兩者之間存在雙向反饋?zhàn)饔谩Ｗ钚卵芯堪l(fā)現(xiàn)有植被覆蓋的區(qū)域,土壤的礦化活動更為活躍[31]。Kumar 等[32]研究北極先鋒植物Oxyria digyna(L.) Hill 和Saxifraga oppositifoliaL.的根際土壤細(xì)菌多樣性和功能,表示根際菌群對氧化應(yīng)激和特定抗生素的耐受能力與根際群落種類有關(guān)。Given 等[33]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)北極高山植物Oxyria digyna(L.) Hill 的野生根際土壤中含有豐富的磷酸鹽增溶和重氮細(xì)菌類群。Park 等[34]證實(shí)溫度升高引起的永久凍土融化和早期融雪增加了土壤含水率,并導(dǎo)致微生物活動增加,故而促進(jìn)淺層土壤植物有效氮的增加,高水平的土壤氮素又會促進(jìn)次年夏天灌木的生長。此外,Liu 等[35]從新奧爾松地區(qū)的Saxifraga oppositifolia根際土壤中分離到的Pontibacter arcticussp.nov.與重氮菌具有高度相似性。

鑒于目前有關(guān)北極植物根際土壤細(xì)菌多樣性具體受哪些土壤理化因子的影響以及根際細(xì)菌群落中哪些優(yōu)勢核心屬主導(dǎo)著整體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究文獻(xiàn)較少,我們重點(diǎn)分析了北極3 種典型植物根際土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性之間的年際變化及兩者之間的相關(guān)性。本研究于2014—2016年采集36 個北極新奧爾松地區(qū)黃河站附近的北極柳(Salix arctica)、珠芽蓼(Bistorta viviparum)、抬頭地楊梅(Luzula confuse)以及無植被覆蓋的本底土壤樣品,通過對所采集的土壤樣品進(jìn)行16S rDNA 高通量測序,并結(jié)合相應(yīng)的9 種土壤理化性質(zhì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明: 3 種根際土壤的主要優(yōu)勢屬豐度和可溶性無機(jī)氮鹽含量具有明顯的年際變化特征,且存在顯著相關(guān)性(P＜ 0.05)。本研究的目的是將北極土壤的理化參數(shù)與根際微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián),從而獲得更多北極地區(qū)根際細(xì)菌群落多樣性的年際變化信息,從而進(jìn)一步探索微生物資源的應(yīng)用價值,為預(yù)測全球氣候變化和構(gòu)建北極土壤生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性提供有力的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)和土壤取樣

實(shí)驗(yàn)土壤樣品采集于北極新奧爾松地區(qū)(78° 40'N～79°00'N,11°20' E～12°30'E)。 該地區(qū)的植被主要以苔原和濕地為主,生長的低等植物主要是苔蘚和地衣,而高等植物較少,例如Oxyria digyna(L.) Hill,Bistorta viviparumL.,Dryas octopetalaL.,Salix arcticaPall.,Luzula confusaLindeb.,Saxifraga nivalisL.等。本研究所選的的3種植物(北極柳、珠芽蓼、抬頭地楊梅)是北極新奧爾松地區(qū)黃河站附近的常見植物物種。

北極柳(Salix arctica)是一種分布在北極的匍匐落葉灌木,被稱為后來的冰川地區(qū)定居者,是斯瓦爾巴群島(Svalbard)裸露山脊的優(yōu)勢物種,能形成外生菌根。它的高度通常低于10 cm,呈墊形。最新研究指出由于其較高的葉片光合作用能力,北極柳在碳固存中發(fā)揮著關(guān)鍵效力[36]。珠芽蓼(Bistorta vivipara)是一種環(huán)極地的多年生草本植物,生長在北極和高山苔原上[37],是少數(shù)能形成外生菌根的草本植物之一,幾乎完全通過珠芽無性繁殖[38]。抬頭地楊梅(Luzula confuse)是北極高地維管植物類群中最常見的種類之一,常生長于潮濕的生境中,是廣泛分布在黏性土壤到沙質(zhì)土壤中的環(huán)極物種[39],其低根冠比、低葉溫、高水勢和低葉阻的特性是對北極低溫和強(qiáng)輻射做出的適應(yīng)性改變,主要以內(nèi)生菌根為主[40]。

連續(xù)3年選取北極地區(qū)3 種優(yōu)勢植物(Salix arctica、Bistorta vivipara、Luzula confusa)根際土壤樣品作為研究對象,編號分別為Sar、Bvi 和Lco。選擇無植被覆蓋土壤作為對照組,編號BG。這些樣本來自中國第6 次、第7 次和第8 次北極科學(xué)考察。采集樣品的方法[41]是在距植物根附近土壤的表面土壤2～5 cm 范圍內(nèi),用無菌鏟刮取約50 g 土壤樣品,直接放入無菌塑料取樣袋,一式三份,平行樣本之間間隔1 m 并呈三角形分布(圖1a)。樣品在中國的北極考察站黃河站-20℃的冰箱中暫存,然后乘飛機(jī)送到國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室。在飛行過程中,樣本保存在裝有冷凍冰袋的恒溫箱中。在國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室,土壤樣品在-80 ℃冷凍,直到核酸提取[42]。共36 個土壤樣品。

圖1 a)新奧爾松地區(qū)土壤樣品采集; b)采樣站位全景圖Fig.1.a) Soil sample collection in Ny-?lesund (Arctic); b) panorama of sample collection stations

1.2 土壤樣品理化性質(zhì)

實(shí)驗(yàn)測量了總共9 種土壤理化性質(zhì),即pH值、含水率(MC)、有機(jī)碳(TOC,Total Organic Carbon)、有機(jī)氮(TON,Total Organic Nitrogen)、-N、-Si、-N、-P 和-N(圖2)。MC 的測定為濕土(每個樣品10 g)在105 ℃條件下烘干至恒重[43]后的重量失重。稱取2 g 土壤加入5 mL 去離子水(現(xiàn)用現(xiàn)制并超聲處理),渦旋振蕩1 min,靜止30 min 后用pH 計(PHS-3C,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司,上海,中國)測量pH。為測量其他7 項(xiàng)理化性質(zhì),每個樣本稱取8 g 土壤置于60 mm 培養(yǎng)皿中并編號,放入凍干機(jī)中凍干48 h,并用瑪瑙研缽研磨成粉末。有機(jī)碳和有機(jī)氮按照以下程序進(jìn)行測定。稱取 0.1～ 0.2 g 土壤樣品,用10%的鹽酸處理,隨后用去離子水多次沖洗以完全去除鹽酸,置于50 ℃干燥后用元素分析儀(EA3000,Euro Vector SpA,Milan,Italy)[44]測定,含量以百分比表示。取2 g 土壤到50 mL 離心管中,按1∶10(g·mL-1)的比例加20 mL去離子水。每4 h 震蕩一次,處理48 h 后,用營養(yǎng)自動分析儀(QuAAtro,SEAL,Germany)按相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜ 5%[45]測定其他五項(xiàng)營養(yǎng)鹽(-N,-Si,-N,-P,-N)含量[46-47]。

1.3 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

從36 個土壤樣本(3年 × 4 種土壤類型 × 3 個平行樣本:Salix arctica+Luzula confusa+Bistorta vivipara+ 空白)中提取基因組DNA[48]。使用MO BIO Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories,San Diego,CA,USA),按照廠家說明從0.25 g 土壤樣品中提取,用瓊脂糖凝膠檢測DNA提取物的純度和濃度,選擇合格的樣品[42]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用引物 806R(5′-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3′)和 341F(5′-CCTAYGGGRBGCAS CAG-3′)擴(kuò)增16S rRNA 基因的V3-V4 區(qū)。所有PCR 反應(yīng)在25 μL 的體系內(nèi)進(jìn)行,包括15 μL Phusion R 高保真PCR Master Mix(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA),0.2 mmol·L-1正向和反向引物,10 ng 模板DNA。PCR 產(chǎn)物與等體積的上樣緩沖液(1×,含SYBR green)混合,裝入2%瓊脂糖凝膠中檢測。選擇分子量在400～450 bp 之間的樣品,使用Gene JET 凝膠萃取試劑盒(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)進(jìn)行純化[47,49]。擴(kuò)增子文庫用 TruSeq?DNA PCR-Free Sample preparation Kit(Illumina,USA) 制備 ,用QuantiFluor?- ST (Promega,USA)進(jìn)行定量[50]。

1.4 測序和數(shù)據(jù)分析

純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物在北京諾禾致源有限公司的Illumina MiSeq 平臺上進(jìn)行測序。使用微生物生態(tài)學(xué)定量分析(QIIME,version 1.7.0)工作流程對序列進(jìn)行質(zhì)量過濾、嵌合體檢查、劃分可操作分類單元(OTUs)[51]。原始的16S rRNA 基因序列讀數(shù)用QIIME 軟件過濾以去除引物和barcodes,然后用FLASH 軟件合并[48,52],利用Uparse 軟件對所有的有效序列按相似度97%(Identity)進(jìn)行聚類成OTUs,并對每個OTUs 的代表序列進(jìn)行物種注釋,物種數(shù)據(jù)庫選擇SSU rRNA,得到細(xì)菌的物種分類學(xué)信息。對數(shù)據(jù)均一化處理后,使用R 語言和QIIME 計算土壤微生物的α 和β-多樣性[53]。通過α-物種多樣性和β-物種多樣性結(jié)果評估微生物多樣性的豐富度和均勻度。α-多樣性分析包括Chao1、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)和Good’s coverage。β-多樣性分析能反映出樣本之間的多樣性距離關(guān)系,而且還可以反映生物群落之間的分化程度,從而用于確定土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落多樣性之間的相關(guān)性[48]。采用線性判別效應(yīng)量(LEfSe)方法對不同采樣位點(diǎn)間差異顯著的細(xì)菌類群進(jìn)行鑒別(LDA score ＞ 4)。 在相關(guān)性分析之前,先對3年土壤理化性質(zhì)進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計——變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV),消除測量尺度和量綱的影響,以表示每個樣本理化性質(zhì)的總體變異性和兩組差異明顯的數(shù)據(jù)的離散程度[54]。

標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比值稱為變異系數(shù),由下式計算得到:

根據(jù)去趨勢對應(yīng)分析(DCA)結(jié)果,第一軸長度小于3.0,我們選擇冗余分析(RDA)揭示土壤理化性質(zhì)與微生物類群之間的關(guān)系,然后通過蒙特卡洛置換試驗(yàn)對其進(jìn)行檢驗(yàn)。為確定三種根際土壤微生物群落的核心微生物群,采用R 統(tǒng)計包 v3.0.1 的“加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析”(WGCNA)進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和對比分析[55],然后使用Cytoscape_v3.7.2 構(gòu)建4 種土壤樣品的OTUs 網(wǎng)絡(luò)圖。對4 種根際土壤的核心優(yōu)勢屬和9 個理化因子進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析(P＜ 0.05)。原始讀取數(shù)據(jù)存入NCBI 序列讀取存檔(SRA)數(shù)據(jù)庫(登錄號: SRP270629)。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

2014—2016年BG 平均pH 值為弱堿性,時間變異性低(CVpH= 8.30%)。與同年非根際土壤相比,3 種根際土壤9 個環(huán)境因子的變異系數(shù)在2014年為2.25%～134.99%,2015年為4.15%～ 119.64%,2016年為1.83%～141.42%。Nielsen 和Bouma[56]對變異系數(shù)提出了以下3 種不同類型的土壤特性變異: 0～15%變異不大; 10%～100%為中度變異性; 100%表示高變異性。表1 中的土壤理化性質(zhì)變異數(shù)據(jù)顯示,除土壤pH 值外,其他因子CV多數(shù)超過20%。特別是-N、-N、-N 和-P這4 個因子的變異系數(shù)甚至超過100%,表現(xiàn)出高度變異。

表1 36 個土壤樣品9 種土壤理化性質(zhì)的變異系數(shù)Table 1.Coefficients of variation of nine geochemical properties of 36 soil samples

2.2 細(xì)菌多樣性分析和群落組成

從36 個土壤樣品中總共獲得2025313 條原始序列,經(jīng)軟件質(zhì)量過濾后得到1520090 條序列。36 個土壤樣本的有效序列按97%的序列相似水平共聚類得到5569 個OTUs,每個樣本中OTUs平均超過1347 個,其中Lco14_2(站點(diǎn)Lco14 的第2 個樣本)包含的OTUs 最多(2690),Sar14_3 包含的OTUs 最少(1244)。樣品中OTUs 的覆蓋估計值在97%～99%之間,說明測序結(jié)果能更全面地反映調(diào)查區(qū)域環(huán)境微生物群落的真實(shí)情況。Chao1指數(shù)的變化范圍為1535.56～3126.72,其中指數(shù)最大的3 個站分別為Lco14、Sar16 和Lco16,物種數(shù)量最多(表2)。香農(nóng)(Shannon)指數(shù)在Lco14、Sar16 和Sar15 中較高,說明微生物多樣性較高,種群豐富,分布均勻。Lco15、BG16、Sar14 值較小,群落結(jié)構(gòu)相對簡單。根據(jù)物種累積箱線圖(species accumulation boxplot,圖3a)顯示,隨著樣本個數(shù)增加,曲線上升趨勢趨于平緩,并結(jié)合稀釋曲線(圖 3b)觀察得到樣品量足夠且測序數(shù)據(jù)量合理,結(jié)果具有代表性,由此反映出 36個土壤樣本中物種十分豐富,物種分布均勻,且逐漸趨于5600 多個物種。

在分類學(xué)上,我們可以清楚地看到,4 種土壤樣本在門水平上有不同的聚類時間模式。首先,每年的3 個Lco 樣本不僅形成了獨(dú)特的集群,也彼此分開(圖4)。第二,盡管相對不那么明顯,另一根際和BG 樣本彼此在同一個年密切相關(guān),圖4中清晰地顯示出聚集在一起的傾向。第三,2014年的三個Lco 樣品與2016年的兩個根際樣品聚在一起,相關(guān)性較強(qiáng)。

在門水平上,無論是根際土壤還是非根際土壤,均以變形菌門(Proteobacteria,27.16%～67.13%,平均46.15%)、放線菌門(Actinobacteria,7.30%～19.74%,平均12.78%)、酸桿菌門(Acidobacteria,4.33%～ 18.11%,平均11.53%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes,3.39%～21.71%,平均 9.24%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,1.68%～17.64%,平均8.50%)占優(yōu)勢(圖4)。

圖2 2014—2016年土壤理化因子濃度直方圖Fig.2.Histogram of concentration of soil geochemical factors from 2014 to 2016

表2 36 個土壤樣品的多樣性測序數(shù)據(jù)匯總Table 2.Summary data for diversity sequencing data from 36 samples

圖3 a)物種累積箱線圖; b)基于16S rRNA 基因V3-V4 的稀釋曲線Fig.3.a) Species accumulation curves; b) rarefaction curves based on V3-V4 of 16S rDNA gene

在屬水平上,我們發(fā)現(xiàn)在所有土壤樣品中,Gemmatimonadaceae_uncultured (Gemmatimonadetes,Gemmatimonadetes,Gemmatimonadales,2.86%～ 15.23%),Sphingomonas(0.67%～19.42%),Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales,1.19%～7.16%)和Subgroup 6_norank (Acidobacteria,0.77%～8.22%)為優(yōu)勢類群(排名前 4),亞優(yōu)勢類群為 MNG7_ norank(Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales,0.56%～3.99%),JG34-KF-161_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Sphingomonadales,0.06%～6.16%),JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales,0.11%～4.91%)和RB41(0.07%～7.45%)。

除此之外,我們還比較了土壤理化因子對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響。根據(jù)LEfSe 結(jié)果,36個樣本中有50 個類群的LDA score(線性判別分析)大于 4(顯著性檢驗(yàn)的截止值)(圖 5)。 Sar16 和 Sar14 的分類群最多,分別為 20%和18%。這兩個地點(diǎn)的分類單元較其他地點(diǎn)更為豐富,包括變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和酸桿菌門。

圖4 36 個土壤樣品中細(xì)菌群落組成在門水平的相對豐度Fig.4.Relative abundance of bacterial community compositions at Phylum levels in 36 soil samples

圖5 2014—2016年四種土壤樣品的LEfSe 分析(默認(rèn)預(yù)設(shè)值為4.0,P ＜ 0.05 視為顯著).a)北極柳根際土壤; b)珠芽蓼根際土壤; c)抬頭地楊梅根際土壤; d)本底土壤Fig.5.LEfSe analyses of four soil samples from 2014 to 2016 (default preset value = 4.0,P-values ＜ 0.05 considered significant).a) Salix arctica rhizosphere soil; b) Bistorta vivipara rhizosphere soil; c) Luzula confusa rhizosphere soil; d) background soil

2.3 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌群落的相關(guān)性分析

為了探究理化因素在根際土壤整體細(xì)菌群落多樣性中是否隨時間的變化而發(fā)揮不同的作用,我們進(jìn)行了RDA 分析(圖6)和蒙特卡洛置換檢驗(yàn)(表3)。

表3 4 種土壤的環(huán)境因子與細(xì)菌群落組成關(guān)系的蒙特卡洛置換檢驗(yàn)Table 3.A Monte Carlo permutation test of relationship between environmental factors and bacterial community composition of four soils

如圖6 所示,每個根際土壤樣品的3 個平行樣品相互簇聚,不同根際樣品相互分離,時間變化明顯。首先,我們發(fā)現(xiàn)在4 種土壤樣品中,除Sar 樣品外,相比其他參數(shù),-Si(r2= 0.95,P＜ 0.01)與細(xì)菌群落總體組成相關(guān)性強(qiáng)。同時,2016年除Lco 外,-Si 對其他3 種土壤樣品的影響更大。其次,Sar 樣品的-N(r2= 0.86,P＜ 0.01)較其他3 種土壤樣品與細(xì)菌群落總體組成存在顯著相關(guān)性。第三,2015年Bvi 樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受-N 影響最大(r2= 0.95,P＜ 0.01)。RDA 結(jié)果顯示,3年的Lco 樣品與-N 也有一定的相關(guān)性。從BG 的RDA 圖可以看出,在無植物土壤中,-N、-N、-N 與細(xì)菌群落組成的相關(guān)性低于其他6 個土壤理化因子。顯然,-N、-N 和-N 對影響根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和組成起主要作用。此外,36 個土壤樣本的RDA 結(jié)果(圖7)表明,3 種根際土壤整體細(xì)菌群落與本底土壤發(fā)生明顯分離。9 項(xiàng)理化性質(zhì)的蒙特卡洛置換檢驗(yàn)(表4)表明,-N(r2= 0.3378,P＜ 0.01)、TOC(r2= 0.3414,P＜ 0.01)、含水率(r2= 0.2883,P＜ 0.01)、pH(r2= 0.2157,P＜ 0.05)、TON(r2= 0.2118,P＜ 0.05)對36 個樣本的整體細(xì)菌群落產(chǎn)生顯著影響,而-N(r2= 0.1428,P= 0.079)相關(guān)性較低,-N 和-P 與細(xì)菌群落沒有顯著相關(guān)性。

圖6 基于距離的冗余分析.a)北極柳根際土壤; b)珠芽蓼根際土壤; c)抬頭地楊梅根際土壤; d)本底土壤Fig.6.Distance-based redundancy analysis.a) Salix arcticarhizosphere soil; b) Bistorta vivipara rhizosphere soil; c) Luzula confuse rhizosphere soil; d) background soil

圖7 基于距離的冗余分析顯示2014—2016年36 個土壤樣品中細(xì)菌群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性.箭頭代表測量的土壤理化因子Fig.7.Distance-based redundancy analysis revealed correlations between bacterial communities and environmental factors in 36 samples from 2014 to 2016.The arrows represent geochemical factors measured

表4 36 個樣本的環(huán)境因子與整體細(xì)菌群落組成關(guān)系的蒙特卡洛置換檢驗(yàn)Table 4.A Monte Carlo permutation test of relationship between environmental factors and overall bacterial community composition in 36 samples

我們利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)的結(jié)果(前200 個權(quán)重值)來確定這些復(fù)雜OTUs網(wǎng)絡(luò)中最有效的OTU,并找到每個根際的核心類群(圖8)。不同植被的根際土壤具有相同的核心類群和其特有的核心類群,但它們的相對豐度各不相同。我們發(fā)現(xiàn)四個站點(diǎn)土壤中的共同核心類群為Subgroup 6_norank (Acidobacteria)。Sar 和Bvi共有的核心類群為Gemmatimonadaceae_uncultured

(Gemmatimonadetes,Gemmatimonadetes,Gemmatimonadales),Bacillus。Sar 和Lco 共有的核心類群為Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)。此外,這4 種土壤的OTUs 網(wǎng)絡(luò)都有其特有的核心類群: Sar 站位有 Cytophagaceae_uncultured (Bacteroidetes,Cytophagia,Cytophagales); Bvi 有Oryzihumus,H16,JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales) 和Sphingomonas;Lco有S0134 terrestrial group_norank (Gemmatimonadetes),RB41,Anaerolineaceae_uncultured(Chloroflexi,Anaerolineae,Anaerolineales),Pedobacter,Massilia,Acidimicrobiales_norank (Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales)和Xanthomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Gammaproteobacteria,Xanthomonadales)。DA101 soil group_norank (Verrucomicrobia,Spartobacteria,Chthoniobacterales),Methylotenera和Gemmatimonas是BG 特有的核心類群。

為進(jìn)一步探討根際土壤核心優(yōu)勢類群和土壤理化因子的年際變化,確定它們之間的聯(lián)系。我們將LEfSe 分析得到的差異顯著的類群(圖5)和網(wǎng)絡(luò)分析得到的核心類群與9 項(xiàng)理化因子共同進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析(Pearson 相關(guān)系數(shù)見表5)。結(jié)合各位點(diǎn)優(yōu)勢類群,我們發(fā)現(xiàn)在Sar 中,處于核心位置、豐度較高且差異顯著的類群包括Subgroup 6_norank (Acidobacteria),Cytophagaceae_uncultured (Bacteroidetes,Cytophagia,Cytophagales),Nitrosomonadaceae_uncultured(Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)和Bacillus。Bvi 中存在 Subgroup 6_norank (Acidobacteria),JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales),Oryzihumus,H16 和Sphingomonas。以及,Lco 中 Acidimicrobiales_ norank (Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales),RB41,Anaerolineaceae_uncultured (Chloroflexi,Anaerolineae,Anaerolineales)。而BG的優(yōu)勢核心類群為 DA101 soil group_norank (Verrucomicrobia,Spartobacteria,Chthoniobacterales)和Methylotenera。顯然,植物類型的差異導(dǎo)致了土壤核心優(yōu)勢菌群的變化。這與蒙特卡洛置換檢驗(yàn)的結(jié)果一致。Pearson 分析結(jié)果表明,優(yōu)勢核心類群與土壤中可溶性無機(jī)氮鹽具有較強(qiáng)的功能對應(yīng)性。

3 討論

圖8 36 個土壤樣品中細(xì)菌群落加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖.a)北極柳根際土壤; b)珠芽蓼根際土壤; c)抬頭地楊梅根際土壤; d)本底土壤.顏色越深,尺寸越大,相關(guān)性越強(qiáng); 相反的比較弱Fig.8.Network diagram of weighted gene co-expression of bacterial communities in 36 soil samples.a) Salix arctica rhizosphere soil; b) Bistorta vivipara rhizosphere soil; c) Luzula confuse rhizosphere soil; d) background soil.The darker the color,the larger the size,the stronger the correlation.The opposite is weaker

表5 土壤理化性質(zhì)與根際土壤/本底土優(yōu)勢細(xì)菌類群豐度的相關(guān)系數(shù)Table 5.Pearson correlation coefficients of relative abundance of the dominant bacterial groups in rhizosphere soils and bulk soils with soil properties

續(xù)表5

在分類學(xué)上,我們發(fā)現(xiàn)4 個根際土壤的細(xì)菌群落具有不同的時間聚類模式。在分類學(xué)水平上的統(tǒng)計分析表明,3 種根際土壤的優(yōu)勢菌群組成相似,但在不同根際土壤樣品中發(fā)現(xiàn)了不同的差異。如細(xì)菌群落多樣性的變化和特定功能微生物組的存在。根際土壤核心優(yōu)勢類群豐度變化與土壤理化因子之間是否存在交互作用呢？

據(jù)基于距離的冗余分析和蒙特卡洛置換檢驗(yàn)結(jié)果可知,除了pH 值和MC 外,新奧爾松地區(qū)植物根際土壤的7 種土壤理化性質(zhì)與根際細(xì)菌群落多樣性和組成顯著相關(guān)。其中,3 種可溶性無機(jī)氮鹽與細(xì)菌群落多樣性的相關(guān)性最高。在Sar 位點(diǎn),-N (r2= 0.86,P＜ 0.01)相關(guān)性最高。在Bvi 位點(diǎn),-N (r2= 0.93,P＜ 0.01)的相關(guān)性最大,而在Lco 位點(diǎn),-N (r2= 0.86,P＜ 0.01)的相關(guān)性最大。本底土壤中,-Si (r2= 0.80,P＜ 0.01)的相關(guān)性最強(qiáng),其他理化因素次之。與其他可溶性營養(yǎng)鹽相比,根際土壤中可溶性無機(jī)氮鹽與細(xì)菌群落整體多樣性和組成顯著相關(guān)。Van Der Heijden 等[57]研究發(fā)現(xiàn),根分泌物間接介導(dǎo)了有益微生物和病原微生物的相互作用,對根際土壤細(xì)菌的多樣性和組成起著關(guān)鍵作用。對比 3年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),3 種根際土壤的-N、-N和-N 理化性質(zhì)的變異系數(shù)呈年變化趨勢。分析了兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)3 種根際土壤中核心優(yōu)勢類群的豐度與3 種可溶性無機(jī)氮鹽的變化是一致的。

由于近年來北極環(huán)境的變化,土壤中的氮循環(huán)發(fā)生了顯著的變化。受相關(guān)功能菌豐度變化的影響,土壤的硝化、反硝化和厭氧氨氧化過程均受到不同程度的促進(jìn)和抑制。WGCNA 結(jié)果顯示,Nitrosomonadaceae_uncultured(Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)既是北極柳根際土壤的優(yōu)勢菌類群,也是其核心菌群。通過相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)該屬與-N 呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P＜ 0.01)。此外,核心優(yōu)勢類群Subgroup 6_norank(Acidobacteria)的相對豐度的年際變化和Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)是一樣的。同時發(fā)現(xiàn),該類群與根際土壤中-N 和-N 的相關(guān)性高于本底土壤。Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)和Subgroup 6_norank (Acidobacteria)的年際變化趨勢相同,而Bacillus的年際變化趨勢與前兩者相反。2014—2015年,-N 和-N 濃度呈協(xié)同作用,兩者對亞硝酸鹽呈現(xiàn)拮抗作用。基于此,我們認(rèn)為-N 和-N 的濃度影響了Subgroup 6_norank (Acidobacteria)和Nitrosomonadaceae_uncultured (Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)的相對豐度,-N 濃度顯著影響芽孢桿菌的相對分布。前人研究發(fā)現(xiàn),Nitrosomonadaceae_uncultured(Proteobacteria,Betaproteobacteria,Nitrosomonadales)是一種促進(jìn)土壤硝化作用、爭奪土壤-N 的土壤硝化劑[56,58]。Subgroup 6_norank 屬于酸性細(xì)菌(Acidobacteria),并對土壤氮循環(huán)中的-N 和-N 濃度有降低作用[59]。Beneduzi 等[60]在巴西水稻根際土壤中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌具有固氮和促進(jìn)植物生長活性的作用。最近研究指出,在北極新奧爾松地區(qū)先鋒植物Oxyria digyna和Saxifraga oppositifolia的根際土壤中發(fā)現(xiàn)潛在固氮細(xì)菌β-變形桿菌和藍(lán)細(xì)菌主導(dǎo)土壤細(xì)菌群落的多樣性和組成[61]。因此,在北極柳根際土壤中,3 種營養(yǎng)鹽與3 種優(yōu)勢核心類群之間相互制約、相互影響,共同促進(jìn)土壤的硝化作用和固氮作用的發(fā)生,從而促進(jìn)了落葉灌木的生長。

珠芽蓼和北極柳均為維管植物,但兩個根際的優(yōu)勢核心類群不同。Subgroup 6_norank(Acidobacteria)在珠芽蓼根際土壤中仍占主導(dǎo)地位。有趣的是,優(yōu)勢核心屬JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales)在珠芽蓼根際土壤中的相對豐度年際變化大于Subgroup 6_norank (Acidobacteria),且與-N 濃度高度相關(guān)(P＜ 0.05)。JG34-KF-361_norank(Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales)屬于α-變形桿菌綱的根瘤菌目。Delgado 等[62]發(fā)現(xiàn),在硝酸鹽的參與下,苜蓿根瘤發(fā)生了根瘤菌的反硝化作用。由此我們可以推斷,在珠芽蓼根際土壤中,珠芽蓼根與 JG34-KF-361_norank (Proteobacteria,Alphaproteobacteria,Rhizobiales)之間也發(fā)生了類似的反硝化過程,后者消耗土壤中的硝酸鹽。

Acidimicrobiales_norank (Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales)是Lco 的核心類群,與-N 呈強(qiáng)而顯著的相關(guān)性(r= -0.74,P＜ 0.01)。Acidimicrobiaceae sp.strain A6 (A6)來自放線桿菌門,最近被鑒定為一種可進(jìn)行厭氧氨氧化偶聯(lián)鐵還原(Feammox)的微生物[63]。因此,我們推測,同樣的生化過程發(fā)生在 Acidimicrobiales_norank(Actinobacteria,Acidimicrobiia,Acidimicrobiales)。 Anaerolineaceae_uncultured (Chloroflexi,Anaerolineae,Anaerolineales)與-N 也有很強(qiáng)的顯著相關(guān)性(r= 0.93,P＜ 0.01)。Anaerolineaceae_uncultured屬綠彎菌門中的厭氧繩菌目,但其在土壤中的厭氧硝化過程目前尚不清楚。然而,我們的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)該類群與-N 濃度有非常顯著的相關(guān)性,因此我們推斷該類群在抬頭地楊梅根際土壤中進(jìn)行了反硝化作用,但具體的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。同時,Lco 位點(diǎn)中唯一的門——浮霉菌門(厭氧氨氧化)和藍(lán)藻細(xì)菌(固氮),在北極植物根際土壤的氮循環(huán)中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[64]。Humbert 等[64]發(fā)現(xiàn)浮霉菌門參與氨的厭氧氧化產(chǎn)生N2并釋放到大氣中。相關(guān)研究結(jié)果表明,與Livingston 島采集的樣品相比,北極地殼樣品中藍(lán)藻細(xì)菌豐富度更高[65]。一些藍(lán)細(xì)菌形成異質(zhì)囊并具有固定大氣氮的能力[66]。然后,藍(lán)藻細(xì)菌通過提供固定氮(通過固定氮菌株)在生物降解中發(fā)揮著同樣重要的間接作用。

本研究發(fā)現(xiàn)的核心菌類群主要參與土壤氮循環(huán)的主要生化過程,與3 種無機(jī)氮鹽(-N,-N,-N)的變化顯著相關(guān)。植物根系對微生物驅(qū)動的土壤養(yǎng)分循環(huán)有很強(qiáng)的影響[57]。硝化和反硝化是微生物參與大氣氮循環(huán)的主要途徑之一,也是陸地生態(tài)系統(tǒng)氮流失的主要原因[57,67]。由于核心優(yōu)勢菌在土壤細(xì)菌群落中占有主要地位,其變化對整個細(xì)菌群落的多樣性和結(jié)構(gòu)變化起著主導(dǎo)作用。綜上所述,我們認(rèn)為,北極根際土壤細(xì)菌群落的多樣性和組成與3 種土壤可溶性營養(yǎng)鹽的濃度變化(如-N,-N,-N)不可分割,且兩者的相互作用為北極生態(tài)系統(tǒng)抵御氣候變化提供了主要保障。