補腎消渴方對糖尿病腎病模型大鼠TGF-β1/Smad信號通路的影響

孫亞林，傅 強，夏建華，金周慧

（上海市浦東新區人民醫院中醫科，上海201299）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者最嚴重的微血管并發癥之一，也是導致終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）的主要病因之一。糖尿病腎病確切發病機制十分復雜，包括了諸多因素共同參與，如遺傳、腎臟血流動力學異常、血糖過高引起的代謝改變、高血壓、血管活性物質代謝異常等因素［1］。糖尿病腎病的結節性和彌漫性腎纖維化是其特征性改變。尋找更加安全有效的治療措施和藥物延緩糖尿病腎病腎纖維化一直是腎臟病領域的研究熱點［2］。本研究采用高脂高糖飲食聯合小劑量鏈脲菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射法建造DN大鼠模型，探討補腎消渴方對糖尿病腎病治療作用的機制，以便為中醫藥防治糖尿病腎病提供更好的方法和實驗研究依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物28只SP F級SD雄性大鼠，體質量160～180 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證編號SCXK（滬）2013-0016。飼養于復旦大學藥學院動物房，動物實驗室許可證號：SYXK（滬）2010-0099。

1.1.2 實驗試劑STZ鏈脲菌素，批號：S0130，美國Sigma公司產品；大鼠尿微量白蛋白ELISA試劑盒，批號：YS03669B，南京建成生物科技有限公司產品；兔抗大鼠轉化生長因子β（1transforming growth factor β1，TGF-β1）單克隆抗體，AB215715，美國Abcam公司產品；兔抗大鼠Smad2、Smad3、PSmad2、平滑肌肌動蛋白α（smooth muscle aorta α，α-SMA）單克隆抗體，批號：8685S、8685T、52631S、19245S，美國CST公司生產；HRP標記山羊抗兔IgG（H+L），批號：bs-0791R；PBS磷酸鹽緩沖液，批號：AR0030，武漢博士德公司產品；ECL發光顯色液，批號：1705060，美國Bio-Rad公司產品；BCA蛋白定量試劑盒，批號：P0009，上海碧云天生物科技有限公司產品。

1.1.3 實驗藥物 高脂飼料：由66.5%常規飼料，20.0%蔗糖，10.0%豬油，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鹽［11］組成，該飼料由蘇州雙獅實驗飼料科技有限公司提供；補腎消渴方藥物組成：黃芪30 g，金蟬花10 g，紅豆杉9 g，西紅花1 g，枸杞12 g，絞股藍12 g，靈芝15 g，葛根15 g。由上海中醫藥大學附屬普陀醫院中藥房制備成濃縮原液，含生藥104 g；腎炎康復片，批號：AP15425，天津同仁堂制藥有限公司產品，研磨后溶解于生理鹽水中。4℃下冰箱保存備用。

1.1.4 實驗儀器 羅康全活力型血糖儀及其配套試紙，德國Roche公司；低溫離心機（Micro21R），美國Thermo公司；透射電鏡電子顯微鏡（JEM1230），日本電子株式會；石蠟切片機（Finesse 325），美國Thermo公司；酶標儀（SpectraMax M5），美國Bio-Rad公司；全自動生化檢測儀（INTEGRA 400），瑞士Cobas公司；石蠟組織塊包埋機（Scientific），美國Thermo公司；顯微鏡（CH2），日本Olympus公司；微量移液器（F1-ClipTip），美國Thermo公司；低溫冰箱（Forma 700），美國Thermo公司；Image Lab圖像采集和分析軟件，美國Bio-Rad公司；電泳槽（1640302），美國Bio-Rad公司；轉膜槽（1703940），美國Bio-Rad公司；搖床（SI-50），英國Stuart公司；旋轉振蕩器（XW-80A），上海青浦滬西儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與造模28只SPF級SD雄性大鼠，適應性飼養后，隨機分為正常對照組（6只）、模型對照組（6只）、補腎消渴方組（7只）、腎炎康復片組（7只）。除正常對照組外，其余各組均采用高脂高糖飲食4周后加大鼠腹腔注射低劑量STZ（30 mg/kg）的造模方法制作動物模型［3］。

1.2.2 動物給藥 造模成功后，正常對照組和模型對照組給予等量的生理鹽水灌胃；補腎消渴方組給予補腎消渴方，制成濃縮原液，按每日4.2 g/kg灌胃。腎炎康復片組將腎炎康復片研磨后溶解于生理鹽水中，按每日2.4 g/kg灌胃給藥。第8周時尾靜脈采血，測定大鼠血糖；第8周末測定大鼠血肌肝（serum creatinine，Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。第8周末處死大鼠前，用代謝籠收集大鼠尿液，在代謝籠收集大鼠尿液期間禁食不禁水，收集到大鼠尿液之后，記錄各組大鼠尿量，將收集到的尿液測定大鼠24 h尿微量白蛋白排泄率（UAER）；測定腎臟指數（kidney index，KI），KI=腎質量/體質量×1000。

1.3 腎組織病理學檢測

大鼠腎臟石蠟切片制備：大鼠腎臟在4%多聚甲醛中固定；乙醇梯度脫水；二甲苯透明；浸蠟；包埋；切片，每張切片厚3 μm，用經0.1%多聚賴氨酸處理，56℃保溫箱內烘干，存于4℃冰箱待用。

HE染色：石蠟切片，脫蠟，乙醇洗滌，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染色，脫水，透明，中性樹膠封片。

免疫組化染色（SABC法）：常規切片、脫蠟、水化；PBS水洗，3% H2O2室溫封閉，抗原修復；滴加正常山羊血清封閉液；兔抗大鼠一抗；滴加山羊抗兔二抗；滴加試劑SABC；DAB顯色；蘇木素復染，脫水，透明，封片，鏡檢。

Western blot檢測方法：組織經粉碎、緩沖、裂解、離心后；電泳ECL化學發光法顯影。采用Image LabTM圖像采集和分析軟件成像，對各組腎組織HE染色，免疫組化染色和條帶進行分析。

1.4 統計學方法

所有數據采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，多組之間采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊者組間比較用LSD檢驗，方差不齊者采用Games-Howell檢驗，當P<0.05時，表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般性狀

實驗開始，從腹腔注射STZ 1周之后，各造模組大鼠逐漸開始出現多飲多食，而形體相對正常對照組消瘦的癥狀，部分大鼠逐漸出現毛色枯黃，沒有色澤等現象，在實驗過程中，模型對照組大鼠部分出現白內障等眼部疾病，補腎消渴方和腎炎康復片組大鼠白內障癥狀很少。

2.2 各組大鼠治療前后體質量和腎指數變化

與正常對照組比較，模型對照組、補腎消渴方組和腎炎康復片組體質量降低，腎指數升高（P<0.01），差異有統計學意義。與模型對照組比較，補腎消渴方組和腎炎康復片組體質量升高，腎指數降低（P<0.01）。與腎炎康復片組比較，補腎消渴方組體質量升高，腎指數降低（P<0.01）。結果見表1。

表1 各組大鼠8周末體質量、腎指數（KI）、24 h-UAER的比較 （±s）

表1 各組大鼠8周末體質量、腎指數（KI）、24 h-UAER的比較 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01；與模型對照組比較，2）P<0.01；與腎炎康復片組比較，3）P<0.01

組別 例數 體質量（g） KI（mg/g）UAER（μg/24 h）正常對照組 6 584.40±5.59 2.28±5.75 71.50±10.17模型對照組 6 437.92±8.21） 4.99±0.061）1473.75±111.471）補腎消渴方組 7 509.46±9.721）2）3）3.36±0.061）2）3）583.59±59.111）2）3）腎炎康復片組 7 475.20±8.791）2）3.78±0.041）2）802.37±79.211）2）

2.3 各組大鼠第8周末24 h UAER比較

實驗8周末時，模型對照組24 h UAER與正常對照組比較明顯升高（P<0.01）；補腎消渴方組24 h UAER與模型對照組和腎炎康復片組比較明顯降低（P<0.01）。結果見表1。

2.4 各組大鼠0周、4周、8周血糖變化

給藥第0、4、8周，模型對照組、補腎消渴方組和腎炎康復片組大鼠血糖與正常對照組比較差異具有統計學意義（P<0.01）；給藥第4、8周，補腎消渴方組大鼠血糖與模型對照組比較差異具有統計學意義（P<0.01）；給藥第8周，補腎消渴方組大鼠血糖和腎炎康復片組比較差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表2。

“訂單式”人才培養是校企合作、校園合作的另一種方法。在云南經濟管理學院陳香艷的《高職院校學前教育專業實施“訂單班”的幾點思考》中提出：“訂單式”人才培養是當下我國職業教育體系中校企合作的重要方式，按照企業的要求去培養人才能節約很多成本，對應用型人才培養具有積極作用。在“訂單式”人才培養的過程中，第一，了解市場人才的需求情況。第二，確定訂單培養賬目。第三，組建賬目工作組。第四，建全組織保障制度。第五，進行校園之間的深度融合。訂單式人才培養已是高職教育實踐中一種有效的人才培養模式，值得地方本科院校學習、借鑒、推廣。

表2 各組大鼠第0周、4周、8周血糖變化情況（mmol/L，±s）

表2 各組大鼠第0周、4周、8周血糖變化情況（mmol/L，±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01；與模型對照組比較，2）P<0.01；與腎炎康復片組比較，3）P<0.01

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2.5 各組大鼠第8周末BUN、Scr比較

給藥第8周末時，模型對照組、補腎消渴方組和腎炎康復片組BUN、Scr水平與正常對照組大鼠比較差異具有統計學意義（P<0.01）；補腎消渴方組BUN、Scr水平與模型對照組及腎炎康復片組比較差異具有統計學意義（P<0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠8周末BUN、Scr水平比較 （±s）

表3 各組大鼠8周末BUN、Scr水平比較 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01；與模型對照組比較，2）P<0.01；與腎炎康復片組比較，3）P<0.01

組別 例數 BUN（mmol/L） Scr（μmol/L）正常對照組 6 5.75±0.52 54.56±2.29模型對照組 6 18.3±1.951） 96.76±5.331）補腎消渴方組 7 13.26±0.941）2）3） 64.21±2.691）2）3）腎炎康復片組 7 15.26±0.581）2） 69.42±4.51）2）

2.6 病理結果

2.6.1 腎組織HE染色觀察HE染色結果可見：正常對照組大鼠，腎臟組織無明顯的病理改變。模型對照組與正常對照組相比，出現腎小球系膜細胞增生，基底膜增厚，部分腎小球硬化，部分腎小管上皮細胞顯示空泡樣變性，有不同程度的炎性細胞浸潤；補腎消渴方組腎小球、腎小管損傷程度與模型對照組及腎炎康復片組比較差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。結果見圖1，2。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色病理圖像分析結果

圖2 各組大鼠腎組織HE染色（×400)

2.6.2 TGF-β1、α-SMA免疫組化表達 模型對照組中TGF-β1、α-SMA明顯高于正常對照組（P<0.01）；補腎消渴方組腎臟中TGF-β1、α-SMA表達與模型對照組及腎炎康復片組比較差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。結果見圖3，4；表4。

圖3 各組大鼠TGF-β1免疫組化（×400）

圖4 各組大鼠α-SMA免疫組化（×400）

表4 各組大鼠TGF-β1、α-SMA腎組織平均灰度值比較 （±s）

表4 各組大鼠TGF-β1、α-SMA腎組織平均灰度值比較 （±s）

注：與正常對照組比較，1）P<0.01；與模型對照組比較，2）P<0.01；與腎炎康復片組比較，3）P<0.01，4）P<0.05

組別 例數 TGF-β1 α-SMA皮質 髓質 皮質 髓質正常對照組 6 79.5±4.0 88.0±6.9 56.1±3.3 55.6±3.9模型對照組 6 115.0±5.81）119.6±6.81）57.8±2.71）59.7±4.21）補腎消渴方組 7 101.6±6.91）2）4）107.1±6.61）2）4）59.9±3.52）3）61.4±2.82）3）腎炎康復片組 7 109.3±8.11）2）114.8±6.31）2）61.5±1.61）2）64.1±3.91）2）

2.6.3 TGF-β1、α-SMA蛋白Western blot表達 與正常對照組比較，模型對照組的TGF-β1、α-SMA蛋白表達明顯增高（P<0.01）；補腎消渴方組腎臟中TGF-β1、α-SMA蛋白表達與模型對照組及腎炎康復片組比較差異具有統計學意義（P<0.01，P<0.05）。結果見圖5~8。

圖5 各組大鼠腎臟中TGF-β1蛋白表達

圖6 各組大鼠腎臟中TGF-β1蛋白表達比較

圖7 各組大鼠腎臟中α-SMA蛋白表達

圖8 各組大鼠腎臟中α-SMA蛋白表達比較

2.6.4 Smad2/Smad3蛋白表達情況 模型對照組與正常對照組比較，Smad2、Smad3蛋白表達無明顯變化（P>0.05）；補腎消渴方組與模型對照組和腎炎康復片組比較，Smad2、Smad3蛋白表達差異也無統計學意義（P>0.05）。結果見圖9，10。

圖9 各組大鼠腎臟中Smad2蛋白表達比較

圖10 各組大鼠腎臟中Smad3蛋白表達比較

2.6.5 P-Smad2/P-Smad3蛋白的表達 模型對照組P-Smad2、P-Smad3蛋白表達明顯高于正常對照組（P<0.01）；補腎消渴方組P-Smad2、P-Smad3蛋白表達明顯低于模型對照組及腎炎康復片組（P<0.01，P<0.05）。結果見圖11，12。

圖11 各組大鼠腎臟中P-Smad2/P-Smad3蛋白表達

圖12 各組大鼠腎臟中P-Smad2/P-Smad3蛋白表達比較

3 討論

補腎消渴方主要由黃芪、金蟬花、紅豆杉、枸杞、靈芝、葛根、絞股藍和西紅花組成。方中黃芪味甘、性溫，具有補氣生血，使氣旺血生；金蟬花性寒、味甘，具有益腎補肺、調和營衛的功效，兩藥一溫一涼，黃芪大補脾肺之氣，以資化源，使氣旺血生，金蟬花益腎精、斂肺氣、和營衛，則浮陽秘斂，陽生陰長，氣旺血生，虛熱自退，二者共為君藥；紅豆杉味甘、平，歸腎、心經，有小毒，消腫散結、通經利尿；西紅花味甘，性平，歸心、肝經，活血化瘀、涼血解毒、解郁安神，兩藥共為臣藥，具有消腫散結、活血化瘀、利尿安神之功。以上諸藥共用起到滋補肝腎、益氣安神、活血通絡的作用。枸杞味甘、性平，歸肝、腎經，枸杞子甘平質潤，藥性平和，是平補肝腎最常使用的中藥，可以減紅豆杉之小毒；靈芝性平、味甘，歸心、肺、肝、腎，補氣安神、養肝益精，可以助西紅花安神之效；葛根性涼、味甘辛，歸脾、胃，具有解肌退熱、生津、升舉陽氣，可助黃芪升陽，解除肌熱面赤，口渴引飲；助西紅花活血祛瘀。絞股藍，甘、苦，寒，歸脾、肺經，具有益氣健脾、清熱解毒。以上諸藥共為佐藥，輔佐主藥共奏補腎益氣、化瘀通絡之功效。

臨床研究證實補腎消渴方治療DN的確切療效［6］，為了進一步明確其作用機制開展了實驗研究。本研究中我們采用補腎消渴方成人60 kg體質量常用劑量，根據《實驗動物學》SD大鼠與人體體重6倍換算，確定補腎消渴方治療量為4.2 g/kg。本研究雄性SD大鼠采用高脂高糖飲食聯合小劑量STZ（30 mg/kg）的方法成功建立了糖尿病腎病大鼠模型。

研究發現給予補腎消渴方灌胃治療8周的大鼠腎指數明顯好于模型對照組，血糖、BUN、Scr、UAER等生化指標明顯低于模型對照組（P<0.01）。HE染色的結果也顯示，補腎消渴方治療組能夠明顯降低糖尿病腎病大鼠腎小管空泡樣變性，炎癥細胞浸潤，系膜細胞增生，減輕細胞外基質的堆積，提示補腎消渴方能夠改善糖尿病腎病大鼠的腎功能和腎臟病理改變，延緩了糖尿病腎病的進展。

大鼠腎臟免疫組化染色結果顯示補腎消渴方組腎組織TGF-β1和α-SMA蛋白的表達低于模型對照組；通過對大鼠腎組織進行Western blot檢測結果顯示補腎消渴方組大鼠腎臟組織中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA蛋白的表達明顯降低，與模型對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）；正常對照組、模型對照組、補腎消渴方組中Smad2/3蛋白表達沒有明顯變化，提示補腎消渴方可能通過抑制TGF-β1/Smad信號通路，下調TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA蛋白的表達，保護了腎小球和腎小管間質的損傷，改善腎功能。

綜上所述，補腎消渴方能降低實驗大鼠血糖，降低BUN和Scr，減輕蛋白尿，改善腎功能，能夠延緩DN大鼠的病情進展，改善腎組織形態學損害。其作用機制可能通過抑制TGF-β1/Smad通路、下調TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、α-SMA蛋白的表達有關，這為臨床補腎消渴方治療DN提供了實驗依據。