知母皂苷對記憶障礙模型大鼠學習記憶的影響

張文新，任沁沁

（1.山西衛生健康職業學院，山西 晉中030619；2.南方醫科大學，廣東 廣州510515）

知母為百合科植物知母的干燥根莖，是常用清熱滋陰藥物，味苦，性寒無毒，歸腎經，具有清熱瀉火、生律潤燥、止咳除煩的功效［1］，主要含有甾體皂苷、雙苯吡酮類、木脂素類、多糖類、氨基酸類、生物堿類等多種成分。現代研究表明，知母根莖中所含的甾體皂苷知母皂苷（Saponins from anemarrhena asphodeloides Bge，SAaB）（約含6%）是知母的主要活性成分［2］，其可分為知母皂苷A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、B-Ⅰ和B-Ⅱ6種，其皂苷的皂苷元主要是菝葜皂苷元［3］。藥理研究表明，知母具有抗血小板血栓［4］、改善阿爾茨海默病、抗腫瘤、抗炎、解熱等作用［5］。知母皂苷具有明顯抗抑郁和抗腦缺血作用，能通過促進腦M受體生成，對神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的影響，對腦內自由基代謝的影響，對學習記憶的影響等發揮抗衰老作用［6］，對于阿爾茨海默病（老年性癡呆，Alzheimer′s disease，AD），改善學習記憶能力具有明顯的效果［7］。

記憶是大腦的最高功能之一，是智力的重要構成因素。國內外對記憶力減退從多方面進行了廣泛地深入的研究，合成藥物方面也取得了一定的進展，但大多有療效不高、藥價昂貴、長期服用不良反應明顯等種種不足。如利他靈，被稱為“聰明藥”，能增強記憶力，但長期服用會導致厭食、成癮等［8］。因此，開發低毒、價廉的提高學習記憶力的藥物已成為當前醫藥界面臨的一個重大課題。本研究采用東莨菪堿腹腔注射大鼠的方法制造記憶障礙模型，研究知母皂苷對其學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雌性2月齡SD大鼠32只，SPF級，體質量（200±20）g，實驗動物合格證號：2006B023，由南方醫科大學實驗動物中心提供，在溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%環境下飼養3 d后實驗，本研究獲得倫理委員會批準。

1.1.2 實驗儀器Morris水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所儀器廠，型號：SMG-2）；紫外可見分光光度計（美國惠普公司，型號：HP845）；真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司產品，型號：DZF-8050）；萬分之一天平（德國sartorius，型號：CP324S）；十萬分之一天平（德國sartorius，型號：CP225D）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-2000）；醫用超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：Q-500DE）；真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司，型號：DZF-8050）。

1.1.3 藥物與試劑 知母飲片（購于北京同仁堂藥店）；LSA-10型大孔吸附樹脂（西安藍深公司）；菝契皂苷元對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110744-200306）；氫溴酸東莨菪堿（廣州環葉制藥有限公司，批號：010402）；生理鹽水；蒸餾水；乙醇、丙酮、甲醇、硫酸為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 知母皂苷的制備

1.2.1 .1 提取濃縮 取適量的知母飲片，加1倍量70%乙醇浸潤24 h后，再加8倍量70%乙醇，回流提取2次，每次2 h，紗布濾過。合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮成流浸膏（藥材質量∶溶液體積=2∶1），濃縮液通過陶瓷膜過濾器過濾，濾液加蒸餾水稀釋至1∶1（藥材質量∶溶液體積），備用。

1.2.1 .2 大孔吸附樹脂洗脫 取適量LSA-10型大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，攪拌使氣泡逸出，裝柱，用蒸餾水洗至無醇味，取濃縮液上樣，吸附1 h，然后依次用10 BV的20%乙醇、50%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，洗脫流速1 mL/min，收集50%乙醇洗脫液，減壓濃縮至浸膏狀。

1.2.1 .3 丙酮萃取 將浸膏用1/2倍量的無水乙醇溶解，然后緩緩加入2倍量丙酮，混合均勻，靜置12 h，有白色沉淀析出，過濾，濾液棄，沉淀干燥，即為知母皂苷。

1.2.2 知母皂苷含量的測定

1.2.2 .1 對照品母液的制備 精密稱取菝葜皂苷元對照品2.512 mg，置10 mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲溶解，放冷，繼續用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 .2 供試品溶液的制備 取知母皂苷樣品約0.18 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解后，加濃硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中顯色30 min，取出，冰浴至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 .3 測定波長的確定 取菝葜皂苷元對照品溶液適量，照標準曲線項下的方法制備標準品溶液，采用紫外分光光度法，在波長范圍200~700 nm進行掃描，菝葜皂苷元對照品溶液的最大吸收波長為284 nm，且樣品在該波長處有較大吸收峰且峰形良好，故以284 nm作為最大吸收波長。

1.2.2 .4 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別置10 mL容量瓶中，分別加入5.0 mL濃硫酸搖勻，密塞。在60℃的水浴中顯色30 min，取出，冰浴至室溫，繼續加甲醇至刻度，搖勻。以第一個容量瓶中的試劑為空白對照，在284 nm處測定對應的吸光度。以濃度X（μg/mL）為橫坐標，吸光度Y為縱坐標，運用Excel數據進行線性回歸，得回歸曲線方程：Y=21.514X+0.032，r=0.9976，線性范圍：5.02~25.10 μg/mL。

1.2.2 .5 精密度試驗 取對照品溶液一份，照標準曲線的制備項下的方法，連續測定其吸光度5次，計算出RSD為1.42%，表明精密度良好。

1.2.2.6重復性試驗 取知母皂苷樣品粉末5份，每份約0.18 mg，精密稱定，置10 mL的容量瓶中，加適量甲醇溶解后，加濃硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中顯色30 min，取出，冰浴至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，284 nm處測定吸光度，計算樣品中知母皂苷的含量，計算出RSD為2.65%，重復性良好。

1.2.2 .7 穩定性試驗 精密稱取知母皂苷樣品粉末約0.18 mg，加適量甲醇溶解后，加濃硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中顯色30 min，取出，冰浴至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，分別于0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h在284 nm處測定供試品溶液的吸光度，計算RSD為1.34%，表明樣品在2.5 h內的穩定性良好。

1.2.2 .8 加樣回收率試驗 取已知含量的知母皂苷樣品粉末5份，每份約2.00 mg，精密稱定，分別置25 mL容量瓶中，再分別精密加入約1.70 mg的菝葜皂苷元對照品，加甲醇，超聲溶解，定容，再精密量取各樣品溶液1 mL至10 mL量瓶中，加濃硫酸溶液5.0 mL，密塞，在60℃的水浴中顯色30 min，取出，冰浴至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，照標準曲線項下方法操作測定吸光度，計算樣品中知母皂苷的含量和回收率。計算得平均回收率為98.43%，RSD=3.25%。

1.2.2 .9 樣品的含量測定 取供試品溶液，在空白試劑為對照，在284 nm處測定吸光度，根據標準曲線的回歸方程，計算樣品中知母皂苷的含量，平行測定3次，取平均值。

1.2.3 分組與給藥 取32只SD雌性大鼠，隨機分為空白對照組、記憶障礙模型組、知母皂苷低劑量組（50 mg/kg）、知母皂苷高劑量組（100 mg/kg）4組，每組8只。從實驗第1天起，空白對照組、記憶障礙模型組大鼠灌胃給予相應體積的生理鹽水（1 mL/100 g），知母皂苷高（100 mg/kg）、低劑量組（50 mg/kg）灌胃給予相應劑量的知母皂苷，每天1次，連續8 d。

1.2.4 行為學訓練Morris水迷宮實驗：水溫控制在22℃左右，室溫控制在25℃左右，實驗前1天，讓所有大鼠在水迷宮中自由游泳2 min，以熟悉周圍環境；實驗1～7 d，各組大鼠逐個稱重，灌胃給予相應的藥物，給藥1 h后開始游泳訓練，每天每只大鼠訓練4次，訓練時，將大鼠面向池壁依次從4個入水點分別放入水池，記錄大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上的路線及所用的時間（潛伏期），用秒（s）表示，大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s。若入水后120 s大鼠未能找到平臺，則將其輕輕從水中引導至平臺，并停留10 s，然后進行下一次訓練，這時潛伏期記為120 s。每只大鼠從4個入水點分別放入水池為1次訓練，2次訓練之間間隔60 s。

1.2.5 造模 實驗第8天，模型組、高劑量組、低劑量組腹腔注射東莨宕堿（0.3 mg/mL）1 mL/100 g造成記憶障礙模型，空白對照組則給予相應劑量的生理鹽水。

1.2.6 觀察指標 每只大鼠造模30 min后游泳，這次游泳隨機指定一個入水點，觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺的路線圖及所需時間，記錄其潛伏期。在120 s內未找到平臺者，潛伏期記為120 s。

1.3 統計學方法

采用SPSS 10.0軟件對潛伏期進行統計學分析。各組數據以均數±標準差（±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 樣品中知母皂苷的含量

知母飲片經70%乙醇提取，大孔吸附樹脂洗脫，丙酮沉淀的工藝提取純化后，以菝葜皂苷元為對照，采用紫外可見分光光度法檢測樣品中的知母總皂苷的含量，經檢測樣品中知母皂苷的含量達85%以上。

2.2 不同時期大鼠的游泳軌跡

大鼠在游泳訓練中，從剛開始的邊緣式、隨機式路線尋找平臺變成了以直線式、趨向式路線搜索平臺，表明隨著訓練次數和時間的增加，大鼠找到平臺的時間逐漸減少，路線也逐漸縮短，說明游泳訓練方法有效果，大鼠能快速精準地找到平臺。結果見圖1。

圖1 Morris水迷宮中不同時期大鼠的游泳軌跡圖

2.3 大鼠游泳的潛伏期

與空白對照組比較，記憶障礙模型組大鼠的潛伏期時間顯著升高（P＜0.01）。與記憶障礙模型組比較，知母皂苷低、高劑量組大鼠的游泳潛伏期時間顯著縮短（P＜0.05）。結果見表1。

表1 知母皂苷對東莨宕堿誘導的學習記憶損傷的影響 （±s）

表1 知母皂苷對東莨宕堿誘導的學習記憶損傷的影響 （±s）

注：與空白對照組比較，1）P<0.01；與記憶障礙模型組比較，2）P<0.05，3）P<0.01

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3 討論

阿爾茨海默病發病機制不明，是一種伴有認知障礙和記憶喪失的神經退行性疾病［9］。膽堿功能障礙是AD患者記憶功能損傷的原因之一，乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）為腦內與認知功能最直接相關的神經遞質［10］，東莨菪堿是一種經典的抗膽堿能劑，可競爭性地與ACh受體結合，從而阻斷擬膽堿藥物對膽堿受體的激動作用，使得體內的ACh含量降低［11］，因此，東莨菪堿常常用于誘導動物AD記憶障礙模型。

知母總皂苷是知母防治老年癡呆癥的有效部位，本研究采用大孔吸附樹脂洗脫—丙酮萃取工藝制備知母皂苷，經紫外分光光度法檢測知母皂苷的含量達85%以上，進而研究知母總皂苷對東莨菪堿致記憶障礙模型大鼠學習記憶能力的影響。Morris水迷宮廣泛用于嚙齒類動物的空間記憶學習能力的測量中，在最初的游泳訓練中，大鼠主要以邊緣式和隨機式尋找平臺，潛伏時間較長，隨著訓練時間的增加，大鼠主要以直線式和趨向式搜索平臺，游泳的時間明顯縮小，路線縮短，說明游泳訓練方法有效，大鼠學會了尋找平臺的方法和路徑。腹腔注射東莨菪堿后，模型組大鼠與空白對照組比較，游泳潛伏期時間明顯延長，說明造模成功。造模后高劑量組大鼠尋找到平臺所需的潛伏期與模型組相比明顯縮短（P<0.01），低劑量組大鼠尋找到平臺所需的潛伏期與模型組相比有所降低（P<0.05）。說明知母皂苷可以改善大鼠的學習記憶能力。綜上所述，知母皂苷對東莨菪堿所致記憶障礙的大鼠模型有明顯提高記憶力的作用，其機制可能與影響膽堿能神經的活性有關。