軟堅散結方對腎透明細胞癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響

高 宇，王 棟，劉麗坤，王晞星

（山西省中醫院，山西省中醫藥研究院，山西 太原030012）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是惡性度高且致命的泌尿系惡性腫瘤，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢，全球每年新增病例約33.8萬例，死亡有14.24萬人［1］。局限性RCC的5年存活率為65%，而轉移性RCC 5年存活率降至10%～20%［2］，目前我國大部分RCC患者病理類型為腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC），占比70%～75%［3］。手術切除是其根治的唯一手段，但術后復發率達50%［4］，靶向及免疫治療等藥物目前在臨床廣泛使用，有效率較高，但因藥品昂貴患者經濟負擔重，藥物不良反應較大，易產生耐藥，這些問題都嚴重影響了患者的臨床療效及生活質量［5］。而中醫藥治療腎癌具有多靶點抑瘤、增效減毒、提高患者生存質量、延長生存期等優勢。腎癌歸屬于中醫學“尿血”“腎積”“腰痛”等病范疇，前期研究認為痰瘀毒互結是腎癌發生發展的關鍵因素，活血解毒、軟堅散結法為腎癌治療的重要法則［6］，軟堅散結方為腎癌有效臨床治療藥物。

Notch信號在腎臟發育中起關鍵作用［7］，Notch1過表達誘導腎小管上皮細胞異常增殖［8］，異常Notch表達可能直接導致腫瘤的發生。在ccRCC組織樣本中，發現Notch通路被廣泛激活［8］，但Notch信號對ccRCC的具體作用尚不明確。課題組既往研究已證實軟堅散結方可在體外抑制7860細胞增殖，誘導凋亡［9］。本研究擬通過建立裸鼠ccRCC移植瘤模型，觀察軟堅散結方對腎透明細胞癌荷瘤裸鼠的體內抑瘤作用，檢測瘤體組織中Notch信號通路及相關凋亡蛋白、基因的表達，探究軟堅散結方抗ccRCC的作用靶點及機制，為開發低毒高效的抗腎癌藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物及細胞株4~6周齡SPF級BALB/c雄性裸鼠15只，體質量（20±2）g，購于北京維通利華，合格證號：SCXK（京）2019-0009。人腎透明細胞癌7860細胞株購于中科院上海生命科學院細胞庫。

1.1.2 藥物與試劑 軟堅散結膠囊（山西省中醫院內部制劑，藥物組成：貓爪草、山慈菇、莪術、枸橘、夏枯草、浙貝母、壁虎、雞內金、醋山甲、牡蠣，批號：AZ20090347）；Notch通路抑制劑DAPT（5 mg/支，Med Chem Express，批號：GSI-IX）；RPMI1640培養液（Corning公司，批號：05118006）、胎牛血清（Gibco公司，批號：10270106）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，批號：SH30042.01B）、鏈霉素青霉素雙抗（杭州四季青公司，批號：2018050052）、PBS緩沖溶液（Hyclone公司，批號：NZG1189）；一抗兔抗人Notch1（CST，20 μL，批號：VAL1744）、一抗兔抗人NICD（Millipore，100 μL，批號：07-1232）、一抗兔抗人Bax（Abcam公司，10 μL，批號：ab32503）、一抗鼠抗人Bcl-2（Abcam公司，10 μL，批號：ab196495）、二抗（Abcam公司，批號：AR1017）、蘇木素-伊紅（HE）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號：C0105S）、DAB顯色液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0203）、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，批號：AR0102）；Notch1、Bax、Bcl-2引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；免疫組化試劑盒（批號：18001）、RNA抽提試劑盒（批號：B0004DP），購自南京Biomiga公司。

1.1.3 實驗儀器 恒溫細胞培養箱（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Cytoperm 2），低溫臺式離心機（美國Thermo公司，型號：H1650-W/H1650W）；倒置熒光生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：CX23）；實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號：7900）；石蠟包埋機（德國Leica公司，型號：EG 1150H）；Excelsior全自動全封閉脫水機（德國Leica公司，型號：TP 1020）；F325旋轉石蠟切片機（德國Leica公司，型號：EG 1150C）。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模 參照文獻［1］，裸鼠腋下皮膚接種對數生長期7860細胞懸液，0.1 mL/只（1×108個/mL），隔日觀察腫瘤生長情況及小鼠一般情況。

1.2.2 分組與給藥 選擇15只BALB/c裸鼠，適應環境7 d后，隨機編號，分為模型組、軟堅散結方組、DAPT組3組，每組5只。參照《中藥藥理研究方法學》［11］換算裸鼠等效劑量為成人臨床用量的15倍，以此設定軟堅散結方組給藥劑量為46.8 g/kg，予灌胃給藥，3 d停1 d，DAPT組按5 mg/kg配DMSO-PBS溶液腹腔注射，模型組予等量的DMSO-PBS腹腔注射，各組腹腔給藥，1次/4 d。

1.2.3 計算瘤體積及抑瘤率 給藥干預4周后，處死裸鼠，剝離腫瘤組織，濾紙吸干血水后稱重，并按公式計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。

1.2.4 HE染色觀察腫瘤組織形態 剝取的瘤體經4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，4 μm連續切片，HE染色、封片后在光學顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.2.5 免疫組化檢測Notch1、NICD、Bcl2、Bax蛋白的表達 石蠟切片常規脫蠟、水化，置0.05 M檸檬酸緩沖液中微波加熱（95℃10 min）激活抗原；0.3%過氧化氫甲醇溶液室溫孵育20 min以阻斷內源性過氧化物酶活性，加入一抗4℃過夜孵育；加二抗，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水、透明，中性樹脂封片，鏡檢；同時用PBS代替一抗染色作陰性對照。染色的切片在顯微鏡下有棕黃色顆粒沉著，從每張免疫組化染色切片中隨機選取5個視野，輸入病理圖像分析系統。按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面進行評分。①陽性細胞百分比：無陽性細胞＝0；陽性細胞占1%～10%＝1；陽性細胞占11%～50%＝2；陽性細胞占51%～80%＝3；陽性細胞占81%～100%＝4。②陽性細胞染色強弱：陰性＝0；弱陽性＝1；中度陽性＝2；強陽性＝3。①②兩項乘積為該樣本的IHS。IHS分級：0分為（－）；1～4分為（＋）；5～8分為（＋＋）；9～12分為（＋＋＋）。

1.2.6 RT-PCR檢測Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達 用TrIzol提取各組組織樣本總RNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，逆轉錄合成cDNA反應模板，按各基因引物設計PCR擴增，檢測Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達水平。引物均采用Primer網站設計，Notch引物序列：F：5′-GTGCTGGAAGTATTTTAGCGAC-3′，R：5′-GTCCTTGCAGTACTGGTCATAC-3′，Bcl-2引物序列：F：5′-TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3′，R：5′-GCTGATTTGACCATTTGCCTGA-3′，Bax引物序列：F：5′-GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT-3′，R：5′-GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC-3′。

1.3 統計學方法

運用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism7軟件對數據進行處理和分析進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（ANVOA）分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠一般狀況及腫瘤生長情況比較

7860細胞接種后約5 d，皮下可見綠豆大小結節，質韌，活動度差，與皮下組織粘連，后期逐漸突出體表，形狀不規則，部分瘤體出現破潰，成瘤率100%。實驗期間，各組裸鼠體質量逐漸增加，組間比較差異無統計學意義。模型組和DAPT組后期隨著腫瘤增大飲食及活動明顯減少，軟堅散結方組食水及活動基本正常。軟堅散結方組和DAPT組均對裸鼠皮下移植瘤的生長有抑制作用，與模型組比較，平均瘤體積明顯減小，瘤質量明顯降低（P＜0.05）。軟堅散結方組、DAPT組抑瘤率分別為46.26%和24.83%。結果見表1，圖1。

表1 各組體質量、瘤體積、瘤體質量比較

圖1 各組裸鼠及移植瘤生長情況

2.2 各組瘤體組織病理學表現

模型組見癌細胞生長旺盛，體積較大且排列紊亂，形態不一，呈立方形、楔形、片狀等；胞漿呈透明狀；細胞核大且深染，呈圓形、卵圓形或怪異型；間質有豐富的毛細血管。軟堅散結方組、DAPT組凋亡細胞增多，可見凋亡細胞與鄰近細胞分離，細胞核濃縮甚至消失，胞質呈明顯嗜酸性，凋亡小體可見。結果見圖2。

圖2 各組裸鼠瘤體組織形態學表現（HE，×200）

2.3 免疫組化檢測各組Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表達

在7860細胞移植瘤中，Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白陽性表達呈棕黃色或黃色著色，其中Notch-1、Bcl-2、Bax陽性表達為胞質染色，而NICD表達主要位于細胞胞核，各組陽性細胞百分率和顯色強度均有差異性（圖3）。與模型組比較，軟堅散結方組、DAPT組Notch1、NICD、Bcl-2蛋白陽性表達明顯減少（P<0.05），Bax蛋白陽性率明顯增高（P<0.05）。與DAPT組相比，軟堅散結方組NICD、Bcl-2陽性率明顯下降，Bax陽性率明顯增高（P<0.05）。結果見表2。

圖3 各組裸鼠瘤體組織Notch1，NICD，Bax、Bcl-2蛋白表達的影響（×40）

表2 各組瘤體組織中Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表達 ±s（）

表2 各組瘤體組織中Notch1、NICD、Bcl-2、Bax蛋白表達 ±s（）

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與DAPT組比較，2）P＜0.05

組別 Notch1 NICD Bcl-2 Bax模型組 3.45±0.38 3.26±0.34 4.67±0.67 1.33±0.33 DAPT組 1.4±0.171）1.79±0.321）2.33±0.331）1.67±0.341）軟堅散結方組1.04±0.231）1.13±0.231）2）0.33±0.341）2）8.00±1.001）2）

2.4 各組Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達情況

7860裸鼠移植瘤組織各基因表達情況，與模型組相比，DAPT組、軟堅散結方組Notch1、Bcl-2表達顯著降低（P＜0.05），Bax表達顯著升高（P＜0.05）；與DAPT組比較，軟堅散結方組Notch1 mRNA表達無明顯差異；Bcl-2、Bax mRNA表達差異顯著。結果見圖4。

圖4 各組裸鼠Notch1、Bcl-2、Bax mRNA表達

3 討論

中藥是腫瘤治療重要手段之一，臨床療效確切，特別是在減毒增效，預防復發轉移，防治并發癥，逆轉多藥耐藥等方面發揮了關鍵作用，中藥復方抗腫瘤的機制也成為學術界研究熱點。惡性腫瘤屬中醫癥瘕、積聚范疇，痰瘀毒互結是其發生發展的主要病機。軟堅散結法屬于八法之一的消法，廣泛應用于臨床腫瘤的治療，療效確切［12］。黃洋等［13］研究表明，軟堅扶正湯聯合DP化療方案（多西他賽聯合順鉑），可有效改善患者臨床癥狀，并提高臨床療效。基礎研究表明，龍葵提取物龍葵多糖可通過調控Caspase-3和Bcl-2抑制荷瘤小鼠腫瘤生長［14］；夏枯草通過調控激活子蛋白-1（activator protein 1，AP-1）、核因子（nuclear factor κB，NF-κB）、P38、血管內皮生長因子（vascular endothelical grouth factor，VEGF）、基質金屬蛋白酶9（matrix metallo proteinase 9，MMP-9）等信號轉導抑制肝細胞癌轉移［15］。白花蛇舌草乙醇提取物能夠通過阻斷絲/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated mprotein kinase，MAPK）、轉 錄 激 活 因 子3（transcription activator 3，STAT3）等信號通路誘導大腸癌細胞凋亡，抑制細胞增殖［16］。山西省中醫院制劑軟堅散結膠囊，由貓爪草、山慈菇、莪術、夏枯草、浙貝母等藥物組成，本研究證明，軟堅散結方對腎透明細胞癌荷瘤鼠移植瘤具有明顯的生長抑制作用，且荷瘤鼠對軟堅散結方具有良好的耐受性，未見明顯不適及不良反應，能下調抗凋亡因子Bcl-2，上調促凋亡因子Bax蛋白及基因的表達，進一步明確軟堅散結方通過凋亡途徑抑制腎透明細胞癌生長。

Notch信號通路具有調節細胞增殖、分化和凋亡等作用，Notch缺乏或減少會導致腎臟發育異常并直接影響腎臟疾病的發生、發展及轉歸。Notch通路與腫瘤的發生發展關系密切，已有研究表明，它是T細胞急性淋巴細胞白血病（T-ALL）和頭頸癌的致癌途徑［17-19］。Notch信號獨立于VHL/HIF通路，在腎細胞癌中發揮著重要作用［20］，組織芯片檢測和TCGA數據顯示，腎透明細胞癌組織中Notch表達明顯增加［8］，Notch1基因過表達導致腎臟細胞過度增殖，同時Notch1配體Jagged1的高表達降低了腎癌患者總生存期和無病生存期［21］。敲除Notch信號可下調Myc和Cyclin A1的表達阻斷ccRCC細胞生長周期，抑制增殖［8］；Notch抑制劑處理后的裸鼠可以有效抑制腎癌細胞移植瘤生長［25］。團隊研究發現，軟堅散結方促進腎透明細胞癌細胞系7860凋亡，其機制是通過阻斷Notch1及凋亡信號通路［22］。為此，本研究在前期基礎上，進一步通過體內實驗證明軟堅散結方通過阻斷Notch信號（DAPT組）可抑制7860細胞裸鼠移植瘤生長，并下調Bcl-2，上調Bax等凋亡因子；軟堅散結方組與DAPT組比較，具有更明顯的抑瘤作用，下調Notch1表達與DAPT作用相當，與DAPT組相比，NICD、Bcl-2顯著下降，Bax表達顯著上升，說明軟堅散結方通過抑制Notch通路調控相關凋亡因子抑制腎透明細胞癌癌組織生長，這與既往在體、離體實驗結論一致［8，20］。其中NICD為Notch剪切后的胞內段，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合形成NICD/CSL復合體，激活下游通路，而本研究中軟堅散結方對NICD有更強的調控作用，推測軟堅散結方可能阻滯了Notch1的切割，或在核內阻斷NICD/CSL復合體的形成，或軟堅散結方協同阻滯Notch相關交叉通路共同誘導凋亡。

綜上所述，軟堅散結方可有效抑制移植瘤腫瘤生長，其作用機制可能與靶向阻斷Notch信號表達，從而進一步誘導凋亡有關。值得注意的是，軟堅散結方相比DAPT阻斷劑具有更明顯抑瘤效果及促凋亡作用，這可能是中藥多組分多通路多靶點協同調控的結果。本研究涉及的蛋白表達較少，且未涉及交叉通路，軟堅散結方對裸鼠腎透明細胞癌的作用機制值得進一步研究。