miR-542-3p對脂多糖誘導的人支氣管上皮細胞增殖和遷移的影響及機制研究

石曉嵐，趙 龍，王 寧，劉翠翠，王 靜，馬彩鈴

(西安市兒童醫院呼吸哮喘中心，陜西 西安710002)

我國哮喘患者大約在3000萬，且一半以上的哮喘患者在兒童期發病[1]。兒童哮喘如未得到及時治療，可能會出現喘息、咳嗽等癥狀，嚴重影響其生活質量，甚至威脅其生命。因此，闡明哮喘的發病機制，開發新的治療靶點具有重要意義。近年來，非編碼RNA的作用已成為一個重要的研究領域，其中，微小核醣核酸(microRNAs，miRNAs)通過結合保守的種子序列來靶向信使RNA(mRNA)轉錄，進而調節多種不同的疾病，如哮喘、肺病和癌癥[2-6]。據報道，miR-542-3p的過表達能抑制反式-7,8-二羥-9,10-環氧苯并芘[anti-benzo(a)pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide，anti-BPDE]誘導人支氣管上皮細胞16HBE-T的增殖和遷移[7]。但miR-542-3p在兒童哮喘中的作用及分子機制尚不明確。本研究發現miR-542-3p通過IL-33/sST2信號通路來抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)處理的BEAS-2B細胞的增殖和遷移，為研究治療兒童哮喘的新方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 MEM培養基(Gibco公司，美國)；脂質體RNAiMAX(Invitrogen，美國)；Trizol試劑(Invitrogen，美國)；TaqMan逆轉錄試劑盒(Takara Bio，日本)；microRNA反轉錄試劑盒(Applied Biosystems，美國)；SYBR Fast qPCR Mix(Takara Bio，日本)；內參U6(廣州銳博生物科技公司)；酶活性測定試劑盒(Promega公司，美國)；CCK8(同仁公司，日本)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒P0012A(上海碧云天公司)；5920R低溫高速離心機(Eppendorf公司，德國)；酶標儀(TZCAN公司，奧地利)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養及轉染：將人支氣管上皮細胞系BEAS-2B培養在含10%(V/V)胎牛血清的MEM培養基，置于含5%CO2(V/V)的37 ℃培養箱中。LPS(0.1、1、10、100 μg/ml)處理BEAS-2B細胞24 h構建哮喘模型。等體積DMSD處理BEAS-2B細胞作為未處理組(Untreated)。將密度為2×105的BEAS-2B細胞接種至6孔板上，待細胞融合度為80%時，用脂質體RNAiMAX轉染mimic NC、inhibitor NC、miR-542-3p+pcDNA3.1至BEAS-2B作為空載組。轉染miR-542-3p mimic(miR-542-3p)、miR-542-3p-inhibitor，miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33至BEAS-2B作為實驗組。

1.2.2 實時熒光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測miR-542-3p、白細胞介素33(IL-33)、可溶性生長刺激表達基因2蛋白(sST2)mRNA的表達：Trizol試劑提取總RNA，TaqMan逆轉錄試劑盒或microRNA反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。按照SYBR Fast qPCR Mix試劑盒的說明對LPS誘導的BEAS-2B中的miR-542-3p、IL-33、sST2進行PCR定量檢測，所需引物由Premier 6.0設計，并由北京擎科新業生物合成。以U6為miR-542-3p內參，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為IL-33和sST2內參，用2-ΔΔCt法計算其mRNA表達量。

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測miR-542-3p和IL-33的靶向關系：利用生物信息學分析網站microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do)預測IL-33上游的miRNA，并利用雙熒光素酶報告系統對基因進行驗證。根據酶活性測定試劑盒的說明，用PBS洗滌96孔板，然后向每個孔中加入100 μl的磷脂溶液，低速振蕩15 min后收集細胞裂解緩沖液。取20 μl細胞裂解100 μl熒光素酶檢測試劑II混合，用光度計測定熒光素酶活性值。然后加入100 μl的1×Stop & Glo溶液，均勻混合，測定海腎熒光素酶的活性值，報告基因的表達量是螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的比值。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力:將mimic NC、miR-542-3p、miR-542-3p+pcDNA3.1、miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33組細胞分別接種在96孔板，采用CCK8法分析細胞增殖情況。孵育24、48、72、96 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液。再孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的OD值，每組重復3次。

1.2.5 劃痕法檢測細胞遷移能力:將mimicNC、miR-542-3p、miR-542-3p+pcDNA3.1，miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33組細胞分別接種在96孔板，采用劃痕法分析細胞遷移能力。轉染48 h后，將細胞接種至6孔板中孵育(5×104個細胞/孔)。待細胞融合至90%～95%后，用無菌塑料微管尖端刮除單層細胞，孵育24 h。幾次清洗后，用X71倒置顯微鏡觀察傷口愈合情況并拍照(奧林巴斯公司)。

1.2.6 免疫印跡分析檢測蛋白表達:將轉染成功mimic NC、miR-542-3p、inhibitor NC、miR-542-3p inhibitor的細胞在冰裂解液中裂解30 min，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，提取蛋白質。用10%(W/V)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質溶解，并轉移到PVDF膜上。于Tris緩沖鹽水中，用5% (W/V)脫脂牛奶封閉PVDF膜，并與一抗(1∶1000)于4 ℃過夜孵育。用TBST清洗3次，每次5 min，然后用辣根過氧化氫酶標記的二級抗兔抗體檢測細胞膜，增強型化學發光試劑盒對條帶進行可視化。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件進行分析，單因素方差分析(AVONA)進行多組間比較，LSD法進行兩兩比較，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-542-3p在LPS誘導的BEAS-2B中的表達 用濃度為0.1、1、10和100 μg/ml的LPS分別處理BEAS-2B細胞24 h后檢驗細胞活性，發現BEAS-2B細胞活性隨著LPS濃度的增加呈遞減趨勢。因為BEAS-2B細胞活性在1 μg/ml LPS處理下活性顯著下降，因此選用1 μg/ml LPS處理BEAS-2B細胞24 h構建哮喘細胞模型(圖1A)。RT-PCR分析結果顯示，LPS處理抑制miR-542-3p在BEAS-2B中的表達(圖1B)。

注：與未處理組比較,*P<0.05

2.2 miR-542-3p對LPS誘導的BEAS-2B增殖和遷移的影響 分別將mimic NC，miR-542-3p轉染至BEAS-2B，并進行1 μg/ml LPS處理24 h。miR-542-3p顯著增加miR-542-3p表達，miR-542-3p inhibitor顯著抑制miR-542-3p表達，證明轉染成功(圖2A)。CCK-8和劃痕實驗分析顯示，過表達miR-542-3p可顯著抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞增殖和遷移，而miR-542-3p inhibitor顯著促進LPS誘導的BEAS-2B細胞的增殖和遷移(圖2B、C)。

2.3 miR-542-3p與IL-33的相互關系 qRT-PCR結果顯示，經過1 μg/ml LPS處理24 h，BEAS-2B細胞中的IL-33和sST2的mRNA相對表達量均顯著上調(圖3A)。利用在線網站microRNA.org預測發現miR-542-3p具有與IL-33結合的位點(圖3B)。我們將含有miR-542-3p預測結合位點或突變位點的IL-33-3’-UTR區域構建至熒光素酶載體中，結果顯示miR-542-3p顯著抑制野生型熒光素的酶活性，但不影響突變型熒光素的酶活性(圖3C)。對miR-542-3p與IL-33進行Spearman相關性分析，結果顯示在LPS誘導的BEAS-2B細胞中，miR-542-3p與IL-33表達呈負相關(圖3D)。免疫印跡分析和RT-PCR結果顯示，miR-542-3p可顯著降低IL-33的mRNA及蛋白質相對表達量(圖3E、F)。

2.4 miR-542-3p/IL-33/sST2對LPS誘導的BEAS-2B增殖和遷移的影響 分別將mimic NC、miR-542-3p、miR-542-3p+pcDNA3.1、miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33轉染至BEAS-2B，1 μg/ml LPS處理24 h后，檢測BEAS-2B細胞的增殖和遷移水平。結果顯示，過表達IL-33可顯著提高miR-542-3p抑制的BEAS-2B細胞的增殖和遷移能力(圖4)。

3 討 論

哮喘是由多種炎性介質或細胞因子導致的氣道高反應慢性炎癥，不僅會引起慢性炎癥相關反應，還會出現咳嗽、鼻塞、胸悶等氣道高敏性反應，若病情加重，甚至會造成不可逆的氣道狹窄和氣道重建[8]。根據第三次中國城市兒童哮喘流行病學調查，我國兒童的哮喘患病率正以每十年50%的幅度增加。但患兒的較差配合度和國內目前有限的診斷治療技術使很多哮喘患兒沒有及時接受正確有效的診療。因此對哮喘病理的研究和尋找治療兒童哮喘的靶標分子非常重要。

miRNAs在各種體液(血液、尿液、痰、呼氣冷凝液、血清和血漿)中非常穩定，因此對哮喘中miRNA功能的研究可能會使我們找到更多治療兒童哮喘的方法[9-10]。miR-542-3p在非小細胞肺癌細胞[11]、肝細胞癌細胞[12]、卵巢癌細胞[13]中表達均下調。本研究通過對BEAS-2B進行LPS處理，發現miR-542-3p在哮喘細胞模型中的表達顯著低于正常細胞。miR-542-3p抑制anti-BPDE誘導的16HBE-T細胞的增殖和遷移水平[14]。Liu等[11]研究發現，通過調控FTSJ2，miR-542-3p可以抑制肺癌細胞的增殖和遷移。王躍等[15]在多種人胃癌細胞和胃腺癌組織中均發現miR-542-3p呈低表達狀態，且miR-542-3p可抑制胃腺癌細胞的侵襲轉移能力。本研究發現miR-542-3p抑制LPS誘導的BEAS-2B的增殖和遷移，與已有文獻中的研究結果相符。

注：與mimic NC組比較，*P<0.05；與miR542-3p+pcDNA3.1-IL-33組比較，#P<0.05

IL-33(也稱為IL-1F11或NF-HEV)是2005年新發現的哮喘啟動因子，具有潛在的診斷及治療價值[16]。IL-33通常與其特異性受體ST2結合形成復合物來發揮作用。在哮喘發展過程中，IL-33/ST2通過激活Th2型免疫反應，進而誘發哮喘等過敏性疾病的發生[17]。研究顯示，重度支氣管哮喘病人的支氣管肺泡灌洗液中的IL-33、sST2的水平顯著高于輕度支氣管哮喘患者[18-19]，阻斷IL-33/sST2信號通路可緩解過敏性哮喘。本研究發現在LPS誘導的BEAS-2B細胞中，IL-33和sST2均顯著高于未處理組，且miR-542-3p與IL-33表達呈負相關關系。IL-33的過表達會減弱miR-542-3p對LPS誘導的BEAS-2B細胞的增殖和遷移能力抑制作用，表明miR-542-3p可能通過靶向IL-33/sST2抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究發現miR-542-3p在LPS誘導的BEAS-2B細胞中上調表達，并且通過靶向IL-33/sST2來抑制LPS誘導的BEAS-2B的增殖和遷移，表明miR-542-3p可能將成為新的兒童哮喘治療靶點。