兩次卵巢發育成熟擬穴青蟹卵巢與肝胰腺營養成分比較分析

喻國洪, 王揚才, 金中文

(1. 寧波大學 海洋學院, 浙江 寧波 315832; 2. 寧波市海洋與漁業研究院, 浙江 寧波 315408)

擬穴青蟹(Scylla paramamosain, 以下簡稱青蟹)隸屬甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Syclla), 主要分布于中國浙江、福建、廣東、海南等東南沿海各地區, 是中國重要的經濟蟹類之一。青蟹營養豐富、味道鮮美、經濟價值高, 卵巢發育至Ⅴ期成熟期的雌蟹俗稱“紅膏蟹”, 市場價格為普通青蟹的兩倍以上[1], 而膏蟹一旦產卵抱卵, 其經濟價值大幅下降。在浙江沿海, 青蟹一般9月—10月進行生殖脫殼并交配, 到次年4月—5月產卵, 第一次卵巢發育歷時7～8個月, 營養積累時間長。而產卵1次后的青蟹無需再交配, 再經過1個月的培育, 有些雌蟹的卵巢即可二次發育成熟, 成熟后的卵子也能正常受精、抱卵和孵化。肝胰腺和卵巢是其重要的可食部位, 目前有關青蟹卵巢發育的研究多集中于第一次發育卵巢[2-3], 而青蟹卵巢二次發育時間遠短于第一次卵巢發育, 其卵巢和肝胰腺營養積累狀況如何目前研究較少。因此, 本文對卵巢二次發育紅膏蟹卵巢和肝胰腺的主要營養成分進行分析和評價, 并與卵巢一次發育紅膏蟹對比, 以期為青蟹開發利用及親本培育提供理論參考和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源及制備

第一次卵巢發育青蟹樣本為2017年繁育的苗種經過1 a養殖達到育苗要求的親本個體。二次卵巢發育青蟹取自本課題組2018年3月春季育苗, 初次產卵后經過50 d左右強化培育的親本個體。青蟹選擇甲殼兩側充滿性腺, 在光線下觀察已無透明區域, 解剖后卵巢呈鮮亮桔紅色、卵粒可辨、鏡檢卵巢發育達Ⅴ期的青蟹。取二次發育和一次發育青蟹各5只, 用鑷子等工具取出全部卵巢、肝胰腺, 將樣品分為兩份, 一份放置-20 ℃冰箱中冷凍保存, 用于一般營養成分測定; 另一份放置-80 ℃冰箱中冷凍保存, 用于氨基酸、脂肪酸測定。實驗用二次卵巢發育青蟹平均體質量為(344.88±99.07) g、平均殼長(8.71±0.82) cm、平均殼寬(12.61±1.19) cm, 與一次卵巢發育青蟹規格(平均體質量(277.44±57.8) g、平均殼長(7.94±0.56) cm、平均殼寬(11.53±0.79) cm無顯著差異(P＞0.05)。

1.2 營養成分測定

水分、粗蛋白、粗脂肪測定分別按照國標GB5009.3—2016、GB5009.5—2016、GB 5009.6—2016測定, 氨基酸分析采用酸水解液質聯用外標法(LC/MS)[4], 由于采用酸水解法處理樣品, 因此本文不考慮色氨酸的檢測。脂肪酸組成分析采用氣質聯用外標法(GC/MS)[5], 根據脂肪酸標準品的分析圖譜, 以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標做標準曲線, 根據樣品溶液的峰面積在曲線上讀取樣品中絕對含量。

1.3 營養評價

卵巢指數(gonad somatic index, GSI, %)=卵巢質量/體質量×100。肝胰腺指數 (hepatopancreas somatic index, HSI, % ) =肝胰腺質量/體質量×100。根據聯合國糧農組織/世界衛生組織(FAO/WHO)1973年建議的氨基酸評分標準模式和全雞蛋蛋白質的氨基酸模式計算氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)、必需氨基酸指數(EAAI)[6-7], 計算脂肪酸致動脈粥樣硬化指數(IA)和血栓形成指數(IT)[8], 以評估青蟹卵巢和肝胰腺脂肪酸對人類心血管疾病發生的影響。

式中, MUFA為多不飽和脂肪酸; PUFA為單不飽和脂肪酸。

1.4 抱卵率與抱卵量的計算

抱卵率=抱卵只數/初始總只數。

絕對抱卵量=產卵總質量×樣本卵數/樣本卵質量。取樣的卵均為產卵8 h～16 h間胚胎處于卵裂期的蟹。隨機取5份0.1 g卵, 數出卵數后取平均數。

1.5 數據分析統計

采用SPSS統計軟件(SPSS 20)進行統計分析, 所有數據均以平均值±標準差表示。T-Text檢驗方法分析, 取P＜0.05為差異顯著標準,P＜0.01為極顯著差異標準。

2 結果

2.1 常規營養成分

第二次卵巢發育成熟的青蟹其GSI顯著低于第一次卵巢發育成熟的個體(P＜0.01)(表1), 肝胰腺粗脂肪含量顯著低于第一次卵巢發育成熟的個體(P＜0.05)。而HSI在兩次發育中并無顯著差異(P＞0.05)。卵巢和肝胰腺中粗脂肪和粗蛋白在兩次卵巢發育成熟樣本個體中無明顯差異(P＞0.05), 卵巢中粗蛋白含量高于肝胰腺、而粗脂肪含量比肝胰腺低。

表1 第一次和第二次卵巢發育成熟擬穴青蟹GSI、HSI及卵巢和肝胰腺常規營養(%, 干質量, n = 5)Tab. 1 GSI, HSI, and nutrient contents of the ovaries and hepatopancreas of mud crabs (%, fresh weight, n = 5)

2.2 脂肪酸組成、含量比較及營養評價

兩次卵巢發育成熟青蟹的卵巢中均檢測出30種脂肪酸, 其中飽和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)14種、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA) 6種和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA) 10種(表2)。其中, 含量排前兩位的SFA為棕櫚酸(C16: 0)和硬脂酸(C18: 0), 含量排前兩位的MUFA為C18: 1(ω-9)和C16: 1(ω-7), PUFA為C22: 6(ω-3)(DHA)和C20: 5(ω-3)(EPA), 這6種脂肪酸占二次卵巢發育成熟青蟹卵巢總脂肪酸(total fatty acid, TFA)的83.05%, 占一次卵巢發育成熟青蟹TFA的82.25%。SFA、MUFA、PUFA和TFA在兩次卵巢發育成熟青蟹卵巢中均無顯著差異(P＞0.05)。肝胰腺中檢測出30種脂肪酸, 其中SFA14種, MUFA6種和PUFA10種。含量較高的脂肪酸同樣是C16: 0、C18: 0、C16: 1(ω-7)、C18: 1(ω-9)、C20: 5(ω-3)、C22: 6(ω-3)等, 分別占二次卵巢發育成熟青蟹肝胰腺總脂肪酸的76.99%, 占一次卵巢發育成熟青蟹總脂肪酸的78.32%, 該6種主要的脂肪酸在兩次卵巢發育成熟青蟹中的肝胰腺內均存在顯著差異, 二次卵巢發育顯著低于一次卵巢發育(P＜0.05)。SFA、MUFA、PUFA和TFA在二次卵巢發育和一次卵巢發育成熟青蟹肝胰腺中有顯著性差異(P＜0.05), 二次卵巢發育青蟹的主要供能脂肪酸C16: 0、C18: 0、C16: 1、C18: 1顯著性低于一次卵巢發育青蟹(P＜0.05)。

表2 擬穴青蟹第一次和第二次卵巢發育中卵巢和肝胰腺中脂肪酸的組成（mg/g干質量, n = 5）Tab. 2 Composition of fatty acids in ovaries and hepatopancreas of the first and the second ovarian development of mud crab(mg/g dry weight, n = 5)

續表

二次卵巢發育成熟青蟹卵巢中UFA(unsaturated fatty acid, 不飽和脂肪酸)/SFA為2.17, 一次卵巢發育為2.09, 顯著(P＜0.05)高于兩次卵巢發育成熟青蟹肝胰腺中的UFA/SFA(一次為1.44、二次為1.55), 表明卵巢中脂肪酸不飽和度更高, 而兩次卵巢發育成熟青蟹卵巢和肝胰腺前后無顯著差異(P＞0.05)。卵巢中(ω-3)PUFA/(ω-6)PUFA分別為一次4.09和二次4.25, 肝胰腺中為一次2.59和二次2.84。一次和二次卵巢發育的青蟹卵巢的IA和IT分別為0.35、0.35和0.29、0.29, 肝胰腺的IA和IT分別為0.53、0.56和0.45、0.45, 兩次卵巢發育相比卵巢和肝胰腺均比較接近。

2.3 氨基酸組成及營養評價

兩次卵巢發育青蟹卵巢和肝胰腺中氨基酸組成類似, 均檢測出17種氨基酸, 其中人體所需的必需氨基酸(essential amino acids, EAA)9種(色氨酸因酸水解被破壞而無法檢出), 非必需氨基酸(non-essential amino acids, NEAA)8種(表3)。由表3可知, 9種EAA中含量高低依次為賴氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸, 卵巢中含量低于10 mg/g的為甲硫氨酸和半胱氨酸, 肝胰腺中含量低于10 mg/g的為甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。除二次卵巢發育肝胰腺中半胱氨酸顯著高于一次卵巢發育外, 其余EAA無論在卵巢還是肝胰腺中均無顯著差異(P＞0.05)。NEAA中精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量較高, 占總NEAA的50%以上。無論卵巢還是肝胰腺, 卵巢二次發育青蟹的EAA、NEAA、TAA含量與卵巢一次發育青蟹無顯著差異(P＞0.05)。

表3 第一次和第二次卵巢發育成熟擬穴青蟹卵巢和肝胰腺氨基酸的組成(mg/g干質量, n = 5)Tab. 3 Amino acid composition in the ovaries and hepatopancreas of mud crabs in the first and second stages of ovarian development (mg/g dry weight, n = 5)

續表

一次和二次卵巢發育青蟹卵巢的EAA/TAA分別為0.45和0.44, 肝胰腺的EAA/TAA都為0.43。由表4可知, 卵巢中的氨基酸得分(AAS)均高于肝胰腺, 二次卵巢發育青蟹AAS均低于一次卵巢發育青蟹, 卵巢和肝胰腺中第一和第二限制性氨基酸均為蛋氨酸+半胱氨酸和亮氨酸, 必需氨基酸指數(EAAI)卵巢高于肝胰腺, 一次卵巢發育高于二次卵巢發育, 兩次卵巢發育青蟹的肝胰腺中呈味氨基酸[9](Taste Amino Acid, TAA)(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸)與總氨基酸比值DAA/TAA分別為0.39和0.40, 高于卵巢中的0.35和0.36。

表4 第一次和第二次卵巢發育成熟擬穴青蟹卵巢和肝胰腺的必需氨基酸成份評價(mg/gN, 干質量, n = 5)Tab. 4 Evaluation of the EAA composition of the ovaries and hepatopancreas of mud crabs in the first and the second stages of ovarian development (mg/g N dry weight, n = 5)

2.4 抱卵率與抱卵量的比較

由表5 可知, 一次卵巢發育青蟹的抱卵率為69.4%明顯大于二次卵巢發育青蟹的20%。計算得出處于卵裂期的卵為5.58萬粒/g, 從而算出第一次卵巢發育青蟹的平均絕對抱卵量為(341.3±45.6)萬粒, 顯著(P＜0.05)高于二次卵巢發育青蟹的(235.2±17.82)萬粒。

表5 第一次和第二次卵巢發育擬穴青蟹抱卵率與抱卵量的比較Tab. 5 Comparison of the egg-carrying rate and number of eggs carried in the mud crab during the first and second stages of ovarian development

3 討論

3.1 常規營養

擬穴青蟹卵巢和肝胰腺營養成分是衡量養殖產品特別是紅膏蟹品質的重要指標。分析結果表明, 二次卵巢發育成熟青蟹的性腺指數GSI顯著低于第一次卵巢發育成熟青蟹(P＜0.05), 且肝胰腺粗脂肪含量也顯著低于第一次(P＜0.05)。脂肪含量與鋸緣青蟹中的報道相一致[10], 粗蛋白含量在卵巢中高于中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 而肝胰腺中較低[11]。青蟹第一次抱卵期間能量消耗巨大, 卵巢二次發育過程時間短, 即使餌料充足條件下卵巢二次發育成熟青蟹的GSI也遠低于一次卵巢發育成熟青蟹, 表明卵巢二次發育的青蟹生殖力下降, 這與中華絨螯蟹第二次卵巢發育研究結果基本一致[12]。造成這種差異的主要原因是, 首先兩次卵巢發育的時間長短不同,第一次卵巢發育的青蟹從9—10月份一直到翌年3月份至卵巢成熟, 其經歷了越冬的強化培育, 故其肝胰腺中積累了大量的營養物質供卵巢發育。而第二次卵巢發育的時間僅50 d左右, 在第一次抱卵期間能量消耗巨大, 為保證卵巢發育的正常進行, 其肝胰腺脂類的代謝活動大大加強, 不斷的由食物中攝取脂類物質并合成脂肪, 迅速轉移至正在旺盛發育的卵巢[10]。其次, 兩次卵巢發育起點不同, 第一次卵巢發育起點是由卵原細胞開始逐漸發育為成熟的卵母細胞, 而第二次卵巢發育的起點主要為卵黃合成前的卵母細胞和內源卵黃合成期的卵母細胞[13]。

3.2 脂肪酸

本研究結果表明, C16: 0、C18: 0、C16: 1(ω-7)、C18: 1(ω-9)、C20: 5(ω-3)、C22: 6(ω-3)是青蟹卵巢和肝胰腺主要的脂肪酸。隨著二次卵巢發育成熟, 卵巢當中的這些物質含量上升, 且趨于一次發育卵巢的正常水平。甲殼動物在性腺發育過程中對脂肪酸的需求量是一定的, 在餌料充足的情況下, 卵巢發育最接近正常值[14]。然后胚胎發育和幼體的生長蛻殼需要卵巢積累足夠的卵黃物質[15], 而卵黃物質中主要是蛋白質和脂肪, 其含量相對穩定[16]。這與于智勇[12]在中華絨螯蟹第二次卵巢發育中的結果相似。肝胰腺中的這些物質則反向變化, 均顯著低于一次卵巢發育青蟹。有研究表明, 在卵巢發育過程中,肝胰腺中脂類的合成比卵巢強的多, 雖然卵巢也合成一部分, 但是有相當一部分是從肝胰腺中通過血液運輸以磷脂的形式轉移而來[2]。主要的能量型脂肪酸(C16: 0、C16: 1(ω-7)、C18: 0、C18: 1(ω-9)), 兩次卵巢發育青蟹卵巢中并無顯著差異。它們在卵巢發育過程中積累, 供其后面的胚胎發育及幼體生長使用[12]。DHA、EPA、LA和LNA是青蟹的必須脂肪酸(EFA), 青蟹自身無法合成, 只能從食物中攝取獲得, 它們對卵子的受精和孵化、幼體存活、生長和變態以及維持成體正常生長和繁殖等均具有重要的營養作用[2]。兩次卵巢發育卵巢中EFA無顯著差異另外C20: 4(ω-6)是合成前列腺素的主要前體, 前列腺素對于甲殼類等許多無脊椎動物的產卵和孵化起重要作用[17]。本研究結果發現兩次卵巢發育卵巢中C20: 4(ω-6)也無顯著差異。以上這些重要的脂肪酸在兩次卵巢發育中差異都不顯著, 說明二次卵巢發育卵巢中的營養能夠滿足后期胚胎發育及早期幼體的發育。在實際生產中, 我們也發現, 二次卵巢發育的青蟹抱卵率和抱卵量低于一次卵巢發育青蟹, 但是早期幼體的質量以及出苗量與第一次接近, 沒有明顯的生殖性能的下降。這不同于中華絨螯蟹, 中華絨螯蟹第二次產卵的生殖性能和苗種的質量遠遠不及。第一次產卵[18]。但是與三疣梭子蟹(Portunus trituber-culatus)相似, 三疣梭子蟹二次與一次發育成熟的卵巢的GSI以及生殖性能比較接近[13]。

兩次卵巢發育青蟹卵巢中UFA/SFA顯著(P＜0.05)大于肝胰腺, 表明卵巢中脂肪酸不飽和度更高,而兩次卵巢發育的青蟹卵巢和肝胰腺前后差異不大。兩次卵巢發育成熟青蟹卵巢中(ω-3)PUFA/(ω-6)PUFA都遠高于FAO/WHO推薦的(ω-3)PUFA/(ω-6)PUFA日常膳食0.1～0.2, 表明青蟹卵巢和肝胰腺可有效補充膳食中的(ω-3)PUFA。兩次卵巢發育青蟹的卵巢和肝胰腺的IA和IT均比較接近, 無顯著差異(P＞0.05)。但遠低于豬肉(IA: 0.6; IT: 1.37)、牛肉(IA: 0.72; IT: 1.06)和羊肉(IA: 1.00; IT: 1.58), 表明卵巢發育成熟的青蟹卵巢和肝胰腺具有降血脂、抗動脈硬化等預防心血管疾病的功效[19]。

3.3 氨基酸

兩次卵巢發育青蟹卵巢中的TAA和EAA都顯著高于肝胰腺, 但EAA/TAA卻比較接近, 都在0.43～0.45范圍內, 青蟹的卵巢和肝胰腺前后兩次卵巢發育EAA/TAA無顯著差異(P＞0.05)。FAO/WHO/UNU(1985年)推薦食品中的EAA/TAA理想值在0.4左右[7],兩次卵巢發育青蟹的卵巢和肝胰腺超過了0.4, 說明兩次卵巢發育青蟹的卵巢和肝胰腺均具有較高的氨基酸營養價值, 蛋白質質量較好。EAAI是評價蛋白質營養價值的最常用指標之一, 數值越大, 表明營養價值越高[20]。一次卵巢發育青蟹卵巢EAAI為82.51顯著高于(P＞0.05)二次卵巢發育青蟹卵巢73.91,而肝胰腺兩次發育比較接近。說明一次卵巢發育成熟青蟹卵巢蛋白質營養價值更高。在味道方面, 兩次卵巢發育成熟青蟹的肝胰腺DAA/TAA為0.39～0.40,大于兩次卵巢發育成熟青蟹的卵巢0.35～0.36, 說明肝胰腺比卵巢更鮮美, 而兩次卵巢發育成熟青蟹的卵巢和肝胰腺前后并無顯著差異(P＞0.05)。

青蟹的胚胎發育與卵巢的蛋白質和氨基酸的積累有直接的關系。胚胎發育所需要的蛋白質和氨基酸營養僅靠母體儲存在卵內的卵黃物質提供[21]。在紅螯鰲蝦(Cherax quadricarinatus)的胚胎發育過程中,有一部分蛋白質被用于構建組織和器官, 另一部分則被則被分解為胚胎發育提供所需要的能量[22]。青蟹生長所必需的的氨基酸有: 蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和纈氨酸[20]。二次卵巢發育青蟹與一次卵巢發育青蟹在該10種EAA無顯著差異(P＞0.05),而兩次卵巢中的粗蛋白含量也無顯著差異(P＞0.05),表明二次卵巢發育成熟青蟹的蛋白質和氨基酸營養與一次相近, 能滿足胚胎的發育。

3.4 抱卵率與抱卵量的比較分析

一次卵巢發育成熟青蟹抱卵率遠高于二次卵巢發育成熟青蟹, 且絕對平均抱卵量也顯著(P＜0.05)高于二次卵巢發育成熟青蟹。說明二次卵巢雖能發育, 但抱卵率卻很低, 其中的機制尚不明確。而二次卵巢發育青蟹的平均抱卵量低于第一次與前面的GSI相對應, 共同表明二次卵巢發育成熟青蟹生殖力低于第一次。

4 總結

綜上所述, 二次卵巢發育成熟的青蟹GSI和抱卵率低于一次發育影響了其生殖力, 但其脂肪酸和蛋白質氨基酸營養與一次相近能滿足胚胎的發育及初孵幼體的生長, 即兩次卵巢發育青蟹生殖性能接近。在實際生產中可選用二次卵巢發育成熟的青蟹,通過合適的培育技術促進卵巢發育和排卵, 從而延長育苗的時間, 降低育苗親本成本, 但因為抱卵率低, 故實際生產中因根據具體情況選擇是否使用二次卵巢發育成熟的青蟹作為親本培育。就營養價值而言, 兩次卵巢發育成熟青蟹卵巢和肝胰腺都有較高的脂肪酸和氨基酸營養價值, 推薦食用。