ROS/JNK通路在槲皮素抑制異煙肼誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用

陳廷玉，陳德順，何帥兵，易燕鋒，沈 洪，林鉅斌，盧春鳳

(1.湖州師范學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州313000；2.江南大學(xué) 物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

據(jù)2020年WHO統(tǒng)計(jì)資料顯示，結(jié)核病在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈急劇上升趨勢(shì)，中國(guó)是結(jié)核病高發(fā)國(guó)之一.目前，結(jié)核病的治療仍以藥物治療為主.異煙肼(isoniazid，INH)是臨床上廣泛應(yīng)用的一線抗結(jié)核藥物[1]，但因其嚴(yán)重的肝損傷限制了它的臨床應(yīng)用，且嚴(yán)重影響了結(jié)核病的治療效果[2-6].因此，如何防治INH肝損傷已成為亟需解決的問(wèn)題，尋找有效防治INH肝損傷的藥物也成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).槲皮素(quercetin，Que)是黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纖維化等多種藥理作用[7-9]，且使用安全，具有理想的臨床應(yīng)用前景.我們前期研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的肝細(xì)胞和大鼠肝損傷具有一定的保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不清楚[10-12].研究表明，ROS/JNK通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[13].因此，本研究以人肝細(xì)胞L-02細(xì)胞為研究對(duì)象，重點(diǎn)探討ROS/JNK通路在槲皮素抑制INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡中的作用，進(jìn)而闡明槲皮素對(duì)INH肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制，以期為臨床尋找有效防治INH肝損傷的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

L-02細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；異煙肼、槲皮素、DCFH-DA均為Sigma公司產(chǎn)品；MTT為Amresco公司產(chǎn)品；LDH活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒、Hoechst33258染色試劑盒、Caspase 3活性檢測(cè)試劑盒為杭州碧云天公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、PMSF為Merck公司產(chǎn)品；Super ECL為普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品；p-JNK、β-actin多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG為Zymed公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 L-02細(xì)胞培養(yǎng)與存活率檢測(cè)

L-02細(xì)胞用含青、鏈霉素雙抗及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng).鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加藥后換為不含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng).將細(xì)胞隨機(jī)分為4組.對(duì)照組(Control)：給予等體積無(wú)血清培養(yǎng)基；INH組(INH)：給予10 mmol/L INH；槲皮素低劑量組(Que-L)：給予10 mmol/L INH+25 μmol/L槲皮素；槲皮素高劑量組(Que-H)：給予10 mmol/L INH+50 μmol/L槲皮素.首先將細(xì)胞接種于96孔板中，再按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng) 24 h 后應(yīng)用MTT法檢測(cè)L-02細(xì)胞存活率.在波長(zhǎng)570 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率：

細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=(OD樣品-OD本底)/(OD對(duì)照-OD本底)×100%.

1.2.2 LDH活性測(cè)定

將L-02細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后應(yīng)用比色法測(cè)定細(xì)胞上清液中LDH活性.吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心，取上清液100 μL，加入50 μL蒸餾水和250 μL基質(zhì)緩沖液，充分混勻，37 ℃孵育15 min，加入250 μL 2,4-Dinitrophenylhydrazine，混勻，37 ℃孵育15 min，加入2.5 mL氫氧化鈉，室溫放置，3 min后在波長(zhǎng)440 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，并計(jì)算LDH活性.

1.2.3 Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將L-02細(xì)胞接種于用Poly-L-Lysine包被的培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后采用Hoechst 33258熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況.具體按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作：吸棄培養(yǎng)液，用PBS沖洗后加入500 μL固定液，4 ℃固定10 min，再用PBS沖洗，加入500 μL Hoechst 33258染色液，避光染色5 min，用PBS沖洗后加抗熒光淬滅劑，封片.在激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)460 nm下采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況，拍照并計(jì)算細(xì)胞凋亡率：

細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的細(xì)胞總數(shù)×100%.

1.2.4 Caspase 3活性檢測(cè)

采用比色法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中Caspase 3活性.首先按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后收集細(xì)胞，然后用PBS洗滌細(xì)胞，加入100 μL細(xì)胞裂解液冰上裂解，離心，收集上清液.具體檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作：取10 μL裂解上清液，加入90 μL檢測(cè)緩沖掖，再加入10 μL Ac-DEVD-pNA，37 ℃下避光反應(yīng)1 h，用多功能酶標(biāo)儀在400 nm處測(cè)定OD值，根據(jù)凋亡誘導(dǎo)的細(xì)胞OD值與空白對(duì)照細(xì)胞OD值的比值計(jì)算Caspase 3相對(duì)活性.

1.2.5 線粒體ROS水平測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，收集各組細(xì)胞，采用差速離心法分離線粒體，并用HEPES緩沖液制成線粒體懸液，應(yīng)用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞線粒體ROS水平.首先加入DCFH-DA，使其終濃度為2 μg/mL，37 ℃孵育30 min后，用冷PBS沖洗，然后在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm下采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度值.結(jié)果用相對(duì)值表示，即處理組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%.

1.2.6 p-JNK蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中的p-JNK蛋白表達(dá)水平.首先將L-02細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后收集細(xì)胞，然后加入細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，并用BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定.每孔上樣10 μg總蛋白，在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上.用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉，2 h后加入用封閉液稀釋的一抗(p-JNK、β-actin)，室溫孵育1 h后轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱孵育過(guò)夜.第二天用TBST洗膜，然后加入二抗室溫再孵育1 h后TBST洗膜.在暗室中用Super ECL發(fā)光液檢測(cè)目標(biāo)蛋白條帶，膠片曝光、顯影，并掃描膠片，用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件對(duì)p-JNK蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素和INH對(duì)細(xì)胞存活率及LDH活性的影響

由圖1和圖2可見：L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率明顯降低，而細(xì)胞上清液中LDH活性明顯增高(P<0.01)，提示INH可能造成細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致LDH漏出到細(xì)胞外液中；與INH組相比，槲皮素高劑量組細(xì)胞存活率明顯增高，而經(jīng)槲皮素處理后細(xì)胞上清液中的LDH活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且高劑量組的保護(hù)作用更顯著.

注：與對(duì)照組比較，“**”表示P<0.01；與INH組比較，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01.下同.

圖2 L-02細(xì)胞上清液中LDH活性

2.2 槲皮素和INH對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

采用Hoechst 33258熒光染料將L-02細(xì)胞染色后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，可見INH組細(xì)胞胞漿濃縮、核染色質(zhì)致密深染，且個(gè)別細(xì)胞發(fā)生了核固縮、核碎裂等凋亡形態(tài)學(xué)改變，而經(jīng)槲皮素處理后細(xì)胞凋亡形態(tài)明顯改善，見圖3.凋亡細(xì)胞數(shù)用凋亡百分率表示.由圖4可見：L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，細(xì)胞凋亡率顯著增高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明INH可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡；經(jīng)槲皮素處理后細(xì)胞凋亡率明顯低于INH組(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素可抑制L-02細(xì)胞凋亡，且高劑量組對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用更明顯.

注：A為對(duì)照組，B為INH組，C為槲皮素低劑量組，D為槲皮素高劑量組.下同.

圖4 L-02細(xì)胞凋亡率

2.3 槲皮素和INH對(duì)細(xì)胞Caspase 3活性的影響

由圖5可見：L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，細(xì)胞Caspase 3相對(duì)活性明顯升高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與INH組相比，槲皮素高劑量組細(xì)胞Caspase 3相對(duì)活性明顯降低(P<0.05)，表明槲皮素可抑制細(xì)胞Caspase 3相對(duì)活性.

圖5 L-02細(xì)胞Caspase 3活性Fig.5 Activity of Caspase 3 in L-02 cells

2.4 槲皮素和INH對(duì)細(xì)胞線粒體ROS水平的影響

由圖6可見：L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，細(xì)胞線粒體ROS相對(duì)水平明顯升高，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明INH可誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體ROS生成增多；而經(jīng)槲皮素處理后細(xì)胞線粒體ROS相對(duì)水平明顯低于INH組(P<0.05或P<0.01)，表明槲皮素可抑制細(xì)胞線粒體ROS生成，且高劑量組對(duì)ROS生成的抑制作用更明顯.

圖6 L-02細(xì)胞線粒體ROS水平Fig.6 Level of ROS in mitochondria of L-02 cells

2.5 槲皮素和INH對(duì)細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)的影響

JNK是細(xì)胞凋亡通路蛋白，因?yàn)閜-JNK是JNK的活性形式，所以本文研究了細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)情況，結(jié)果見圖7和圖8.L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)，表明INH可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)；與INH組相比，槲皮素高劑量組細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，表明槲皮素可抑制L-02細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá).

圖7 L-02細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)條帶Fig.7 Expression bands of p-JNK protein in L-02 cells

圖8 L-02細(xì)胞中p-JNK蛋白表達(dá)分析Fig.8 Analysis of p-JNK protein expression in L-02 cells

3 討 論

目前，INH誘導(dǎo)肝損傷的機(jī)制尚未闡明.研究表明，線粒體是藥物細(xì)胞毒性的主要靶點(diǎn)，也是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所[14-15].近年來(lái)，線粒體在細(xì)胞氧化損傷和凋亡機(jī)制研究中的作用越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注[16].槲皮素是黃酮類化合物，具有良好的保肝作用[17].研究表明，槲皮素在體外可通過(guò)清除氧自由基、抗氧化、抗凋亡等發(fā)揮作用[19].前期研究發(fā)現(xiàn)，INH在體內(nèi)和體外均可誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷，產(chǎn)生大量的ROS，而槲皮素對(duì)其具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不清楚[10-12,19].目前認(rèn)為ROS介導(dǎo)JNK通路是JNK通路的重要成員之一，ROS/JNK通路在細(xì)胞分化、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[13].本實(shí)驗(yàn)主要研究了INH對(duì)L-02細(xì)胞凋亡的影響，并重點(diǎn)探討了ROS/JNK通路在槲皮素抑制INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡中的作用.

本研究檢測(cè)了L-02細(xì)胞存活率、LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Caspase 3活性.LDH釋放或漏出是反映細(xì)胞膜受損的重要指標(biāo)，LDH漏出量的多少可間接反映細(xì)胞受損程度[20]，而Caspase 3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，Caspase 3的活化可啟動(dòng)細(xì)胞線粒體凋亡途徑.本研究結(jié)果顯示，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，細(xì)胞存活率明顯降低，LDH漏出和細(xì)胞凋亡率明顯增加，且Caspase 3活性明顯增高，表明INH對(duì)L-02細(xì)胞具有毒性作用，能夠造成細(xì)胞膜損傷，激活Caspase 3蛋白酶，啟動(dòng)細(xì)胞線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.Cristina等研究也發(fā)現(xiàn)，INH能誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21].本文的研究結(jié)果與此相似. 本研究還發(fā)現(xiàn)，采用槲皮素處理L-02細(xì)胞能增加細(xì)胞存活率，減少LDH漏出和細(xì)胞凋亡率，并能夠降低Caspase 3活性，表明槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞損傷及凋亡具有保護(hù)效應(yīng).這與文獻(xiàn)[22]的研究結(jié)果一致.

為探究INH誘導(dǎo)L-02細(xì)胞凋亡是否與ROS及JNK有關(guān)，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞線粒體ROS水平及細(xì)胞中JNK蛋白表達(dá)情況.ROS是細(xì)胞內(nèi)主要的氧自由基，它的水平能反映細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)的情況，同時(shí)ROS具有很高的生物學(xué)活性，可作為第二信使參與到JNK通路中.ROS是JNK上游信號(hào)分子，ROS可促進(jìn)JNK活化，而活化的JNK反過(guò)來(lái)刺激產(chǎn)生更多的ROS，最終JNK被持續(xù)活化，活化的JNK可啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而阻止JNK的活化可抑制細(xì)胞凋亡[23].本研究發(fā)現(xiàn)，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，細(xì)胞線粒體ROS生成和JNK蛋白表達(dá)增多，而槲皮素能明顯減少細(xì)胞線粒體ROS生成，并抑制細(xì)胞JNK蛋白表達(dá).這表明INH可能是通過(guò)增加ROS的生成激活JNK通路，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；槲皮素可能是通過(guò)減少ROS的生成抑制JNK通路，降低Caspase 3酶活性，從而抑制細(xì)胞凋亡.

綜上，在本文的研究條件下，INH可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞發(fā)生凋亡，槲皮素對(duì)INH誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抑制ROS/JNK通路有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還有待深入研究.