長鏈非編碼RNA RMRP對急性心肌梗死并發急性心力衰竭的預測價值*

揭 海，吳源聰，邢建龐

1.深圳市薩米醫療中心/深圳市第四人民醫院心血管內科,廣東深圳 518118；2.廣東醫科大學附屬醫院心血管內科,廣東湛江 524002;3.惠州市第六人民醫院心血管內科，廣東惠州 516211

急性心力衰竭(AHF)是急性心肌梗死(AMI)患者在住院期間最常見的并發癥，是影響AMI患者預后的重要危險因素，AMI并發AHF患者易出現休克和死亡[1]。在入院早期對AMI并發AHF的患者進行早期預測及干預，對減少AMI患者住院期間的并發癥和改善預后意義重大[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)位于細胞核或細胞質中，長度超過200個核苷酸。研究證實，多種lncRNA參與心臟疾病發生和發展的病理生理過程，如急性冠狀動脈綜合征、心力衰竭、心肌病和心律失常等[3-6]。lncRNA RMRP是編碼RNase線粒體RNA加工(MRP)的267個核苷酸RNA成分[7]。研究顯示，lncRNA RMRP可促進胃癌、膠質瘤和肺癌的進展[8-9]。基因芯片結果顯示，lncRNA RMRP在患有缺血性心肌病終末衰竭心臟及心臟肥大的小鼠模型中均明顯上調，提示lncRNA RMRP可能參與調控缺血誘導的心肌損傷[10]。盡管如此，AMI患者血清lncRNA RMRP相對表達水平及臨床意義尚不清楚。本研究旨在檢測AMI患者血清lncRNA RMRP相對表達水平，并探討其對AMI并發AHF的預測價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究納入2018年7月至2019年3月于惠州市第六人民醫院心血管內科住院的AMI患者142例為病例組，另選取同期于惠州市第六人民醫院行健康體檢的健康志愿者80例為對照組。病例組納入標準：(1)年齡>18歲；(2)首次發病，且發病到入院時間<12 h；(3)經過冠狀動脈造影檢查后，符合2015年中國急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南[10]。排除標準：(1)既往診斷有心肌病、瓣膜病、結締組織病、心力衰竭等各類心臟疾病；(2)合并嚴重肝腎功能障礙、各類惡性腫瘤、嚴重感染、自身免疫性疾病、血液系統疾病、嚴重腦卒中等；(3)妊娠期女性。病例組中男80例，女62例；平均年齡(60.97±12.40)歲。對照組中男48例，女32例；平均年齡(59.85±12.28)歲。兩組研究對象年齡和性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過惠州市第六人民醫院倫理委員會審核批準，研究對象簽署知情同意書。

1.2分組及診斷標準 病例組患者根據在住院期間是否發生AHF分為AHF亞組和非AHF亞組，其中AHF診斷標準如下[11]：(1)新發的典型心力衰竭臨床表現(如疲乏、呼吸困難、不能平臥等)；(2)心率加快，或出現奔馬律，或下1/2肺野可聞及濕啰音(住院期間心功能Killip Ⅱ級或以上)；(3)胸部影像學檢查顯示存在肺淤血、肺水腫、胸腔積液；(4)超聲心動檢查提示心功能受損[如左心室射血分數(LVEF)<0.5等]；(5)心源性休克。

1.3臨床資料收集和血清標本采集 從患者病歷資料中提取如下資料，包括性別、年齡、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史和體質量指數(BMI)等一般臨床資料，收集患者超聲報告資料。病例組患者在入院時采集外周靜脈血10 mL，對照組采集清晨空腹靜脈血10 mL，1 600 r/min，離心15 min后使用含乙二胺四乙酸的離心管留取上清液，在4 ℃條件下15 000 r/min，離心15 min，使用無RNA酶的凍存管收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 血清標本經室溫解凍復溫后，采用Trizol試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)提取總RNA，后采用反轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)反轉錄成cDNA，采用qRT-PCR測定血清標本的lncRNA RMRP相對表達水平。qRT-PCR反應體系如下：SYBR Select Master Mix(2×) 5.0 μL，cDNA 1.0 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。反應條件:預熱變性95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、退火延伸60 ℃ 60 s、共40個循環。引物序列由上海吉瑪生物有限公司合成，引物序列如下，正向：5′-GCC CAG CTT TCT TGA GTA A-3′；反向：5′-CAT ATG AGG AGT CGC AGG CA-3′。β-actin為內參，引物序列如下,正向：5′-GTC AAC GGA TTT GGT CTG TAT T-3′；反向：5′-AGT CTT CTG GGT GGC AGT GAT-3′。lncRNA RMRP相對表達水平的計算采用2-ΔΔCt法。

1.5超敏C-反應蛋白(hs-CRP)、肌鈣蛋白I(cTnI)和N末端B型利鈉肽前體(NT-proBNP)水平的測定 采用雙抗體夾心ELISA測定待測血清hs-CRP、cTnI、NT-proBNP水平，簡要步驟為：將患者血清解凍后，1 000×g離心10 min，取上清液。在酶標包被板上設標準品孔10孔，分別設定空白孔、對照孔及待測樣品孔，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，置37 ℃溫育30 min，洗滌5次，甩干，每孔加入酶標試劑50 μL，37 ℃溫育30 min，洗滌5次，甩干，每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，每孔加終止液50 μL，終止反應(此時藍色立轉黃色)，以空白孔調零，用酶標儀在450 nm波長下依序測量各孔的吸光度(A)值，計算hs-CRP、cTnI、NT-proBNP水平。

2 結 果

2.1病例組和對照組各參數比較 病例組和對照組在一般臨床資料(如年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常和累及病變動脈數目)之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，對照組LVEF、左心室短軸縮短率(LVFS)、hs-CRP、cTnI、NT-proBNP水平及lncRNA-RMRP相對表達水平均高于病例組(P<0.05)。見表1。

2.2AHF亞組和非AHF亞組各參數比較 AHF亞組血清lncRNA RMRP相對表達水平高于非AHF亞組(P<0.001)，AHF亞組LVEF和LVFS低于非AHF亞組(P<0.05)，AHF亞組hs-CRP、cTnI和NT-proBNP高于非AHF亞組(P<0.05)，AHF亞組與非AHF亞組患者在一般臨床資料，如年齡、性別、BMI、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂異常和累及病變動脈數目之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

續表1 病例組和對照組各參數比較

表2 AHF亞組和非AHF亞組各參數比較

2.3血清lncRNA-RMRP 相對表達水平與心力衰竭相關標志物間的關系 采用Spearman相關分析示，病例組血清lncRNA-RMRP相對表達水平與LVEF呈負相關(r=-0.843，P<0.001)，與hs-CRP(r=0.643，P<0.001)、cTnI(r=0.743，P<0.001)和NT-proBNP(r=0.943，P<0.001)呈正相關。

2.4血清lncRNA-RMRP、NT-proBNP、cTnI和hs-CRP對AMI并發AHF的預測價值 ROC曲線顯示，當血清lncRNA-RMRP截斷值為1.34時，lncRNA-RMRP預測AMI患者并發AHF的AUC為0.896(95%CI:0.844～0.948，P<0.001)，靈敏度為88.4%，特異度為83.3%；當血清NT-proBNP截斷值為1 675 ng/L時，NT-proBNP預測AMI患者并發AHF的AUC為0.809(95%CI:0.717～0.932，P<0.001)，靈敏度為78.2%，特異度為70.4%；當cTnI截斷值為12.13 μg/L時，cTnI預測AMI患者并發AHF的AUC為0.746(95%CI:0.632～0.818，P<0.001)，靈敏度為78.7%，特異度為72.4%；當hs-CRP截斷值為9.24 mg/L時，hs-CRP預測AMI患者并發AHF的AUC為0.723(95%CI:0.604～0.738，P<0.001)，靈敏度為61.3%，特異度為69.2%；血清lncRNA-RMRP預測AMI并發AHF的AUC大于NT-proBNP、cTnI和hs-CRP單項檢測。見圖1。

圖1 血清lncRNA-RMRP、NT-proBNP、cTnI和hs-CRP對急性AMI并發AHF的預測價值

3 討 論

AMI是嚴重的冠狀動脈疾病之一，是全世界死亡和殘疾的主要原因[12]。在AMI患者住院期間，心力衰竭是最常見的并發癥，AMI患者并發AHF導致死亡的風險較單獨AMI明顯增加[13]。AMI導致AHF與多種因素密切相關，其中心肌缺血再灌注損傷為重要因素之一，心肌細胞內線粒體鈣超載、氧化應激、ATP耗竭等原因均可導致心室肌功能障礙而引起AHF。藥物治療是對AMI并發AHF最有效的治療方法，但是早期缺乏癥狀會導致預后不良，探索有效的生物標志物對于AMI并發AHF的早期發現和預后改善至關重要[14]。有文獻報道，NT-proBNP和肌鈣蛋白等生物標志物可預測AMI后的心血管并發癥，但上述生物標志物易受到遺傳背景、環境、生物學行為和其他疾病異質性的影響[15]。

lncRNA是一組長度大于200個核苷酸的RNA，在心血管等各種疾病中起著重要作用，特別是在細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和氧化應激、缺血缺氧過程中具有重要的調節作用[16-17]。lncRNA-RMRP是一種最近發現和鑒定出的lncRNA，研究發現，其在非小細胞肺癌、肝癌、胃癌和甲狀腺癌中發揮癌基因的作用[18]。有研究顯示，lncRNA-RMRP參與心肌細胞的缺氧凋亡過程，在體外培養的心肌細胞中，缺氧刺激能促進lncRNA-RMRP表達而降低心肌細胞凋亡水平[19]。

本研究通過qRT-PCR檢測AMI患者血清中lncRNA-RMRP相對表達水平發現，與對照組相比，AMI患者血清中lncRNA-RMRP相對表達水平明顯升高，同時發現AHF亞組患者血清中lncRNA-RMRP相對表達水平高于非AHF亞組患者，上述研究結果提示，隨著心肌細胞損傷、壞死或凋亡數目增加，血清中lncRNA-RMRP相對表達水平升高，而并發AHF的患者血清lncRNA-RMRP 相對表達水平升高更為明顯。盡管導致AMI患者血清lncRNA-RMRP相對表達水平升高的分子機制尚不清楚，其可能為心肌細胞在缺血缺氧刺激下導致lncRNA-RMRP相對表達水平升高。有文獻報道，在肝細胞癌中，在缺氧培養條件下，lncRNA-RMRP相對表達水平升高，且lncRNA-RMRP 高表達與mi-613形成調節軸，促進肝癌的惡性進展[20]。

傳統預測AMI并發AHF的血清標志物有B型鈉尿肽、hs-CRP、胱抑素C和甲狀腺激素等，盡管上述血清學標志物對AHF具有一定的預測價值，但普遍存在特異度和(或)靈敏度欠佳的問題[21]。AMI患者并發AHF的病理生理基礎和起始事件為心肌梗死后發生左心室重構，有文獻報道，在93例AMI患者中，聯合檢測NT-proBNP和糖類抗原-125水平預測AMI患者發生左心室重構的AUC為0.850 (95%CI：0.761～0.915)[22]。還有文獻報道，在405例AMI患者中，住院期間發生AHF的患者85例，未發生AHF的患者320例，而入院時血清NT-proBNP和hs-CRP水平預測住院期間AMI并發AHF的AUC分別為0.919和0.705[23]，與本研究結果類似。上述結果提示，NT-proBNP和hs-CRP是AMI患者并發AHF重要預測和診斷分子標志物。本研究發現，血清lncRNA-RMRP相對表達水平預測AHF的AUC為0.896，血清中NT-proBNP、cTnI和hs-CRP預測AMI并發AHF的AUC分別為0.809、0.746和0.723，上述結果提示lncRNA-RMRP相對表達水平對AMI患者并發AHF預測價值高于傳統的AHF相關分子標志物。

文獻報道，lncRNA是潛在的心肌損傷和心功能損害的有效分子標志物，例如lncRNA-NRF是AMI后預測AHF重要的血清標志物[24]，其不僅可預測AMI后并發AHF，同時也是判斷AHF預后不佳的重要的分子標志物。此外，本研究發現，AMI患者血清lncRNA-RMRP相對表達水平與心功能常見指標LVEF呈負相關，而與hs-CRP、cTnI和NT-proBNP呈正相關，提示心肌梗死患者血清lncRNA-RMRP相對表達水平能反映患者心功能和心肌損傷狀態。對于AMI患者而言，盡早在住院期間發現和區分AHF高風險因素，不僅可對患者疾病嚴重程度進行有效分層，而且可對AHF的發生進行盡早干預，減少AMI并發癥，提高患者的生存率和生存質量。

綜上所述，本研究發現，AMI并發AHF患者血清lncRNA-RMRP相對表達水平升高，并發AHF患者血清lncRNA-RMRP相對表達水平高于未并發AHF的患者，血漿lncRNA-RMRP相對表達水平可作為AMI患者并發AHF的早期預測因子。