HBV前基因組RNA、甲胎蛋白異質(zhì)體3和乙型肝炎X抗體水平與HBV所致肝癌的關(guān)系及對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)*

郭振添，李 飛，莫海興

東莞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523000

肝癌是臨床較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前認(rèn)為肝癌的發(fā)病與肝硬化及肝炎病毒相關(guān)[1]。目前，在肝癌疾病進(jìn)展的研究中，缺乏相應(yīng)的敏感指標(biāo)。而在對(duì)患者的疾病診斷中，常常由于對(duì)疾病的預(yù)測(cè)難度較大，造成疾病的進(jìn)展。所以在臨床治療中，及時(shí)尋找積極有效的指標(biāo)，對(duì)于疾病的診斷及治療具有積極的意義[2]。在病毒學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒(HBV)主要包括4個(gè)編碼區(qū)，其中，在病毒編碼區(qū)HBV X基因編碼的HBV X蛋白對(duì)于病毒的蛋白質(zhì)具有明顯的調(diào)控作用[3]。HBV X抗體(HBxAb)被認(rèn)為是HBV感染的早期標(biāo)志。同時(shí)，HBxAb也可通過(guò)與機(jī)體的細(xì)胞因子及腫瘤壞死因子的相互協(xié)同作用，對(duì)腫瘤的進(jìn)展發(fā)揮作用。HBV前基因組RNA(HBV-pgRNA)能夠反映肝臟組織cccDNA的活性，而cccDNA是HBV感染后最早出現(xiàn)異常的標(biāo)志物，但是在臨床檢測(cè)中，cccDNA的檢測(cè)較為困難，而HBV-pgRNA的檢測(cè)較為便捷，對(duì)于病毒導(dǎo)致的癌變具有明顯的意義[4]。甲胎蛋白異質(zhì)體3(AFP-L3)對(duì)于肝癌的預(yù)測(cè)能力明顯優(yōu)于甲胎蛋白。在眾多甲胎蛋白的亞型中，AFP-L3只能由腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分泌，被認(rèn)為是診斷肝癌的高特異性指標(biāo)[5]。本研究通過(guò)對(duì)血清HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平與HBV所致肝癌的關(guān)系及對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)進(jìn)行分析，為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2015年1月至2017年6月確診的HBV所致肝癌患者60例作為肝癌組，其中男36例，女24例；年齡35～59歲，平均(45.66±2.15)歲；體質(zhì)量指數(shù)(24.51±2.09)kg/cm2；TNM分期[6]：Ⅰ～Ⅱ期患者31例，Ⅲ～Ⅳ期患者29例；肝癌組織分化情況：高分化患者22例，中分化患者16例，低分化患者22例。另選擇HBV所致肝硬化患者及單純性乙型肝炎患者各60例作為肝硬化組和乙型肝炎組。肝硬化組中男34例，女26例；年齡35～57歲，平均(45.94±2.68)歲；體質(zhì)量指數(shù)(24.40±2.20)kg/cm2。乙型肝炎組中男35例，女25例；年齡37～59歲，平均(45.78±2.49)歲；體質(zhì)量指數(shù)(24.20±2.10)kg/cm2。3組患者的性別、年齡及體質(zhì)量指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)論證通過(guò)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)預(yù)計(jì)生存時(shí)間>6個(gè)月；(3)卡式評(píng)分(KPS)[7]≥70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心、肝、腎功能嚴(yán)重不全；(2)存在交流障礙；(3)血常規(guī)異常；(4)不配合本研究方案。

1.2儀器與試劑 本研究采用的熒光定量PCR儀主要是由上海羅氏提供，實(shí)驗(yàn)試劑來(lái)自上海羅氏，操作流程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。使用美國(guó)Perkin Elmer生產(chǎn)的HBV-pgRNA試劑盒進(jìn)行HBV-pgRNA水平檢測(cè)。AFP-L3檢測(cè)試劑來(lái)自北京熱景生物技術(shù)公司，HBxAb水平檢測(cè)試劑來(lái)自上海朗頓生物技術(shù)公司。

1.3方法 采集所有患者靜脈血4 mL，6 000 r/min離心后，取上清液，采用親和吸附離心法對(duì)患者的AFP-L3水平進(jìn)行檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法對(duì)患者的HBxAb水平進(jìn)行檢測(cè)，采用磁珠法對(duì)血清的核酸RNA進(jìn)行提取，采用Dnase Ⅰ酶進(jìn)行DNA消化，采用熒光定量PCR對(duì)病毒核酸及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.13組患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 分別對(duì)肝癌組、肝硬化組及乙型肝炎組患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平進(jìn)行比較。

1.4.2不同分化程度患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 分別對(duì)高分化、中分化及低分化患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平進(jìn)行比較。

1.4.3不同病理分期患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 分別對(duì)TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平進(jìn)行比較。

1.4.4不同預(yù)后患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 對(duì)所有患者開(kāi)展為期3年的隨訪，以患者的死亡作為終點(diǎn)事件，分析截至2020年6月生存患者及死亡患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平之間的差異，并進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.13組患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 3組患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平在3組患者之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBV-pgRNA、HBxAb水平從高到低依次為乙型肝炎組、肝硬化組、肝癌組，AFP-L3水平從高到低依次為肝癌組、肝硬化組、乙型肝炎組。見(jiàn)表1。

表1 3組患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較

2.2不同分化程度患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 3組患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平在3組患者之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HBV-pgRNA、HBxAb水平從高到低依次為低分化組、中分化組、高分化組，AFP-L3水平從高到低依次為高分化組、中分化組、低分化組。見(jiàn)表2。

表2 不同分化程度患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較

2.3不同病理分期患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 Ⅰ～Ⅱ期患者的HBV-pgRNA、HBxAb水平明顯高于Ⅲ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅱ期患者的AFP-L3水平明顯低于Ⅲ～Ⅳ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同病理分期患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較

2.4不同生存情況患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較 生存組的HBV-pgRNA、HBxAb水平明顯高于死亡組，生存組的AFP-L3水平明顯低于死亡組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同生存情況患者的HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平比較

2.5相關(guān)性分析 HBV-pgRNA和HBxAb水平與肝癌患者的病理分期、組織分化及生存狀態(tài)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.771～-0.441，P<0.05)，AFP-L3與肝癌患者的病理分期、組織分化及生存狀態(tài)均呈正相關(guān)(r=0.339、0.521、0.664，P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 相關(guān)性分析

3 討 論

由于肝癌臨床癥狀較為隱匿，大多數(shù)肝癌患者確診時(shí)已發(fā)展為中晚期，喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響患者的生命安全。而常規(guī)的腫瘤標(biāo)志物對(duì)肝癌患者的診斷缺乏明顯的敏感性[8]，所以在臨床工作中，及時(shí)尋找有效的腫瘤指標(biāo)，對(duì)于提升疾病預(yù)后具有積極的意義。而在造成的肝癌患者的疾病進(jìn)展中，病毒載量的升高勢(shì)必會(huì)造成肝細(xì)胞的進(jìn)一步損傷[9]。

有研究表明，HBxAb是HBV感染機(jī)體的早期重要指標(biāo)，同時(shí)在慢性乙型肝炎患者體內(nèi)持續(xù)存在[9]。在對(duì)基因水平的分析中，HBV X基因?qū)τ诟渭?xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期的改變具有指導(dǎo)作用。在本研究中，隨著患者的肝細(xì)胞功能的不斷改變甚至癌變，其HBxAb水平明顯降低，而在肝癌患者的體內(nèi)其水平處于最低。在不同嚴(yán)重程度患者中，隨著患者的病理分期及組織分化能力升高，其HBxAb呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。有研究證實(shí)，隨著肝癌的不斷進(jìn)展，患者機(jī)體的免疫功能呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)[10]。隨著免疫功能的下降，腫瘤細(xì)胞對(duì)于機(jī)體的免疫細(xì)胞的逃逸能力明顯提高，可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[11]。段正軍等[12]在對(duì)肝癌患者的HBxAb水平的分析中發(fā)現(xiàn)，隨著疾病進(jìn)展，患者的HBxAb水平明顯下降，與本研究結(jié)果相互印證。

在HBV的不斷感染下，機(jī)體的肝臟細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的肝纖維化甚至肝硬化，病毒的持續(xù)性復(fù)制是造成肝細(xì)胞功能改變的重要原因。在HBV的生命周期中，cccDNA的反轉(zhuǎn)錄是形成RNA的重要途徑。而在對(duì)cccDNA水平的檢測(cè)時(shí)，需要對(duì)患者進(jìn)行肝穿刺活檢，由于該檢測(cè)方法的有創(chuàng)性，使其無(wú)法在臨床中被廣泛推廣。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HBV-pgRNA與cccDNA水平具有明顯的相關(guān)性[4]。通過(guò)對(duì)患者HBV-pgRNA水平的檢測(cè)，可有效對(duì)cccDNA水平進(jìn)行評(píng)估。在本研究中，隨著患者疾病的進(jìn)展，患者的HBV-pgRNA水平明顯下降，分析認(rèn)為，在疾病進(jìn)展過(guò)程中，病毒的復(fù)制活性明顯下降，血清乙型肝炎的表面抗原活性明顯下降，分析原因可能是由于HBV對(duì)機(jī)體的明顯性刺激作用，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，進(jìn)而清除表面抗原水平，而在此過(guò)程中，均會(huì)造成肝細(xì)胞的損傷，甚至癌變。潘美晨等[13]在對(duì)肝癌患者HBV-pgRNA水平分析中發(fā)現(xiàn)，隨著患者肝細(xì)胞的癌變，其HBV-pgRNA水平明顯下降，與本研究結(jié)果相互印證。

甲胎蛋白是臨床肝癌診斷的重要標(biāo)志物，有研究報(bào)道顯示，甲胎蛋白水平的異常改變并不能作為肝癌患者診斷的依據(jù)，甲胎蛋白水平的異常改變與胃癌、肺癌及胰腺癌明顯相關(guān)[14]。同時(shí)，在15%～58%的慢性乙型肝炎患者及11%～47%的肝硬化患者中均發(fā)現(xiàn)AFP水平異常升高，提示在臨床治療中，AFP對(duì)于肝癌的診斷缺乏特異性。AFP-L3在肝癌細(xì)胞中特異性分泌，隨著機(jī)體癌癥的不斷進(jìn)展，患者的AFP-L3水平明顯升高。豐先明[15]對(duì)肝癌患者的AFP-L3水平進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著患者的疾病進(jìn)展，AFP-L3水平明顯升高，與本研究結(jié)果相互印證。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于希望在減少對(duì)患者損傷的前提下，提升患者的診斷能力。

綜上所述，血清HBV-pgRNA、AFP-L3和HBxAb水平與HBV所致肝癌進(jìn)展明顯相關(guān)，同時(shí)，以上指標(biāo)可作為患者生存預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)。