基于SSR分子標記的13個白三葉(Trifolium repens L.)品種指紋圖譜構建

馬驄毓， 韓重陽， 馬賽男， 李旭旭， 蔡家邦， 汪 陽， 張新全， 聶 剛

(四川農業大學草業科技學院， 四川 成都 611130)

白三葉(TrifoliumrepensL.)是一種優質的多年生豆科植物，在全世界溫帶地區廣泛分布，因其具有較高的營養價值且適應范圍廣，再生能力強，不僅被用作優質牧草[1]，還可廣泛應用于水土保持和城市綠化，具有良好的生態價值和經濟價值[2]，在我國西南地區被廣泛栽培利用。目前，生產上大量應用的品種主要為1988年審定的‘胡依阿’白三葉及2002年審定的‘海法’白三葉[3-5]。全國審定白三葉品種僅6個，遠不能滿足生產需求，因此，生產上引入大量適應性強、表現突出的國外白三葉品種用于栽培飼草、草地建植和植被恢復等。

隨著現代分子技術的快速發展，DNA分子標記技術已經成為植物新品種鑒定的重要手段[6]。簡單重復序列(Simple sequence repeats，SSR)分子標記技術是一類建立在PCR反應基礎上的一種遺傳標記，具有操作簡便、多態性高、準確性高等優點[7]。基于SSR分子標記技術的DNA指紋圖譜可有效的鑒定白三葉品種，為品種知識產權保護提供科學依據。雖然SSR分子標記技術已廣泛應用于多花黑麥草(LoliummultiflorumL.)[8]、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[9]、鴨茅(DactylisglomerataL.)[10]、早熟禾(PoaannuaL.)[11]等草類植物的品種DNA指紋圖譜的構建及鑒定中，但針對白三葉品種鑒定及DNA指紋圖譜構建方面研究鮮有報道。目前，白三葉SSR分子標記技術研究多集中在遺傳多樣性分析方面，張鶴山等[12]利用SSR分析從國內外收集的49份白三葉種質資源的遺傳多樣性，認為白三葉種質間差異較大，具有豐富的遺傳多樣性。李莉等[13]利用SSR標記對貴州野生22份白三葉種質資源進行了系統分析，揭示了貴州地方品種間的親緣關系。

本研究利用SSR分子標記技術分析國外不同來源的13個白三葉品種間的遺傳多樣性，同時構建DNA指紋圖譜，為白三葉育種材料的選擇及品種的快速鑒定提供了理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗白三葉品種的收集

本研究使用的13個白三葉(TrifoliumrepensL.)品種見表1，采集的13個白三葉參試品種均種植于四川農業大學崇州基地(30°32′N，103°39′E，海拔508 m)。

表1 13份不同白三葉品種來源信息

1.2 DNA提取

隨機取樣于四川農業大學現代農業研發基地。從30株單株中隨機采集30片新鮮幼葉，每10片鮮葉混合構建一個獨立的混樣池(Bulk)，每個品種3個混樣池(Bulk)作為3次重復[14-15]。采用安全型植物DNA小提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司，Magen?,Guangzhou,China)直接提取白三葉基因組DNA。測定DNA濃度和質量后，將DNA稀釋至20 ng·μL-1，并置于4℃保存。

1.3 引物設計及PCR擴增

試驗引物篩選自Griffiths等[16]報道的白三葉遺傳連鎖圖譜，通過對染色體不同片段位置上的引物進行均勻選擇，將所選的264對SSR引物進行初篩，基于“多態性高、特異性強、條帶清晰穩定”的原則，共篩選出20對引物(表2)來擴增白三葉SSR片段。PCR擴增的總體積為20 μL，其中含有2 μL(20 ng·μL-1)的參試品種DNA，10.5 μL的2×Taq PCR MasterMix II(天根?，北京，中國)，1.4 μl(10 pmol·μL-1)正向和反向引物混合物，以及6.1 μL ddH2O。PCR擴增使用熱循環參數，程序如下:94℃預變性5 min；然后94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃鏈延伸40 s，35個循環；最后72℃鏈延伸5 min，4℃保存。

表2 SSR引物信息

擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進行檢測。在0.1%的AgNO3溶液中銀染15 min后在NaOH溶液中顯色。將凝膠置于燈光下，用數碼照相機拍照保存以供后期分析使用[17]。

1.4 數據統計與處理

對擴增產物電泳結果圖中的明亮條帶或清晰弱帶進行統計得到基礎數據。以“1”和“0”兩種數字表示條帶的分布情況。“1”代表有條帶的位置，“0”代表無條帶的位置，建立原始標準0/1矩陣。計算多態性條帶比率(Percentage of polymorphic bands，PPB)和引物多態性信息含量(Polymorphism information content，PIC)，PICi=2fi×(1—fi)(fi表示第i個基因的頻率)。利用GenAIEx 6.4分析計算品種內部和品種之間的變異分布，使用NTSYS-PC 2.10e和MEGA 6軟件進行聚類分析和主成分分析。根據擴增結果，利用Chemilmager 4400軟件估算每個擴增片段的分子量大小。根據所選SSR引物制作DNA指紋圖譜，對擴增樣品中出現至少兩次的條帶進行計數，即每個品種出現至少2次相同分子量的條帶，然后利用Excel 2010軟件對波段統計數據進行轉換，構建13個白三葉草品種的DNA指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 白三葉草品種遺傳分異分析

試驗引物篩選自Griffiths等[16]報道的白三葉遺傳連鎖圖譜，通過對染色體不同片段位置上的引物進行均勻選擇，將所選的264對SSR引物進行初篩，基于“多態性高、特異性強、條帶清晰穩定”的原則，共篩選出20對引物。3組供試品種混合樣本擴增，只分析至少出現兩次的清晰可辨條帶(圖1)。結果表明，13個白三葉品種在20對引物中共檢測出了115條清晰可見的條帶，其中11個條帶無多態性，104條帶具有多態性(占90.4%)(表3)。此外，每對引物的多態性條帶(PPB)的百分比在50%～100%之間，擴增片段的長度在100～250 bp之間。在20對引物中，gtrs167擴增條帶最多，擴增總條帶數達9條，引物gtrs171多態性信息含量最低，為0.198；引物gtrs949的PIC最高為0.455。本試驗所使用的20對引物中平均每對引物擴增出5.75個條帶，多態性條帶5.2條。所有引物的PIC范圍為0.198～0.455，每個SSR位點的PIC均值為0.333。

圖1 引物gtrs540在13個白三葉品種的擴增

表3 SSR引物在白三葉品種上的擴增結果

AMOVA結果顯示(表4)，通過SSR分子標記獲得的總差異的49%存在于白三葉品種間，51%存在于白三葉品種內。品種之間有極顯著差異(P<0.01)，具有統計學意義。

表4 基于SSR原始數據的白三葉品種的分子方差分析

2.2 13份白三葉品種的聚類分析

基于遺傳相似性系數和遺傳距離矩陣，使用NTSYS-pc 2.10e和MEGA 6對13個白三葉品種進行聚類分析(圖2)。結果表明，其品種內遺傳相似性系數的平均變異范圍為0.686～0.959，品種間遺傳相似性系數的平均變異范圍0.556～0.739。13個白三葉品種間，‘超級海法’和‘海法’的遺傳相似性系數(GS)最大，說明它們的親緣關系最近。‘米莉格’和‘克朗德’的遺傳相似性系數(GS)最小，即遺傳距離最遠，親緣關系也較遠。白三葉品種‘超級海法’的一枝中混合了‘海法’的一個樣品，可能由于‘超級海法’在選育過程中是基于‘海法’白三葉為親本選育，故具有較近的親緣關系。‘艾麗絲’和‘超級胡依阿’各僅有一小枝也被劃分到同一枝上，其余品種都可以較好的聚在一起。

圖2 SSR標記對13份白三葉品種的聚類分析

2.3 13份白三葉品種的主成分分析

為更直觀的了解13個白三葉品種之間的親緣關系，采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)進行進一步的評價(圖3)。其中第一主成分的貢獻率為17.4%，白三葉品種‘克朗德’分布于PC1坐標軸的左側，‘西維特’和‘米莉格’分布于PC1坐標軸的右側。第二主成分的貢獻率為13.8%，‘克朗德’、‘胡依阿’和‘西維特’被劃分在PC2坐標軸的上方，‘米莉格’被劃分在PC2坐標軸的下方。其余9個白三葉品種主要分布于坐標軸原點附近。主成分分析結果與遺傳聚類圖的表現基本一致。

圖3 13個白三葉品種的主成分分析

2.4 13個白三葉品種指紋圖譜的構建

以篩選出的多態性引物擴增出的電泳圖為基礎，選擇6對具有代表性的引物gtrs1164，gtrs573，gtrs541，gtrs171，gtrs536和gtrs173構建DNA指紋圖譜。如圖4所示，gtrs573的178 bp，gtrs171的190 bp，gtrs541的205 bp，gtrs541的170 bp和gtrs536的265 bp可以直接將‘克朗德’、‘游俠’、‘超級胡依阿’、‘麥克’和‘歐米克’分別區別出來。在gtrs171的170 bp處僅有‘歐米克’和‘米莉格’出現了多態性條帶，而‘米莉格’在gtrs573的237 bp處沒有多態性條帶，因此可以將這兩個白三葉品種區分開來。通過此種方法還可以在gtrs536的153 bp和gtrs171的135 bp將‘胡依阿’區分出來。在gtrs573的155 bp僅有‘艾麗絲’和‘羅特’沒有多態性條帶，而gtrs536的214 bp處‘羅特’出現了多態性條帶，因此這兩對引物還可以將‘艾麗絲’和‘羅特’區別開來。同理，在gtrs536的214 bp和gtrs541的182 bp，gtrs573的178 bp和gtrs541的163 bp，gtrs1164的210 bp和180 bp，gtrs173的170 bp和gtrs541的255 bp可以將‘超級海法’、‘金寶’、‘海法’、‘西維特’分別鑒別出來。結果表明，6種引物可以區別13份白三葉品種，通過這6對引物所構建的DNA指紋圖譜具有較強的鑒定、區別這13個白三葉品種的能力。因此，本試驗所選擇的引物具有較強的品種鑒別能力。

圖4 基于部分多態性引物擴增的13份白三葉品種的DNA指紋圖譜

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，可為植物育種提供重要信息，能夠反映物種的遺傳背景以及利用價值，甚至能夠保護和發掘優良種質[18]。SSR分子標記能夠反映被標記生物的DNA，已被廣泛應用在品種[19]及純度鑒定[20]和遺傳多樣性分析[21]。本試驗利用SSR研究13個引進白三葉品種種質資源的多樣性，結果表明，SSR分子標記在13個白三葉品種中具有較高多態性，試驗所用20對SSR引物共檢測到13個品種的104條多態性條帶，多態性比率(PPB)達90.4%，高于李莉等[22]利用SSR標記分析花序一致的貴州野生白三葉品種研究中的PPB(85.99%)，且黃婷等[23]利用SSR標記進行多花黑麥草的品種鑒定研究中的PPB(88.81%)也低于本研究。試驗引物篩選自Griffiths等[16]報道的白三葉遺傳連鎖圖譜，通過對染色體不同片段位置上的引物進行均勻選擇，將所選的264對SSR引物進行初篩，基于“多態性高、特異性強、條帶清晰穩定”的原則，共篩選出20對引物。

本試驗研究的對象白三葉是一種典型的依靠蜜蜂等蟲媒傳粉的異花授粉植物，易產生遠距離間基因的交流。因此，要進行種質資源收集時，應先制定有效的取樣策略[24]。為了準確地評價遺傳多樣性和進行品種鑒定，選擇最佳的樣本量是實現品種擴容的必要條件。在群體內取樣單株數量方面，Sjogren和Wyoni[25]提出了一個針對有限群體的假設模型，認為若要檢測到頻率為5%的稀有等位基因，群體內的樣本量至少要達到30個單株。陳堅等[26]利用SSR分子標記技術對異花授粉植物紫云英進行分析時，闡述群體內的樣品取樣量以30單株為宜，即可達到較佳鑒別效果又降低分析成本。針對品種內部的取樣重復數量，K?lliker等[15]將所取的白三葉單株進行分塊，每個樣本被劃分成3個獨立的混樣池(Bulk)，此種方法可有效的利用AFLP技術對白三葉遺傳多樣性進行分析。同樣，Ma等[27]也使用了此種分塊方法利用SSR分子標記技術對10份白三葉品種進行品種鑒定。鑒于以上研究，本試驗采用每個品種30個單株構建了3個獨立的混樣池(Bulk)對13個白三葉品種進行鑒定，研究結果表明，此種取樣策略可以有效區分白三葉草品種。這與前人的研究結果一致。

在自然異花授粉植物居群中，品種間的變異幅度小于品種內部的變異[23]。白三葉作為異花授粉植物，具有較大的群體內差異，且各育種材料間的頻繁交流使得品種間存在較小的變異程度[28]。然而，本試驗中，品種內與品種間的變異幅度差異不大，主要原因可能是這13個白三葉品種絕大部分為國外育成新品種，且來源地廣、地理區隔比較大，使得品種純度較高，品種間差異增大，內部差異減小。從分子水平上說，遺傳相似系數越小，變幅越大，則表明該物種的遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景也就越復雜[29]。本研究13個白三葉品種間的遺傳相似系數(GS)分布在0.556～0.739，最大的遺傳相似系數出現在白三葉品種‘海法’和‘超級海法’之間。這可能是由于‘超級海法’在選育過程中是基于‘海法’白三葉為親本選育，故兩者具有較近的親緣關系。而最小的遺傳相似系數出現在‘米莉格’和‘克朗德’之間，表明盡管兩個品種均來自丹麥地區，但可能由于引種過程中環境差異的影響導致了兩個品種之間遺傳距離較大，出現因環境變化產生的基因突變，同時也表明引進品種中存在較高的遺傳多樣性，具有較高的利用價值[30]。

品種或種質資源的特異性是新品種保護的技術基礎和授權的科學依據[31]。利用分子標記技術構建品種指紋圖譜，可以快速準確的進行品種(系)的鑒定，同時具有很強的個體特異性，為作物育種和種子管理工作提供了極大的便利[32]。SSR分子標記技術作為比較理想的分子標記技術之一[33]，已被廣泛應用于高羊茅(FestucaarundinaceaS.)[34]、多花黑麥草[35]、紅三葉(TrifoliumpratenseL.)[36]等多個物種的品種鑒定。本研究先篩選出具有較高多態性的均勻分布在白三葉染色體上的SSR引物，再經過人工篩選20對多態性較好的SSR引物構建DNA指紋圖譜，對13份白三葉品種進行遺傳多樣性分析。根據已構建DNA指紋圖譜分析，13份白三葉品種均可通過SSR引物進行品種鑒定。遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜的構建對白三葉種質創新、品種選育及鑒定均具有積極的作用，也可為新品種知識產權保護與有效利用提供保障。就本研究而言，隨著白三葉國外品種的不斷引進且篩選的引物數量有限，特征條帶也可能在其它品種中出現，因此目前的引物組合在一定的材料范圍內適用。

4 結論

本研究利用SSR分子標記技術對國外引進13個白三葉品種進行聚類分析并篩選利用6種具有代表性的引物構建DNA指紋圖譜。本研究探討了13份白三葉品種之間的親緣關系，同時也使用所構建的DNA指紋譜圖將白三葉品種清晰、有效的鑒別出來。研究表明，DNA指紋圖譜的構建對鑒定和區分白三葉新品種具有重要意義。