鹽堿脅迫對鹽地堿蓬生長、有機酸等溶質積累及其生理功能的影響

麻 瑩， 張洪嘉， 庫都斯·阿布都沙拉木， 耿淑娟， 薛傲然， 趙翰韋， 菅柏涵

(1.吉林大學植物科學學院， 吉林 長春 130062； 2.六盤水市第三中學， 貴州 六盤水 553000)

土壤鹽堿化已成為限制我國畜牧業生產的最大障礙因素[1]。土壤鹽堿化既有中性鹽又有堿性鹽，而植物所面對的脅迫既有鹽脅迫又有堿脅迫，鹽脅迫和堿脅迫是2種不同性質的脅迫；二者的脅迫作用機理及植物對其生理響應也不同[1]。鹽脅迫主要有滲透脅迫和離子脅迫；而堿脅迫除上述脅迫外，還涉及高pH脅迫[1]。高pH直接干擾Na+、K+選擇性吸收，抑制陰離子吸收，打破植物體內已經形成的離子穩衡態、電荷平衡、pH穩定[2]。可見，堿脅迫對植物的破壞力更為嚴重[2]。

一直以來，植物抗鹽生理多集中在以中性鹽NaCl為主的研究[3-6]。近年來，雖然有一些有關植物對鹽堿脅迫的生理響應[1-2]、種子萌發[7]，抗堿性與有機酸代謝[1]，堿脅迫下的基因表達[8]等研究報道，但所涉及植物鹽堿脅迫的研究都集中于對植株整體或是植物器官的研究，而以堿蓬根或葉細胞液為切入點，探討其溶質響應鹽、堿脅迫的特點并對其溶質進行功能分析的研究卻鮮見報道。許多東北堿化草原土壤pH值已高達10以上，雖然堿化土壤不利于植物生長，但是有一些抗堿性極強的植物能夠生存[9]，如鹽地堿蓬(Suaedasalsa(L.) Pall.)就是珍貴的天然高抗堿牧草，它是研究植物抗鹽堿機制的理想材料。

本文分別用中性鹽(NaCl，Na2SO4)和堿性鹽(NaHCO3，Na2CO3)模擬鹽脅迫或堿脅迫條件，并以此對堿蓬幼苗進行脅迫處理。通過比較根系、葉片細胞液的有機酸等溶質應答鹽堿脅迫的變化，進一步探討體內溶質的積累及其功能特點，為探明堿蓬適應鹽堿生境特殊的生理機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料培養

在中國吉林省西部天然草原采集堿蓬(S.salsa)種子，采用砂培法培養[1]，具體方法為：種子播種于洗凈細砂的塑料花盆中(高度14 cm，直徑17 cm)，每盆10 孔穴，每孔播種4粒種子，出苗后間苗2次，最終每孔保留1株幼苗，即每盆10 株幼苗。幼苗每天晚5∶00—6∶00用 500 ml營養液(Hoagland)透灌。整個試驗在室外進行，處理期間人工遮雨。

1.2 試驗設計

將2種中性鹽NaCl和Na2SO4混合(1∶1的摩爾比)作為鹽脅迫(A組)，將2種堿性鹽NaHCO3和Na2CO3混合(同上)為堿脅迫(B組)。A,B組處理液均用Hoagland作為溶劑配制，鹽濃度均為100 mmol·L-1；以Hoagland溶液作為對照組(CK)。鹽脅迫(A)、堿脅迫(B)和對照組(CK)溶液的pH值分別是6.55，9.90，6.67；其中堿脅迫的pH值與典型的堿蓬生境的pH值相近[9]。

苗齡6周后，選取12 盆長勢一致的幼苗，隨機分成3組，每組4盆為4次生物學重復，其中1組為對照組，其余2組為鹽、堿脅迫組。鹽脅迫或堿脅迫每天分別用100 mmol·L-1鹽或堿處理液澆灌1次(晚5∶00—6∶00)；對照組只澆Hoagland營養液。脅迫處理7 d。

1.3 取樣、植物細胞液的收集

處理7 d后，隨機選取5株植株在子葉節處分成地上部(Shoot)和根部(Root)2部分，依次用自來水、蒸餾水沖洗干凈，吸干表面水分。分別稱取莖葉和根鮮重(FW)，然后將其真空冷凍干燥，凍干，分別稱取干重(DW)，計算植株含水量(WC)及其生物量。另外5株植株分別用蒸餾水清洗1次，去離子水清洗2次，用濾紙將其表面多余水分吸干。將植株的全部葉片和根部剪下，采用離心法[10](2 500 g離心15 min，4℃)去除根、葉質外體汁液后再去除其老根和葉的主脈，將植物材料分別裝入封口袋，排凈空氣后在-20℃冷凍24 h，在干燥器中解凍，分別用注射器收集根和葉的細胞汁液[11]，其汁液用于各種溶質含量的測定。

1.4 生長、生理指標測定

生物量為每株植物干重(g)。含水量(WC)= (鮮重-干重)/鮮重×100%[12]。用離子色譜法測定無機陰離子、草酸(DX-300離子色譜系統，CDM-II電導檢測器，AS4A-SC離子交換色譜柱，流動相為Na2CO3/NaHCO3=1.7/1.8 mmol·L-1)和其他有機酸含量(DX-300離子色譜系統，AMMS-ICE II消聲器，ICE-AS6離子排斥柱，流動相為0.4 mmol·L-1全氟丁酸)[13]。以上色譜試驗均在室溫25℃進行。

K+和Na+含量用火焰光度計測定[12]。可溶性糖和脯氨酸含量分別采用蒽酮顯色法和茚三酮比色法測定[1]。之前壓榨擠出的根、葉的汁液(細胞液)用數字酸度計測定pH值(圖5)，根據其pH值用Geochem軟件計算各離子的游離電荷數量(meq·L-1組織水)，分別計算各種游離態離子所貢獻的正電荷或負電荷數量占總正或負電荷的百分比，即表示各種離子對離子平衡的貢獻率。

陽(陰)離子的電荷貢獻率計算公式：

陽(陰)離子的電荷貢獻率(%)=游離態陽(陰)離子所貢獻的正(負)電荷/各種游離陽(陰)離子的正(負)電荷的總和×100%。

溶質滲透勢計算公式：

ΨS=-nRT/V，其中n表示溶質摩爾濃度，R和T為常數。因此，本試驗用某一溶質的摩爾濃度(mmol·L-1組織水)占各種溶質摩爾濃度的總和的百分比，表示此溶質對滲透調節貢獻率[13]。

1.5 數據處理及統計學分析

數據整理和作圖采用Excel 2010；SPSS20.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析，檢驗水平為0.05；多重比較采用LSD法，數據用平均值±標準誤(±SE)表示。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫對堿蓬幼苗生長的影響

由圖1A可知，鹽脅迫下堿蓬生物量有所降低，但未達到顯著水平，而堿脅迫下其生物量顯著下降(P<0.05)。由圖1B所示，對照(CK)堿蓬植株含水量達到90%以上，鹽脅迫對堿蓬含水量影響不顯著，在堿脅迫下其含水量有所降低，但仍保持較高的含水量(88.26%)。

圖1 鹽、堿脅迫對堿蓬生物量和含水量的影響

2.2 堿蓬根、葉的陽離子對鹽堿脅迫的響應

鹽、堿脅迫均會引起葉片、根部細胞液Na+含量的顯著增加(P<0.05)，其中鹽脅迫下葉片Na+含量極顯著增加(P<0.01)(圖2A)。

根部細胞液的K+含量在堿脅迫下略有下降；在鹽脅迫下，葉片細胞液K+含量顯著低于對照和堿脅迫組(P<0.01)(圖2B)。

由圖2C可見，與對照相比，根部細胞液的Na+/K+在鹽、堿脅迫下比值顯著升高(P<0.05)，而鹽、堿脅迫對其作用差別不大。葉片細胞液Na+/K+在鹽、堿脅迫下也顯著升高(P<0.05)，而堿脅迫下其比值低于鹽脅迫。

圖2 鹽、堿脅迫對堿蓬根和葉片中陽離子的影響

2.3 堿蓬根、葉的陰離子對鹽堿脅迫的響應

圖3 鹽、堿脅迫對堿蓬根和葉片中陰離子的影響

2.4 堿蓬根、葉的有機溶質對鹽堿脅迫的響應

由圖4所示，葉片脯氨酸、可溶性糖、有機酸等有機溶質明顯高于根部其含量，而且根部的有機溶質含量在鹽、堿脅迫作用下，其含量幾乎不積累。在葉片中脯氨酸、可溶性糖、有機酸等有機溶質含量在鹽、堿脅迫下均顯著增加(P<0.01)。但從葉片的最大積累量上看，脯氨酸積累量最少，有機酸最多(其最大積累量是脯氨酸的157.06倍)。

圖4 鹽、堿脅迫對堿蓬根和葉片中有機溶質的影響

2.5 鹽、堿脅迫對根和葉片組織液pH的影響

由圖5可知，鹽堿脅迫下堿蓬根、葉片的細胞汁液pH都在正常生理pH范圍內(pH<7)，鹽堿脅迫下堿蓬根部的細胞汁液pH的變化顯著(P<0.05)，而其葉片細胞汁液pH差異并不顯著。

圖5 鹽、堿脅迫下堿蓬根和葉片的細胞汁液pH值

2.6 各種溶質對滲透調節的貢獻

由表1可知，對照K+在根和葉片的滲透調節占據主導地位。鹽、堿脅迫后Na+對滲透調節的貢獻率有所升高，但是K+的貢獻依然較高(僅次于Na+)；與鹽脅迫相比，堿脅迫下葉片的K+的貢獻率提高，而Na+的比例下降。根和葉片的有機酸對總有機溶質的貢獻占據絕對優勢(84.76%～97.25%)，鹽、堿脅迫，特別是堿脅迫下有機酸的貢獻率達到最大(表1)，而脯氨酸對滲透調節的貢獻甚微(不足0.20%)。

表1 鹽堿脅迫下堿蓬根、葉細胞液中各溶質對滲透調節貢獻率

2.7 陽(陰)離子對總正(負)電荷的貢獻

對照植株根和葉片中K+對正電荷的貢獻率最大；鹽堿脅迫后，K+對正電荷的貢獻率降低，Na+達到最大(表2)，堿蓬根和葉片在堿脅迫下K+貢獻率均高于鹽脅迫，特別是葉片在堿脅迫下K+貢獻率(47.83%)高于鹽脅迫下(29.22%)。

表2 鹽、堿脅迫下堿蓬根、葉中各種游離態離子對總正(負)電荷的貢獻率

3 討論與結論

3.1 鹽堿脅迫對堿蓬生長的影響

生物量降低是植物生長受到抑制的直接表現。本研究中，堿蓬只在堿脅迫下其生物量才顯著下降。可見，鹽脅迫對堿蓬生長影響不大，而只有高pH的堿脅迫才抑制其生長。說明堿蓬具有較強的抗鹽能力，同時也證實堿脅迫對植物具有更大的破壞性[14-15]。

植物通過降低含水量來降低細胞滲透勢是既迅速又經濟的方式[14]。鹽脅迫對堿蓬含水量影響不大，堿脅迫下其含水量下降，但仍保持較高水平(88.26%)。堿蓬作為稀鹽植物，其植株高度的肉質化可以最大限度地稀釋液泡中有害離子(Na+，Cl-)的濃度[16]。這也許是決定堿蓬抗鹽堿的關鍵生理特性之一。

3.2 鹽堿脅迫對堿蓬體內離子積累的影響

鹽堿脅迫下，Na+毒害是影響植物生長的主要原因之一。Na+區域化到液泡是減少細胞質中過多Na+的有效方法之一[17]。Na+區域化主要依靠液泡膜Na+/H+逆向蛋白(Na+/H+antiporter protein,NHX)實現[18]。本試驗鹽、堿脅迫引起堿蓬葉片和根部細胞液Na+激增，特別是鹽脅迫的葉片Na+含量達到最大值(其含量是對照的4.55倍)，而此時葉片的高濃度Na+并沒有影響堿蓬植株的生長。可以推測堿蓬細胞內可能存在著高效的NHX將Na+區域化到液泡，而其具體的轉運機制還需進一步探究。此外，堿蓬作為真鹽生植物，其肉質化的葉片具有稀鹽作用。根從鹽堿土壤吸收的Na+等離子輸送至葉片，并將離子區域化于肉質葉片的大液泡中，其較高含水量具有稀釋離子濃度的作用，以此保護胞質內酶類等活性物質免受毒害，保證了植株的正常生理代謝。

植物體內維持較低Na+/K+對其抵抗脅迫至關重要[19]。堿脅迫下葉片依然保持低Na+高K+，其Na+/K+比值低于鹽脅迫，而且低于根部比值。這可能是在堿脅迫下，堿蓬葉片具有更好的Na+/K+穩態調控能力。

3.3 有機酸等溶質的滲透調節、離子平衡作用

植物保持低Na+高K+是維持滲透調節的主要機制[20]。雖然鹽、堿脅迫Na+對滲透調節的貢獻變化大，但是K+的貢獻依然保持較高水平(僅次于Na+)，堿脅迫下葉片K+對滲透調節的貢獻提高，Na+的貢獻下降。可見，堿蓬對Na+和K+的吸收機制是獨特的[21]，這可能與其具有較強的抗鹽堿能力有關。

脯氨酸對滲透調節的貢獻很小，這與堿地膚(Kochiasieversiana)的情況一致[13]。而與鹽柳(Salixpsammophila)[22]、酸棗(Ziziphusjujubavar.spionsa)[23]等植物的報道不同，堿蓬體內脯氨酸不是對滲透脅迫的簡單反應，它可能是由于鹽堿脅迫對其代謝的干擾或是其起到保護響應的作用[20]。

鹽、堿脅迫下根和葉片的有機酸貢獻提高(僅次于Na+,K+)，特別是高pH的堿脅迫下葉片其貢獻率增加幅度更大。可見，有機酸的代謝與pH密切相關。考慮到有機酸在細胞中的定位(存在液泡中)，可以認為，鹽、堿脅迫下有機酸為根、葉片液泡中主要的有機滲透調節物。而多數雙子葉鹽生植物主要吸收Na+，Cl-等無機離子進行滲透調節[13,24]，這可能是因為堿脅迫(高pH)對無機陰離子的吸收有抑制作用[3]，堿蓬不得已選擇更為耗能的合成有機酸的方式進行滲透調節，同時以調節細胞內pH。