匍匐翦股穎葉肉細胞原生質體瞬時表達體系的建立

李 鑫， 高佩然， 邊秀舉， 王麗宏， 李會彬， 劉 暢， 董康挺， 孫鑫博

(河北農業大學農學院/河北省作物生長調控重點實驗室， 河北 保定 071000)

植物原生質體是指細胞壁以內的原生質部分，即細胞通過質壁分離后，去除細胞壁的由質膜包被的裸露細胞，具有細胞全能性，其廣泛應用于植株再生[1]、體細胞雜交[2]、基因功能研究[3]、植物生化過程研究[4]等。自1960年Cocking等[5]首次利用纖維粗制酶，從番茄(Solanumlycopersicum)根尖分離出原生質體以來，現已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]和煙草(NicotianatabacumL.)[7]中建立了原生質體分離系統。馬暉玲等[8]在草地早熟禾(PoapratensisL.)‘午夜Ⅱ號’中建立了原生質體分離和培養體系，并再生出完整植株；李妮娜[9]在陸地棉(GossypiumhirsutumLinn.)中建立了原生質體分離體系，并以此為受體獲得了能夠有效表達融合蛋白的原生質體瞬時表達系統。然而在匍匐翦股穎中并未有成功分離原生質體的報道，因此高效遺傳轉化技術的開發可為后期匍匐翦股穎的基因功能研究提供基礎。

瞬時表達是近年來發展的一種快速的、高效的檢測蛋白質表達的方法，逐漸應用到生物學各研究領域中[10]。同時，原生質體作為一種理想的單細胞系統，因沒有細胞壁的限制，成為構建植物瞬時表達體系的良好試驗材料[11]。在植物原生質體中進行瞬時表達時間短、重復性好、轉化效率高，被廣泛應用到基因克隆與分析、啟動子活性、亞細胞定位、蛋白質互作分析等方面[10]。尹啟琳[12]通過瞬時表達系統，構建了小麥(TriticumaestivumL.)‘濟麥22號’TaCKX1基因靶向編輯載體，并通過測序檢測了相關基因突變。Zhang等[13]利用瞬時表達系統，在水稻(OryzasativaL.)原生質體中進行了蛋白質免疫印跡分析、亞細胞定位、雙分子熒光互補試驗，并通過相關轉錄因子的上調研究光反應過程。對于匍匐翦股穎高效遺傳轉化體系的研究缺乏，因此建立其瞬時表達體系將有利于基礎功能研究的發展。

匍匐翦股穎是一種常見的冷季型草坪草，它屬于禾本科翦股穎屬多年生草本[14]。匍匐翦股穎原產于歐亞大陸，在我國華北、東北、西北均有分布，其葉片質地良好、匍匐莖發達，低矮致密的葉片結構能夠形成觀賞性較強的草坪，以及良好的耐低修剪、耐寒性、耐陰性、耐踐踏性等特性[15]。此外，匍匐翦股穎耐鹽性極強，對重金屬也有良好的吸收作用，因此，也可以作為鹽堿地修復、礦山恢復的生態草種[16]。但由于匍匐翦股穎是一種異源多倍體植物，其種子生產困難，并具有自交不親和性的遺傳特性，很難通過傳統育種方法來進行遺傳改良。因此，通過基因工程手段進行匍匐翦股穎的遺傳改良已成為研究的熱點。目前，匍匐翦股穎轉基因技術較為成熟[17]，然其瞬時表達體系研究較為滯后，嚴重制約了匍匐翦股穎在分子生物學領域的發展。

本試驗以匍匐翦股穎‘Penn-A4’為研究對象，探討各因素對原生質體制備的影響，旨在為今后匍匐翦股穎體細胞雜交、遺傳轉化、產業育種等研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取匍匐翦股穎‘Penn-A4’的無菌苗葉片為材料，進行葉肉原生質體的分離。

無菌苗的培養：將種子放入滅菌過的50 ml離心管中，加入消毒劑(成分：次氯酸鈉漂白劑20%，無菌水80%)，將離心管在150 r·min-1的搖床上室溫搖晃30 min。在超凈工作臺中倒掉消毒劑，用無菌水沖洗種子5遍直至洗凈，將種子放在干凈濾紙上吹干，然后用鑷子均勻鋪在滅過菌的MS培養基上，封好瓶口，溫度25 ℃、濕度40%、光周期為12 h光照/12 h黑暗、無菌條件下培養。

1.2 試驗試劑

酶解液：1.5%的纖維素酶、0.5%的果膠酶、0.6 mol·L-1甘露醇，10 mmol·L-1MES，4 mmol·L-1CaCl2、0.1%的β-巰基乙醇和250 mg·L-1頭孢噻肟。

W5溶液：154 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1CaCl2，5 mmol·L-1KCl和2 mmol·L-1MES。

MMG溶液：0.6 mol·L-1甘露醇、15 mmol·L-1MgCl2和4 mmol·L-1MES。

40% PEG溶液：0.6 mol·L-1甘露醇，100 mmol·L-1CaCl2和40% PEG4000(聚乙二醇4000)。

1.3 試驗設計

設計重復梯度試驗，分別改變植物培養時間、酶液滲透壓、酶解時間中的一個變量，確定匍匐翦股穎葉肉細胞原生質體分離的最佳體系。1)不同的植物培養時間。培養時間2，3，4和6周、酶液甘露醇濃度0.6 mol·L-1、酶解時間4 h；2)不同的酶液滲透壓。常用的滲透壓穩定劑主要有甘露醇、蔗糖、山梨醇等，其中甘露醇在原生質體分離中的應用最為廣泛[18]。培養時間4周、酶解時間4 h、酶液甘露醇濃度0.4，0.5，0.6和0.7 mol·L-1；3)不同的酶解時間。培養時間4周、酶解時間2，3，4和5 h、酶液甘露醇濃度0.6 mol·L-1。

1.4 原生質體提取方法

用全新的、鋒利的刀片將匍匐翦股穎無菌苗的葉片在含0.6 mol·L-1甘露醇浸泡液的無菌培養皿中切割細碎。用鑷子將細碎葉片迅速放入含15 mL酶解液的無菌培養皿中浸沒，放置搖床中28 ℃，40 r·min-1振蕩培養。酶解完成后的材料用濾布(Miracloth)過濾，除去未完全酶解的原生質體和雜質。將濾液在1000 r·min-1條件下離心5 min，去掉上清液收集原生質體。向原生質體加入預冷的15 mL W5溶液，低速(30 rpm)震蕩1 h使其懸浮，用Miracloth過濾，1000 r·min-1離心5 min，棄上清。再次用預冷的W5溶液洗滌原生質體，棄上清，以W5溶液重懸后收集純凈的原生質體。用血球計數板統計匍匐翦股穎原生質體數量，取分離純化后的原生質體懸浮液滴在載玻片上，在光學顯微鏡下觀察原生質體質量及數量，計數中央大方格內原生質體數量，重復計數3次。

原生質體的密度(個·mL-1)=大方格(0.1 mm3，即0.1 μL)的原生質體數×104

1.5 瞬時表達載體的構建

PUC質粒載體中含有35S啟動子和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，能夠在真核細胞中高水平表達，可以被用作亞細胞定位質粒載體。AsHSP26.8基因是一個葉綠體定位的小熱激蛋白，已在水稻原生質體中證實其定位在葉綠體中[19]。根據AsHSP26.8基因序列設計兩端帶有BamHI酶切位點的引物AsHSP26-F:AGGATCCATGGCTGCA-GCGAACGCCCCCTTC;AsHSP26-Loc-PUC-R:GGGATCCACTGGACCTGCACGTCGATGACC，以高溫處理過的野生型匍匐翦股穎cDNA為模板進行擴增(表1)，構建融合蛋白表達載體PUC-AsHSP26.8。

表1 PCR擴增條件

1.6 原生質體的轉化與觀察

將收集好的原生質體重懸浮于MMG溶液中。分別將2 μg GFP空載體和融合蛋白表達載體PUC-AsHSP26.8放入1.5 mL離心管中，加入100 μL Mmg重懸液混勻后，然后加入70 μL的40% PEG溶液，輕輕混勻后室溫放置15 min以完成轉化。隨后用30 mL的W5溶液重新懸浮原生質體溶液，常溫條件下過夜培養，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP綠色熒光蛋白信號。

1.7 數據分析

使用NCBI的BLAST工具進行序列比對和分析；使用Primer 5.0軟件進行引物設計。

2 結果與分析

2.1 匍匐翦股穎葉肉原生質體的分離

以無菌環境中培養了4周的匍匐翦股穎無菌幼苗幼嫩葉片為試驗材料(圖1a)，按本文“1.4”的方法進行操作(圖1b)，收集得到明顯的聚集在一起的原生質體(圖1c)。用光學顯微鏡觀察得到的原生質體，雜質少，體積大，數量多(圖1d)，可進行下一步的遺傳轉化試驗。

圖1 匍匐翦股穎原生質體的分離

2.2 原生質體提取條件優化

2.2.1無菌苗培養時間對原生質體分離的影響 原生質體的提取效率與植物組織類型及植物葉片幼嫩程度有關系，首先需要確定原生質體提取分離效果最佳的無菌苗培養時間。本研究選擇培養時間為2，3，4和6周的無菌苗材料，酶解后分別檢測分離原生質體的產量。原生質體個數隨著培養時間呈現上升后下降的趨勢。培養4周的無菌苗得到原生質體的平均產量均顯著高于其他培養時間(P<0.05)，達到最高值為6.75×106個·g-1(表2；圖2a)。所以最適的材料是培養4周的無菌苗。

2.2.2酶液滲透壓對原生質體分離的影響 酶液滲透壓直接影響到原生質體的質量，分別選取甘露醇濃度為0.4，0.5，0.6和0.7 mol·L-1的不同滲透壓條件下進行原生質體的提取。甘露醇濃度為0.4 mol·L-1時，原生質體平均產量為1.85×106個·g-1，0.5 mol·L-1時為3.90×106個·g-1，0.6 mol·L-1時為6.75×106個·g-1，0.7 mol·L-1時為4.70×106個·g-1。其中濃度為0.4 mol·L-1時原生質體產量最低，0.6 mol·L-1時產量最高，且和其他濃度相比達到差異顯著水平(P<0.05)(表2；圖2b)。所以選擇酶液滲透壓為0.6 mol·L-1甘露醇濃度。

2.2.3酶解時間對原生質體分離的影響 在適宜的酶解液、培養時間和滲透壓的條件下，酶解反應時間也能夠明顯影響提取原生質體的產量和活力。酶解2 h時的原生質體產量最低為4.50×106個·g-1，酶解3 h和5 h時的平均產量相當，無顯著性差異，酶解時間4 h時原生質體產量最高為6.75×106個·g-1，且原生質體破裂數量相較最少(表2；圖2c)。所以選擇4 h為合適的酶解時間。

表2 不同條件下的原生質體產量

圖2 不同條件下的原生質體產量

2.3 亞細胞定位載體構建

從基因組數據庫中下載AsHSP26.8的基因序列，根據序列信息設計引物，以高溫處理過的野生型匍匐翦股穎cDNA為模板，用Taq酶進行擴增，片段長度約為700 bp(圖3a)。將擴增片段連上載體pGEM-T Easy，轉化到DH5α大腸桿菌感受態中，進行菌落PCR驗證和測序，提取正確的pGEM-AsHSP26.8質粒。然后分別對pGEM-AsHSP26.8和PUC載體進行BamHI單酶切。將pGEM-AsHSP26.8單酶切后的小片段(約700 bp)和單酶切后的PUC載體(約5 000 bp)(圖3b)，使用T4連接酶進行連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態，挑取單克隆菌斑，擴大培養并提取PUC-AsHSP26.8質粒，經酶切(圖3c)與測序鑒定，完成PUC-AsHSP26.8重組載體的構建。

圖3 PUC-AsHSP26.8載體的構建

2.4 亞細胞定位分析

分別將AsHSP26.8-GFP和GFP空載體通過PEG介導入制備好的匍匐翦股穎原生質體,室溫條件下培養12 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。在激發光為488 nm條件下，AsHSP26.8-GFP和GFP空載體觀察到了綠色熒光；在激發光為580 nm條件下，觀察到原生質體葉綠體自發熒光呈現紅色熒光(圖4)。GFP空載體的熒光蛋白定位于整個細胞質中，構建的質粒AsHSP26.8-GFP定位于葉綠體上，與AsHSP26.8[19]在水稻的原生質體定位情況一致。上述結果表明，提取的匍匐翦股穎原生質體可用于蛋白亞細胞定位等相關分析。

圖4 AsHSP26.8-GFP和GFP空載體的亞細胞定位

3 討論

匍匐翦股穎作為一種具有眾多優良性狀的觀賞性草坪草，由于其轉基因技術復雜、耗時長、表達水平低使得其在遺傳轉化方面的研究受到了限制，而通過利用原生質體進行瞬時轉化克服了這一障礙。目前，關于分離匍匐翦股穎原生質體和制備瞬時轉化體系的研究未見報道。因此，本研究在擬南芥原生質體制備的基礎上，通過優化原生質體分離條件，首次建立了匍匐翦股穎原生質體分離制備瞬時轉化體系，該體系可以為其它草坪草的瞬時轉化體系的建立提供參考。

目前常用的原生質體分離方法與Yoo等[6]在擬南芥構建的原生質體瞬時表達體系相似，多以葉肉為材料通過纖維素酶和果膠酶酶解分離得到原生質體，并使用離心法純化。植物的各個器官如根、莖、葉、種子及愈傷組織等都能分離出原生質體[20]。目前許多禾本科植物如小麥[12]和柳枝稷(PanicumvirgatumL.)[21]制備原生質體所采用的試驗材料是黃化苗，而匍匐翦股穎幼苗葉片細弱柔軟，且在暗處和遮光培養時，難以得到足夠的試驗材料用于提取原生質體。同樣又選用了土壤中培養的幼苗進行試驗，提取到的匍匐翦股穎原生質體質量也不太理想。此外，與作物相比，匍匐翦股穎無菌苗生長速度相對較慢，植株相對細小，用于提取原生質體時，需要準備較多的試驗材料。在今后的研究中我們將繼續優化試驗體系，期望能夠快速產生無菌苗或者可以用在培養室里培養的小苗甚至是匍匐莖上生長的新的植株作為材料，從而大大提高試驗效率。

由于植物原生質體沒有細胞壁的保護和束縛，容易攝取外源DNA等遺傳物質，原生質體制備會受很多因素影響[20]。獲得植物高質量原生質體，需要優化酶液組合與濃度、酶解時間和酶解滲透壓等幾個關鍵因素[22]。其中最重要的是酶液滲透壓，只有在維持一定的滲透壓才能保證原生質體的產量及活力。本試驗中發現對于匍匐翦股穎來說，最佳滲透壓是0.6 mol·L-1，低于0.6 mol·L-1時原生質體會失水變癟，造成多余碎片，過高導致吸水膨脹而破裂，直接影響原生質體產量。對比匍匐翦股穎與其他植物的原生質體分離體系，發現匍匐翦股穎所需的滲透壓濃度和近緣物種如水稻[13]、柳枝稷[21]是一致的，可能由于親緣關系相近的物種間細胞結構相似所致。酶解時間是另一個獲得高質量原生質體的重要條件，分離原生質體是植物去除細胞壁的過程，所以細胞壁成分和外植體幼嫩程度會極大的影響提取原生質體的酶解時間。酶解時間過短，酶解過程不充分，無法分離出原生質體；酶解時間過長，會破壞已分離出的原生質體，影響獲得的原生質體產量。本試驗過程中選取培養4周的匍匐翦股穎無菌苗葉片，這一時期的葉片細胞幼嫩，細胞壁成分中纖維素含量較少，同時操作過程中將匍匐翦股穎葉片切割足夠細碎，會縮短酶解時間，減少因酶解液過度酶解而造成原生質體破碎的情況。最佳組合下酶解4 h時就能夠獲得最多產量的原生質體，產量能達到6.75×106個·g-1，在一定程度上加快了試驗進程。本試驗得出本研究在獲得的最佳組合條件下進行原生質體制備，獲得的原生質體數量及大小均適用于亞細胞定位的試驗觀察。

4 結論

本研究建立了一套能夠高效獲取匍匐翦股穎原生質體的方法，以培養4周的匍匐翦股穎無菌苗葉片為材料，在甘露醇為0.6 mol·L-1的酶解液中酶解4 h能夠獲得產量為6.75×106個·g-1的原生質體。通過40% PEG-4000介導質粒轉化匍匐翦股穎原生質體，觀察到并證實小熱激蛋白AsHSP26.8清晰定位在葉綠體上。利用該體系，有利于進行匍匐翦股穎基因亞細胞定位及功能研究。