HPLC法測(cè)定消栓通絡(luò)片中3種三七成分的含量

張桂英,許崇德,劉建芳，牛家豐

(1.日照市人民醫(yī)院，山東 日照 276800；2.棗莊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 棗莊 277299)

消栓通絡(luò)片是一個(gè)純中藥制劑，為現(xiàn)行藥典收載藥品，由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七等11味中草藥組成，具有活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)的作用，用于瘀血阻絡(luò)所致的中風(fēng)，癥見神情呆滯、言語謇澀、手足發(fā)涼、肢體疼痛、缺血性中風(fēng)及高脂血癥見上述證候者。現(xiàn)行藥典對(duì)該藥的質(zhì)量控制以薄層層析鑒別為主，主要鑒別了復(fù)方中的三七(3種皂苷)、黃芪(黃芪甲苷)、槐花(蘆丁)的成分，僅利用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)三七中含量最高的人參皂苷Rg1一種成分進(jìn)行了定量檢測(cè)[1-3]。三七(Panaxnotoginseng)為五加科人參屬植物，具有散瘀止血，消腫止痛的功效，常用于抗炎、抗心律失常與抗血栓，活性成分為三七皂苷類化合物[1,4-5]。由于三七為消栓通絡(luò)片中一味用量比較大的中草藥，且為貴細(xì)藥材，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行比較全面的質(zhì)量控制。我們利用HPLC建立了對(duì)消栓通絡(luò)片中三七的3種主要成分(人參皂苷Rb1、Rg1與三七皂苷R1)進(jìn)行含量檢測(cè)的方法，并對(duì)不同生產(chǎn)廠家的藥品進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)，比較它們之間的含量差別，同時(shí)檢測(cè)了藥品中是否非法添加三七莖葉提取物的情況。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 藥品與試劑 消栓通絡(luò)片為從藥店自購藥品；人參皂苷Rb1(批號(hào)：20170601)、人參皂苷Rg1(批號(hào)：20170214)、三七皂苷R1(批號(hào)：20161121)為壇墨質(zhì)檢-國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心生產(chǎn)；三七莖葉提取物(西安沃森生物科技有限公司，總皂苷含量80%，批號(hào)：20170218)；正丁醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20181118)、甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20190130)為分析純；乙腈為色譜純(TEDIA,批號(hào):20015013)；娃哈哈純凈水(批號(hào)：20190216)。

1.2 主要儀器設(shè)備 KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);安捷倫1200液相色譜儀(美國Agilent公司)。色譜柱:InertSustain C18色譜柱(日本GL Sciences Lnc.)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 柱溫25 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長為203 nm；流動(dòng)相以乙腈為流動(dòng)相A，以水溶液為流動(dòng)相B，按照表1的比例變化進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相的梯度變化

2.2 樣品溶液的制備 消栓通絡(luò)片樣品溶液的制備：消栓通絡(luò)片去除外層包衣或薄膜衣，干燥，研磨成粉末，過60目篩，取粉末2.0 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入25 mL乙醚，超聲處理20 min，經(jīng)濾紙過濾，棄去濾液，殘?jiān)龘]去乙醚干燥后再以水飽和的正丁醇25 mL浸泡6 h，然后超聲處理20 min，過濾，殘?jiān)僖?0 mL水飽和的正丁醇洗滌，過濾，兩次濾液合并，再以氨試液進(jìn)行萃取兩次，每次30 mL，正丁醇萃取液合并，水浴蒸干，殘?jiān)约状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，溶液再以0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

藥材對(duì)照品溶液的制備：稱取經(jīng)過60目篩的三七藥材對(duì)照品與三七莖葉提取物粉末0.5 g，按照消栓通絡(luò)片樣品溶液的制備方法進(jìn)行處理，即得。

消栓通絡(luò)片三七陰性對(duì)照溶液的制備：按照藥材組方的比例，取缺少三七的另外10種藥材，按照消栓通絡(luò)片的制備方法進(jìn)行制備，稱取2.0 g，按照消栓通絡(luò)片樣品溶液的制備方法進(jìn)行處理，即得。

3種對(duì)照品溶液的制備：分別稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對(duì)照品5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，再以甲醇溶液定容，搖勻，備用。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品(樣品4，批號(hào)：170302)、三七陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb13種對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，以甲醇稀釋至10 mL，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取濃度為0.102 mg·mL-1的三七皂苷R1、0.104 mg·mL-1的人參皂苷Rg1、0.102 mg·mL-1的人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液各10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5 次，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取消栓通絡(luò)片粉末(樣品4，批號(hào)：170302)約2 g，精密稱重，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件檢測(cè)，精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀，共進(jìn)樣5次，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取消栓通絡(luò)片粉末(樣品4，批號(hào)：170302)約2 g，精密稱重，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件，精密吸取供試品溶液 10 μL，分別在0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積。

2.8 回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的消栓通絡(luò)片粉末(樣品4，批號(hào)：170302)約2 g，精密稱重，分別加入編號(hào)1～6 的25 mL容量瓶中，精密吸取三七皂苷R10.101 mg、人參皂苷Rg10.102 mg、人參皂苷Rb1對(duì)照品0.101 mg，按供試樣品溶液制備方法，依色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，典型的色譜圖見圖1～4。

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1圖1 3種三七皂苷對(duì)照品的色譜圖

圖2 消栓通絡(luò)片樣品的色譜圖

圖3 三七莖葉提取物的色譜圖

圖4 消栓通絡(luò)片三七陰性對(duì)照溶液的色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖(見圖1)，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。三七皂苷R1Y=6 000.68X+210.61，r=0.999 6；人參皂苷Rg1Y=7 818.54X+ 191.23，r=0.999 7；人參皂苷Rb1Y= 5 348.27X+207.05，r=0.999 7。結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1分別在0.025～0.51、0.026～0.52、0.025～0.51 mg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積，RSD分別為2.28%、1.39%、1.83%(n=5)，說明儀器的精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積，RSD分別為1.84%、2.03%、1.91%(n=5)。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積，RSD分別為1.73%、2.15%、1.83%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.6 回收率試驗(yàn) 依色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率分別為100.51%、99.68%、98.12%，RSD分別為2.16%、2.01%、2.87%(n=6)。

3.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果 按照前文建立的測(cè)定方法，對(duì)本次自購的6個(gè)生產(chǎn)廠家共計(jì)12個(gè)生產(chǎn)批次的消栓通絡(luò)片中三七皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 消栓通絡(luò)片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量

4 討論

在進(jìn)行HPLC分離時(shí)，本論文參閱了藥典對(duì)三七藥材和含有三七的中成藥對(duì)三七皂苷的HPLC檢測(cè)條件[1,6-8]，發(fā)現(xiàn)它們的出峰時(shí)間比較長，我們對(duì)色譜條件進(jìn)行了改變，縮短了出峰時(shí)間，指標(biāo)成分的色譜峰之間無干擾、專屬性、分離度及穩(wěn)定性也比較好，符合質(zhì)量檢測(cè)的要求。

對(duì)6個(gè)生產(chǎn)廠家共計(jì)12個(gè)生產(chǎn)批次的消栓通絡(luò)片中三七皂苷的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)的消栓通絡(luò)片中3種三七皂苷類成分都有明顯的HPLC色譜峰出現(xiàn)，且沒有明顯的三七莖葉提取物的HPLC色譜峰，說明被抽檢的藥品沒有以三七莖葉提取物代替三七根入藥的非法添加情況(三七莖葉提取物在25 min后出現(xiàn)比較明顯的色譜峰，但消栓通絡(luò)片樣品中這些色譜峰不明顯，見圖2～3)[9-10]。對(duì)不同企業(yè)、不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的結(jié)果進(jìn)行比較，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量大都穩(wěn)定在1.11～1.54 mg·g-1(平均值為1.35 mg·g-1)、5.85～8.31 mg·g-1(平均值為7.08 mg·g-1)、2.92～4.41 mg·g-1(平均值為3.46 mg·g-1)，不同企業(yè)藥品之間三七總皂苷的含量整體比較穩(wěn)定，含量差別不是非常明顯。