基于網絡藥理學及分子對接虛擬篩選疏風解毒膠囊治療新冠病毒肺炎(COVID-19)活性成分研究

謝平，王晨情，葉雅惠，沈金海，郝春莉

(1.廈門華廈學院環境與公共健康學院，福建 廈門 361024；2.生化制藥福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361024；3.廈門市食品藥品安全重點實驗室，福建 廈門 361024)

2019年12月以來，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性肺炎，在全球范圍內蔓延，主要通過接觸、呼吸道飛沫傳播[1]。其最常見的癥狀是發熱及呼吸道癥狀，輕度癥狀為發熱、肌肉酸痛、全身乏力，呼吸道癥狀包括干咳，部分患者可能會伴有鼻塞、流涕及咽痛等，較嚴重者出現胸悶，氣促，呼吸衰竭休克等嚴重并發癥，甚至導致死亡[2]。

各省市在防治新冠肺炎過程中多以疏風解表為原則，以達到宣散表邪，改善發熱等目的；對《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》[3]中的中醫治療推薦處方進行分析，醫學觀察期推薦使用疏風解毒膠囊(SJC)，并貫穿該病治療全過程，表明其具有較好的預防治療的作用。

SJC來源于民間驗方，是由虎杖、連翹、甘草、馬鞭草、板藍根、敗醬草、柴胡、蘆根8味中藥組成的復方制劑，與連花清瘟膠囊類似，具有清熱解毒、疏肝解郁等功效，臨床上常用于治療急性上呼吸道感染等癥狀。肖琦等[4]研究發現SJC聯合阿比多爾治療時，癥狀消失時間及轉陰時間較單用阿比多爾顯著縮短。

網絡藥理學是基于系統生物學，對“成分-靶點-通路-疾病”網絡進行分析，從整體層面分析中藥復方的藥效物質基礎和分子作用機制；分子對接法是一種預測配體-受體的結合模式和親合力的一種虛擬篩選方法。研究表明[5-6]，SARS-CoV-2是通過其表達的S蛋白識別人類宿主的ACE2蛋白從而進入細胞，相當于病毒感染人體的鑰匙，SARS-CoV-2 3CL水解酶則為病毒在細胞內的轉錄和復制過程中的重要水解酶，三者被認為是有效的治療靶點。本研究擬通過網絡藥理學及分子對接虛擬篩選SJC治療COVID-19的潛在活性成分，為SJC的深入研究及COVID-19的診療提供參考。

1 材料和方法

1.1 SJC活性化合物及靶點篩選 通過中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/)，中醫藥綜合數據庫(TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/)搜索SJC全方中“虎杖”“連翹”“甘草”“馬鞭草”“板藍根”“敗醬草”“柴胡”“蘆根”對應化合物成分及靶點。同時作為口服藥物，藥物的類藥性(drug likeness，DL)及口服利用度(oral availability，OB)等參數尤其重要[7]，篩選(OB≥30%且DL≥0.18)構建潛在活性成分數據集，相關靶點通過Uniprot(https://www.uniprot.org/)，轉換對應基因名。

1.2 構建“藥材-活性成分-靶點”網絡 運用Cytoscape 3.8.0軟件構建“藥材-活性成分-靶點”網絡，并進行分析。

1.3 疾病相關靶點及PPI網絡 在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)等數據庫，以“novel-coronavirus-pneumonia”等為關鍵詞搜索COVID-19疾病靶點，去除重復靶點，Uniprot校正整合，運用Venn 2.1.0獲取SJC活性成分作用靶點與COVID-19疾病相關靶點的共有基因，將其導入STRING數據庫中，限定物種為人，以高置信度(0.9)為條件篩選，去除孤立靶點，構建PPI網絡，并進行分析。

1.4 靶點富集分析 使用R軟件，設定閾值P<0.05，進行GO(gene ontology)功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，繪制柱狀圖、氣泡圖和通路網絡圖，并分析SJC抗COVID-19的生物過程和信號通路。

1.5 “成分-靶點-共有通路”網絡構建 通過分析SJC治療COVID-19的前20條關鍵信號通路，構建“成分-靶點”和“靶點-共有通路”網絡，采用Cytoscape 3.8.0軟件中merge功能進行合并，度(Degree)值越高，代表其發揮的作用越大。

1.6 分子對接虛擬篩選 通過TCMSP數據庫下載活性成分數據集的mol2格式，通過Chem3D使之能量最小化，轉換為pdb格式，導入AutoDock Tools 1.5.6軟件，加氫，設置柔性鍵可旋轉，保存為pdbqt格式。從蛋白質結構數據庫(PDB，https://www.rcsb.org/)下載SARS-CoV-2 3CL水解酶(PDB ID：6LU7)、S蛋白(PDB ID：6VSB)及ACE2(PDB ID：1R42)的3D結構PDB格式文件，移除水分子和原配體，加氫，保存為pdbqt格式，以潛在活性成分數據集作為配體，靶蛋白為受體，根據作用位點，確定Grid Box的坐標和長寬高，通過AutoDock Vina 1.1.2和Python腳本進行批量分子對接，對對接結果進行分析處理。

2 結果

2.1 活性成分篩選 借助TCMSP數據庫和TCMID數據庫，通過2次篩選，從1 151個化合物中，最終篩選得到活性化合物179個，其中13個來自敗醬草，39個來自板藍根，17個來自柴胡，92個來自甘草，10個來自虎杖，23個來自連翹，1個來自蘆根，12個來自馬鞭草。

2.2 “藥材-活性成分-靶點”網絡 “藥材-活性成分-靶點”網絡共309個節點和3 883條邊，連接較多的可能是關鍵的活性成分或者靶點，起到樞紐的作用越強[8]，每個活性成分平均與16.90個靶點相互作用，每個靶點平均與19.63個活性成分相互作用，體現了多成分與多靶點共同作用的特點。排名前5位的成分分別是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山柰酚、MOL000358-β-谷甾醇、MOL003896-7-Methoxy-2-methyl-isoflavone、MOL000449-豆甾醇、MOL000006-木犀草素，分別能與77、46、39、39、38個靶點相互作用；排名前5位的靶點是雄激素受體(AR)、雌激素受體(ESR1)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、誘導型一氧化氮合成酶(NOS2)、過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG)分別能與148、148、136、124、118個成分相互作用。白色代表靶點，淺藍色代表敗醬草及其化合物，淺紫色代表板藍根及其化合物，粉色代表柴胡及其化合物，黃色代表甘草及其化合物，紅色代表虎杖及其化合物，淺綠色代表連翹及其化合物，藍色代表蘆根及其化合物，湖藍色代表馬鞭草及其化合物，每條邊代表藥材中所含化合物與靶點相互作用關系，如圖1所示。

圖1 疏風解毒膠囊中“藥物-活性成分-靶點”網絡

2.3 共有靶點及PPI網絡構建 去重后獲得COVID-19疾病靶點共254個，與SJC中239個作用靶點取交集，結果見圖2；通過STRING平臺進行PPI網絡分析，下載PPI信息，將文件導入Cytoscape軟件中，根據網絡拓撲參數篩選出，共得到SJC治療COVID-19的49個關鍵靶點蛋白，自由度由高到低依次為NF-κB蛋白復合體(RELA)、絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPK3、MAPK1)、炎性介質細胞因子(IL-6)、絲裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)，結果見圖3。

圖2 疏風解毒膠囊治療疾病靶點韋恩圖

圖3 PPI網絡

2.4 靶點富集可視化 GO功能富集條目1 330條(P<0.05)，其中生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)條目分別為1 251、31、48條，柱狀圖見圖4。KEGG通路富集條目142條(P<0.05)信號通路，選P值較小的20條通路繪制氣泡圖，與病毒、細菌感染有關的信號通路有查加斯病、人類巨細胞病毒感染、耶爾森氏菌感染、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染和利什曼病甲型流感等；與解熱、抗炎、免疫調節密切相關的信號通路有糖尿病并發癥中的晚期糖基化終末產物(AGE-RAGE)信號通路、IL-17信號通路、核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)樣受體信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、Th17細胞分化和HIF-1信號通路等，提示SCJ可能通過抵抗并清除入侵的病原體及已感染的細胞，調控機體免疫系統，降低炎癥反應，起到防治COVID-19的作用。選取前10條通路繪制注釋網絡圖，結果見圖5。

圖4 疏風解毒膠囊治療新冠病毒肺炎靶標的GO富集分析

圖5 疏風解毒膠囊治療新冠病毒肺炎靶標的KEGG通路富集(A)和注釋網絡(B)

2.5 “活性成分-靶點-通路”網絡構建 SJC治療COVID-19的前20條關鍵信號通路涉及的靶點主要包括：PTGS2、NOS2、PPARG、MAPK14和二肽基肽酶-4(DPP4)等22個關鍵靶點，相關的靶點對應143個成分，主要包括：MOL000098-槲皮素、MOL000006-木犀草素、MOL004328-柚皮素、MOL000497-甘草查爾酮A、MOL000173-漢黃芩素和MOL000422-山柰酚等，體現了各成分是通過多靶點、多信號通路起到治療的作用，方形代表活性成分，圓形代表作用靶點，箭頭代表信號通路，形狀越大代表其發揮的作用越大，邊代表靶點與活性成分，靶點與信號通路，活性成分與信號通路之間的關系。結果見圖6。

圖6 疏風解毒膠囊治療新冠病毒肺炎“成分-靶點-通路”網絡

2.6 對接方法可行性驗證 移除含有配體的蛋白復合結構中的配體，按設定的參數進行對接，計算對接后構象與原配體結構的均方根偏差值(RMSD)。對接結果表明RMSD均小于0.2 nm，說明該方法準確可行，能較好地重現配體與受體的結合模式。

2.7 分子對接虛擬篩選結果 當結合能≤7.0 kcal·mol-1時，被認為配體與受體結合穩定時能量越低，產生作用可能性較大[9]。分子對接打分值從低到高進行排序見表1～3，SJC中與SARS-CoV-2 3CL水解酶、S蛋白及ACE2結合能數值小于-7.0 kcal·mol-1的分別有130、173、157個化合物。與SARS-CoV-2 3CL水解酶結合較好的分別為MOL005018-夏姆比奧納(-9.1 kcal·mol-1)、MOL001810-青黛酮(-9.0 kcal·mol-1)、MOL001790-蒙花苷(-8.5 kcal·mol-1)；與S蛋白結合較好的分別為MOL005013-18α-羥基甘草次酸(-10.7 kcal·mol-1)、MOL001790-蒙花苷(-10.6 kcal·mol-1)、MOL001790-新黃烷酮(-10.4 kcal·mol-1)；與ACE2結合較好的分別為MOL005018-夏姆比奧納(-10.4 kcal·mol-1)、MOL001663-{(4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10R,12aR,14bS)-10-羥基-2,2,6a,6b,9,9,12a-七甲基-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-十四氫萘-4a-羧酸，-9.9 kcal·mol-1}、MOL001810-青黛酮(-9.5 kcal·mol-1)，結合能均遠小于臨床用藥。選取打分前十成分進行分析評價，荷包牡丹堿、青黛酮及新黃烷酮是與SARS-CoV-2 3CL水解酶、S蛋白及ACE2親和力最強的三個活性成分，以新黃烷酮為例，虛線為氫鍵，數值為鍵長，SARS-CoV-2 3CL水解酶為受體，配體羥基可與Gly143形成氫鍵作用；其他疏水殘基如His164、Gln189、Asn142、Glu166等通過與配體疏水環形成較強的堆積作用，更有利于結合；S蛋白為受體，配體羥基可與Pro230形成氫鍵作用，疏水殘基有Phe515、Pro426、Asp428、Ile231；ACE2為受體，配體羥基可與Asn290、Ile291形成氫鍵作用，疏水殘基有Lys441、Ala413、Leu410、Met366，核心活性成分分子對接模式及相互作用二維圖見圖7～8。

表1 疏風解毒膠囊中活性成分及目前臨床用藥與SARS-CoV-2 3CL水解酶對接結果

表2 疏風解毒膠囊中活性成分及目前臨床用藥與S蛋白對接結果

表2(續)

表3 疏風解毒膠囊中活性成分與ACE2對接結果

圖7 受體蛋白與疏風解毒膠囊中核心活性成分的分子對接模式

圖8 受體蛋白與疏風解毒膠囊中核心活性成分相互作用二維圖

3 討論

預防在此次疫情防控中起著重要的作用，通過判斷疾病發展趨勢，治療早于疾病的發生，以防進一步傳變，國家診療方中，風熱犯衛出現乏力伴發熱時，使用清熱解毒中成藥SJC，以在疾病的潛伏期內及早治療，遏制病情的發展，達到“不治已病治未病，不治已亂治未亂”[10]。

在治療過程中，其一需強其正氣，COVID-19致病原因為“濕毒”所致，方中虎杖作為君藥，能除濕、化毒；其二需避其毒氣，作為抗病毒的常用藥，連翹能解表、祛風；板藍根具有清熱解毒等功效，共為臣藥；其三為養其神氣，大疫常給人帶來恐懼或焦慮等情緒，因疫情喪失親人，悲傷思念過度而產生抑郁情緒。負性情緒可影響激素和神經遞質的分泌，導致免疫力下降，而SJC中柴胡具有舒肝解郁、升舉陽氣等作用，在藥材協同治療過程中體現了中藥復方多成分、多靶點、多通路的特點。

根據PPI網絡拓撲篩選的核心靶點主要包括：絲裂原活化蛋白激酶家族成員MAPK1、MAPK3和MAPK14、IL-6和RELA等；當出現感染損傷時，免疫系統應對反應表達IL-6，通過激活Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(Jak/Stat)信號通路，產生免疫細胞，在B淋巴細胞分化、漿細胞形成中起著重要作用[11]。跟炎性因子一樣，MAPK在一些應激情況下被激活如炎癥反應、腫瘤細胞的增殖分化、病毒感染狀態下，MAPK通路調節細胞應對環境的應激變化，主要是通過細胞外信號調節激酶(ERK)、p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)和應激激活蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(SAPK/JNK)3種途徑[12]?！盎钚猿煞?靶點-通路”網絡顯示SJC中143個成分通過PTGS2、NOS2、PPARG、MAPK14和DPP4等22個靶點發揮療效，涉及雌激素應答、免疫炎癥、氧化應激、記憶過程、細菌內毒素反應、防御反應及糖皮質激素反應等多個生物過程，參與Th17細胞分化通路、IL-17信號通路及TNF信號通路等，調節免疫炎癥因子、單胺類神經遞質，起到抑制活化的細胞因子、緩和過激的免疫反應、消除炎癥及抗病毒的作用。

Wang等[13]應用單細胞測序識別得到與ACE2共表達的5 556個基因，SCJ中活性成分可能通過影響IL-6、PTGS2、NOS2、MAPK14及DPP4等共有靶點及腎素-血管緊張素系統，激活下游信號通路來促進ACE2的轉錄和表達，競爭性的影響SARS-CoV-2表達的S蛋白與ACE2結合，減少病毒進入受體細胞的數量，同時抑制SARS-CoV-2 3CL水解酶的活性，減少病毒的復制，從而發揮治療COVID-19或對COVID-19病程進展的干預作用。分子對接虛擬篩選結果顯示，SCJ中共有成分槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇、木犀草素和金合歡素等，與SARS-CoV-2 3CL水解酶結合較好的：山柰酚(-7.8 kcal·mol-1)、槲皮素(-7.7 kcal·mol-1)、木犀草素(-7.6 kcal·mol-1)；與S蛋白結合較好的：木犀草素(-8.8 kcal·mol-1)、豆甾醇(-8.2 kcal·mol-1)、金合歡素(-8.2 kcal·mol-1)；與ACE2結合較好的：β-谷甾醇(-8.8 kcal·mol-1)、豆甾醇(-8.8 kcal·mol-1)、木犀草素(-8.2 kcal·mol-1)，可知共有化合物與相關靶點蛋白形成構象能量低，有較好的親和作用，與克力芝、阿比朵爾和氯喹等具有相近的結合能。

凌曉穎等[14]研究表明連花清瘟方中山柰酚、槲皮素、木犀草素除了直接抑制病毒復制外，還作用于炎癥、免疫等多條信號通路，分子對接結果顯示與目前臨床報道有效藥物具有相近的結合能。已有報道[15-16]，槲皮素、山柰酚具有抗炎、抗菌抗病毒、抗氧化和神經保護等作用；木犀草素用于止咳、祛痰，具有免疫調節、消炎、抗菌、抗病毒等作用，可抑制卵巢癌細胞的增殖及誘導其凋亡[17]。

比較與不同受體蛋白結合結果，荷包牡丹堿、新黃烷酮及青黛酮3個核心活性成分在與不同受體蛋白結合中均具有較好的結合力，導入SwissADME中符合Lipinski類藥五規則且結合能遠小于目前所報道具有抗SARS-CoV-2的臨床用藥；有研究報道[18-20]，荷包牡丹堿可以促進氣道平滑肌收縮，參與氣道形態重塑，同時對腫瘤癌癥也有一定作用，誘導人肺腺癌細胞A549凋亡，抑制人高轉移性肝癌細胞MHCC97-H及乳腺癌細胞MCF-7的分化及轉移。其他較優篩選成分中，由于部分化合物不屬于常見成分，目前研究較少，在研究中應加強對此類藥物進行發掘利用；通過對接較好的化合物結構比較發現，結構中含有六元環五元環稠合或六元環六元環稠合結構顯示出較好的結合能力，可作為小分子藥物開發的依據。宋新強等[21]以ACE2為靶點，同樣篩選出的中藥成分中粗毛甘草素F、新黃烷酮等為抗SARS-CoV-2的核心成分；李婧等[22]以SARS-CoV-2 3CL水解酶為靶點，對接結果顯示柴胡皂苷、蒙花苷和β-胡蘿卜素等形成構象能量低，較穩定。

綜上所述，目前對COVID-19及其致病機制認識不全面，通過高通量組學及生物學方法仍不夠準確，中藥的化學成分作用靶點及結構尚不完善，存在一定的局限性。應重點對荷包牡丹堿、新黃烷酮及青黛酮等少見的化合物的進行質量控制及藥理學研究，進一步的驗證，以期為治療COVID-19提供可參考的依據。