谷胱甘肽過氧化物酶4介導(dǎo)的鐵死亡在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥中的作用

張清峰，劉 奎，楊曉燕，唐 波，黃 云

自貢市第四人民醫(yī)院 胸心外科 (自貢 643000)

全世界每年死于肺癌的人數(shù)超過100萬。在肺癌患者中約80%的病例是非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)[1-2]。手術(shù)是治療早期NSCLC的主要方法，但大多數(shù)NSCLC患者在確診時(shí)已屬于晚期并伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2-3]，因此，化療是其主要治療手段。順鉑(cis-diaminodichloro platinum，DDP)是目前NSCLC在臨床治療中的首選藥物，治療效果較好[4]。但在化療過程中，DDP易產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療失敗[5],因此需要深入研究DDP的耐藥機(jī)制。

鐵死亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡模式，不飽和脂肪酸過氧化，使脂質(zhì)過氧化ROS(Lipid ROS)積聚，最終引起細(xì)胞死亡[6-8]。已有研究[9-11]報(bào)道，腫瘤細(xì)胞的耐藥性與谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)的表達(dá)和活性相關(guān)。GPX4可保護(hù)腫瘤細(xì)胞膜免受Lipid ROS的影響，從而對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，抑制GPX4的活性，可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[9]。而GPX4是鐵死亡過程中重要的Lipid ROS調(diào)控分子，其對(duì)Lipid ROS的清除可抑制鐵死亡發(fā)生[12-13]。研究[14-15]顯示，GPX4在NSCLC中可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移；在NSCLC細(xì)胞中抑制GPX4的表達(dá)，能明顯增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性。以上研究表明，GPX4調(diào)控的鐵死亡發(fā)生可能與腫瘤細(xì)胞的化療藥物耐藥性密切相關(guān)。因此，本文以GPX4介導(dǎo)的鐵死亡為切入點(diǎn)，研究GPX4介導(dǎo)的鐵死亡發(fā)生在A549/DDP耐藥中的作用，為NSCLC的臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人NSCLC細(xì)胞株(A549)、人NSCLC DDP耐藥株(A549/DDP)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基、鏈霉素、青霉素、0.25%胰酶購自美國Hyclone公司；活性氧自由基(ROS)檢測(cè)試劑盒、Lipo8000轉(zhuǎn)染試劑、RIPA裂解液購買自上海Beyotime公司；胎牛血清購自德國PAN公司；CCK-8試劑盒、Lipid ROS檢測(cè)試劑盒(Liperfluo)購自日本同仁化學(xué)公司；RSL3、Fer-1、DDP購自美國Selleck公司；鼠抗β-actin、GAPDH單克隆抗體購自武漢Abclonal公司；兔抗GPX4購自美國Bimake公司；兔二抗、鼠二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549與A549/DDP細(xì)胞放置在含10%胎牛血清與1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度在80%～90%時(shí)，用濃度為0.25%的胰酶消化傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組

取對(duì)數(shù)生長期的A549細(xì)胞，胰酶消化后，按照每孔70%左右的比例鋪于6孔板中，培養(yǎng)過夜后，按照Lipo8000說明書要求轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GPX4及pcDNA3.1質(zhì)粒至A549細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為陰性對(duì)照組(pcDNA3.1組)以及質(zhì)粒過表達(dá)組(pcDNA3.1-GPX4組)進(jìn)行后續(xù)的CCK8及蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞加入96孔板中 (5×103個(gè)/孔、150 μL/孔)，于恒溫孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，換新鮮培養(yǎng)基，加入不同濃度的DDP(0、1、2、4、8、10 g/L)，置于恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后按照CCK8試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞增殖，計(jì)算細(xì)胞對(duì)藥物抑制率為50%時(shí)的藥物濃度(50% inhibitory concentration，IC50)值。

1.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

取對(duì)數(shù)生長期的A549、A549/DDP細(xì)胞，A549轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒及GPX4過表達(dá)質(zhì)粒后的細(xì)胞，用DDP(5 μg/mL)、RSL3(2 μg/mL)、DDP+RSL3處理48 h后的細(xì)胞，胰酶消化后，用PBS洗兩次。加入適量RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min后，4 ℃，12 000 r/min，離心半徑13.5 cm;離心15 min，收集上清，加入5×蛋白loading buffer制樣。用濃度為12%的SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)0.22 μm的PVDF膜。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜用5%的脫脂奶粉于室溫下封閉1 h，然后一抗4 ℃孵育過夜。第2天，用TBST洗滌一抗孵育過夜的PVDF膜3次，10 min/次。二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，10 min/次。用顯影液與曝光機(jī)曝光。

1.6 細(xì)胞總ROS含量測(cè)定

將pcDNA3.1及pcDNA3.1-GPX4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞48 h后，分別用DDP(5 μg/mL)、RSL3(2 μg/mL)、Fer-1(1 μmol/mL)、DDP(5 μg/mL)+Fer-1(1 μmol/L)、DDP(5 μg/mL)+RSL3(2 μg/mL)繼續(xù)處理48 h。將處理后的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后，用1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，按照試劑盒要求加入適量DCFH-DA染色液，37 ℃孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次。孵育完成后用無血清1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的染色液，用流式細(xì)胞儀(488 nm/525 nm)檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 Lipid ROS含量測(cè)定

將上述處理后的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后，用1×PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，按照試劑盒要求加入適量Liperfluo染色液，37 ℃孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次。孵育完成后用無血清1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的染色液，用流式細(xì)胞儀(488 nm/525 nm)檢測(cè)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GPX4在A549與A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，在A549/DDP中GPX4的表達(dá)高于A549細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.880，P= 0.001)(圖1)。

圖1 GPX4在A549與A549/DDP細(xì)胞中表達(dá)比較

2.2 GPX4在A549細(xì)胞中過表達(dá)對(duì)DDP耐受性的影響

在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GPX4的過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-GPX4后，與對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載)相比，GPX4的表達(dá)量明顯增加(t=10.810，P=0.001)(圖2)。CCK8結(jié)果顯示，GPX4在A549細(xì)胞中過表達(dá)后，可明顯增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)DDP的耐受性(P<0.05)(表1)。

圖2 GPX4在A549細(xì)胞中過表達(dá)對(duì)DDP耐受性的影響

表1 DDP在兩組中的IC50值比較

2.3 RSL3對(duì)A549/DDP細(xì)胞DDP敏感性的影響

用鐵死亡激動(dòng)劑RSL3可以抑制A549/DDP細(xì)胞內(nèi)GPX4的表達(dá)(t=4.930，P=0.008)；將RSL-3與DDP聯(lián)用，與單獨(dú)的DDP處理組以及RSL-3處理組相比，GPX4表達(dá)量下調(diào)更加明顯(P<0.05)(圖3)，并且增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性(圖4)。

圖3 DDP、RSL3對(duì)A549/DDP細(xì)胞中GPX4表達(dá)的影響

圖4 RSL3對(duì)A549/DDP細(xì)胞DDP敏感性的影響(×10)

2.4 鐵死亡對(duì)A549/DDP細(xì)胞DDP敏感性的影響

為進(jìn)一步明確GPX4介導(dǎo)的鐵死亡與A549/DDP耐藥的關(guān)系，用鐵死亡抑制劑Fer-1處理A549/DDP細(xì)胞的同時(shí)，再用DDP處理，48 h后試劑盒檢測(cè)鐵死亡Marker(細(xì)胞活力、ROS以及Lipid ROS)，結(jié)果顯示，DDP、RSL3處理A549/DDP細(xì)胞后，細(xì)胞鐵死亡發(fā)生；而將兩者連用后，細(xì)胞鐵死亡發(fā)生更加明顯，細(xì)胞對(duì)DDP敏感性增強(qiáng)。但用Fer-1抑制鐵死亡發(fā)生時(shí)，F(xiàn)er-1對(duì)A549/DDP細(xì)胞鐵死亡發(fā)生沒有明顯影響；將DDP與Fer-1聯(lián)合處理A549/DDP細(xì)胞，與單獨(dú)的DDP處理組相比，聯(lián)合處理組可抑制鐵死亡發(fā)生，同時(shí)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性降低(表2)。

表2 鐵死亡對(duì)A549/DDP藥物敏感性的影響

3 討論

在全球范圍內(nèi)每年有超過100萬人死于NSCLS[1-2]。以DDP為基礎(chǔ)的化療策略是NSCLS臨床治療中的首選方案，但是DDP在臨床治療中極易引起耐藥，導(dǎo)致化療失敗，無法提高患者的生存率[4-5]。因此，尋找新的耐藥靶點(diǎn)或者與耐藥相關(guān)的信號(hào)通路來降低DDP在NSCLS化療中的耐藥性至關(guān)重要。

鐵死亡作為近年發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞程序性死亡方式，被認(rèn)為與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[16-17]，其中GPX4介導(dǎo)的Lipid ROS的紊亂是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵過程[6]。已有研究[18-19]表明，胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Xc-復(fù)合物中xCT亞基在多種耐藥腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而xCT亞基的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)還原性谷胱甘肽(GSH)含量升高，鐵死亡被抑制。GSH又是GPX4對(duì)Lipid ROS清除中的關(guān)鍵底物，其表達(dá)量的升高會(huì)影響GPX4的表達(dá)[20]。

GPX4在腫瘤細(xì)胞耐藥中發(fā)揮重要作用。研究[14]發(fā)現(xiàn)，抑制GPX4活性可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性；Eaton等[15]研究發(fā)現(xiàn)，共價(jià)結(jié)合GPX4可作為增強(qiáng)化療藥物敏感性的關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，GPX4在A549與A549/DDP細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該結(jié)果說明GPX4可能與A549/DDP細(xì)胞耐藥性有關(guān)。本研究在A549細(xì)胞中過表達(dá)GPX4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPX4過表達(dá)后的細(xì)胞對(duì)DDP耐受性增強(qiáng)。鑒于GPX4在細(xì)胞鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵作用，本研究在抑制鐵死亡發(fā)生的情況下，檢測(cè)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。該結(jié)果顯示，抑制鐵死亡發(fā)生可降低A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性，而通過RSL3抑制GPX4的表達(dá)與活性，激活A(yù)549/DDP細(xì)胞鐵死亡，可增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。以上結(jié)果顯示，GPX4可通過抑制鐵死亡發(fā)生，增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐受性。

綜上所述，GPX4的表達(dá)量與NSCLS細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性呈正相關(guān)，而GPX4作為鐵死亡調(diào)控的關(guān)鍵分子，其活性或表達(dá)量的抑制，可激活鐵死亡發(fā)生，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性，這為NSCLS耐藥的臨床研究提供了新視野。本研究僅在體外層面證實(shí)GPX4的高表達(dá)與A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性密切相關(guān)，其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明，同時(shí)其在體內(nèi)發(fā)揮的作用仍需進(jìn)一步研究。