卵巢上皮癌CD24和Yes相關蛋白1的表達及其臨床意義

劉鑫路，吳運萍△，張林海，何 瑤，邵啟祥

1.連云港市第二人民醫院 輸血科(連云港 222006)；2.南京醫科大學附屬醫院 婦科(南京 210004)；3.江蘇大學醫學院 免疫學教研室 (鎮江 212013)

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發病率位居首位，是威脅女性健康的頭號殺手[1-2]。卵巢癌一般在發病初期不易被察覺，疾病早期的病理特征較隱匿，因此造成漏診，當患者到醫院就診時已處于疾病晚期，此時行手術治療很難達到理想效果[3]。研究[4]顯示，細胞黏附分子CD24在癌癥產生和發展中發揮重要作用。有研究[2-7]顯示，黏附分子 CD24除表達于人體的正常組織外，惡性腫瘤的發生、發展與CD24的異常高表達有明顯相關性。研究[6-7]表明，CD24 在很多惡性腫瘤中有不同程度的異常表達，可能與腫瘤的發生發展機制有一定相關性，CD24是卵巢癌干細胞標志和卵巢癌的治療靶點。

Yes相關蛋白1 (YAP1)屬于轉錄輔助因子，是Hippo-YAP抑癌信號通路中非常重要的效應分子，在腫瘤的調控中發揮著至關重要的作用[8]。研究[8-16]發現，YAP1與多種腫瘤因子共同促進腫瘤細胞在人體的進一步發展。截至目前尚無明確的分子生物學原理闡釋卵巢癌的發生發展機制，也無CD24和YAP1二者同時在卵巢上皮癌表達情況的相關文獻報道。本研究通過采用免疫組化等技術檢測CD24和YAP1二者在卵巢癌上皮性組織中的表達情況，并分析二者參數與卵巢癌預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選擇2013年6月至2017年6月在連云港市第二人民醫院進行切除術治療的卵巢癌患者的卵巢組織樣本為研究對象，采集44例卵巢癌患者的癌組織樣本，同時采集上述患者的正常卵巢組織標本進行對照研究。入組的卵巢癌患者未進行放、化療，且相關病理數據齊全。基于國際婦產科聯合會相關標準進行卵巢上皮癌分期判斷。通過蘇木精-伊紅染色法 (HE) 對采集的全部標本進行染色處理，由2個經驗豐富的主任醫師開展復查工作，提高診斷準確性。

1.2 主要材料

兔抗人CD24單克隆抗體(購自美國Phygene Biotechnology Co，稀釋濃度1∶200)；兔抗人YAP1多克隆抗體(購自美國PhygeneBiotechnology Co，稀釋濃度1∶400)；免疫組化檢測試劑(購自北京金豪制藥股份有限公司)；免疫組化封閉液和相應的試劑盒(來源于北京康藥科技)。

1.3 免疫組化

將蠟塊按厚度4 μm做連續切片，采用免疫組化免疫酶標方法進行檢測，使用試劑商推薦的確定含該蛋白的陽性組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)設置相應陰性對照。對采集的樣本在顯微鏡下400倍觀察，各切片選5個視野，各視野內確定出100個細胞。觀察結果發現，細胞膜和細胞質中都出現染色后的CD24信號，而YAP1的信號大部分出現在細胞質中。染色后這兩種蛋白都表現為黃色顆粒狀，濃度高則顏色越深。在腫瘤組織中觀察到黃色顆粒，則判斷為陽性染色，基于其中陽性染色細胞數的占比進行表達水平劃分：不表達(-)、<10%(+)、10%～50%(++)、>50%(+++)。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行分析，基于Spearman法驗證相關性，組間差異進行方差檢驗，多組數據差異進行Bonferroni對比，基于Kaplan-Meier檢測，檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 在病理特征有差異的卵巢上皮性組織中CD24和YAP1二者的表達情況

2.1.1 CD24的表達情況 通過對病理特征有差異的卵巢組織免疫組化檢測結果表明，正常組織中CD24含量很少，而在卵巢癌組織中表達高，差異具有統計學意義(P<0.05)。在正常樣本中，CD24的表達水平低于癌組織的情況主要出現在細胞膜上，同時相應的陽性程度低(+)；卵巢癌組織中，CD24主要出現在細胞膜和細胞質中，表現為強陽性，陽性率也高于正常組織(表1、圖1)。

表1 CD24在不同性質卵巢組織中的表達情況(n=44)

圖1 CD24在不同卵巢組織中的表達

2.1.2 YAP1的表達情況 正常卵巢組織中，YAP1的表達水平均不高，但在卵巢上皮癌組織中高表達，組間差異有統計學意義(P<0.05)。正常卵巢組織中，YAP1單純出現在細胞質中；而在卵巢上皮癌組織中，其還出現在細胞核中。陽性水平結果顯示，正常卵巢組織中YAP1一般表現為弱陽性，卵巢上皮癌組織中則為強陽性(表2、圖2)。

表2 YAP1在兩種卵巢組織中的表達(n=44)

圖2 YAP1在不同卵巢組織中的表達

2.2 多組性質不同的參數與卵巢癌上皮性組織中CD24和YAP1表達的相關性

2.2.1 CD24的表達與不同臨床參數的關系 在卵巢上皮癌組織中，CD24蛋白表達水平和腫瘤分級、分期等相關指標均存在密切關系，具體表現為分期高、分化低的癌組織中CD24含量更高，但其表達水平和淋巴結轉移及患者的年齡等不存在相關性(表3)。

表3 CD24在不同臨床病例特征的卵巢上皮癌的表達情況

2.2.2 YAP1水平和臨床參數的關系 在卵巢上皮癌組織中，YAP1蛋白的表達水平高，同時受到樣本量等因素的影響，在研究過程中沒有確定出臨床參數和其表達水平的關系(表4)。

表4 YAP1在不同臨床病例特征的卵巢上皮癌的表達情況

2.3 CD24、YAP1蛋白表達的相關性

CD24陽性的32例患者中，YAP1也為陽性的31例；CD24陰性的12例中，只有1例YAP1也為陰性。卵巢上皮癌組織中，以上兩種蛋白的表達呈正相關(r=0.501，P=0.035)。

2.4 CD24和YAP1的表達與卵巢癌患者預后的關系

數據收集至2017年6月，同時對入選的44例患者進行隨訪，隨訪截至2019年12月，有12位患者生存，32位患者死亡。采用Kaplan-Meier法分析入組患者的存活時間發現，CD24和YAP1二者皆陽性的表達組存活周期明顯低于非同時表達陽性組的存活周期(表5、圖3)。

表5 患者術后隨訪情況(n)

圖3 CD24和YAP1的表達與卵巢癌患者預后的關系

3 討論

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發病率位居首位，是威脅女性健康的頭號殺手[1-2]。盡管近期出現一些治療卵巢癌的新方法，但因卵巢自身的特殊結構以及早期相關癥狀不易被發現的特點，給早期診斷帶來了困難，當臨床發現時大部分患者已錯失最佳治療期[9-10]。

研究[11]發現，CD24可協助腫瘤的診斷，作為一種新的指標可應用于臨床實踐中，且在不同腫瘤細胞表面存在不同程度的高表達，該指標也可指導腫瘤的預后[12]。有研究[13]提出，在腫瘤判斷方面，CD24有較高的指示價值，可作為一種高效標志物，其表達水平高的患者預后一般較差，且對卵巢癌患者的預測價值更高。

研究[14-15]表明，YAP1在卵巢癌的調控機制上起到非常重要的作用，對癌細胞的相關組織有一定的誘導作用。多項研究[14-17]提出，YAP1在多種腫瘤中高表達，YAP1的表達水平和腫瘤患者的生存期存在密切關系。

Touboul等[17]研究發現，CD24和YAP1都有一定程度表達，來源于腫瘤細胞的外體可表達出腫瘤的特異性及共同的抗原。目前國際主流研究[18]認為，外體具有相應的抗腫瘤作用，其可作為一種載體搭載抗原并將其運輸到抗原呈遞細胞，從而激發機體的特異性免疫反應達到抗腫瘤目的。上述研究均肯定了二者在上皮癌組織中起到的作用。

本研究發現，在卵巢上皮癌組織中CD24和YAP1表達水平和正常卵巢組織相比明顯增高(P<0.05)；CD24的表達水平與病理分期、分化等相關，CD24和YAP1的表達呈正相關，經Kaplan-Moier檢測發現，與其他組患者相比，癌組織中這兩種蛋白同步表達陽性情況下，患者生存期會明顯降低(P<0.05)。以上結果提示，CD24、YAP1和卵巢上皮癌相關，二者同時陽性可作為卵巢上皮癌患者預后不良的標志。

綜上所述，CD24、YAP1 蛋白在上皮性卵巢癌組織中呈現高表達，并與卵巢上皮癌臨床分期及年齡、淋巴結轉移等都存在一定相關性，提示CD24、YAP1 蛋白在卵巢上皮癌的發生和發展中發揮一定作用。因此進行臨床診斷時，可同步檢測CD24與YAP1的表達，從而對卵巢上皮癌的狀況進行判斷，且預測其增殖、侵襲相關情況，在此基礎上進行演變機制的研究，可為卵巢上皮癌患者的分子靶向治療起到一定促進作用，并提供可靠支持。但由于本研究納入樣本量較小，卵巢上皮癌的發生和演化過程中，這兩種蛋白的作用機制尚不明確，需要開展大樣本研究，更好地滿足臨床應用要求。