苦蕎VQ基因家族的全基因組鑒定及其在葉斑病原與激素處理下的表達譜分析

鄭逢盛，王海華，鄔清韜，申權，田建紅，彭喜旭,3，唐新科,3

苦蕎VQ基因家族的全基因組鑒定及其在葉斑病原與激素處理下的表達譜分析

鄭逢盛1，王海華1,2，鄔清韜1，申權1,2，田建紅1，彭喜旭1,3，唐新科1,3

1湖南科技大學生命科學學院，湖南湘潭 411201；2經濟作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點實驗室，湖南湘潭 411201；3重金屬污染生態土壤修復與安全利用湖南省高校重點實驗室，湖南湘潭 411201

【】VQ基因家族在植物生長、發育以及對生物或非生物脅迫反應中發揮重要功能。在全基因組尺度上，全面鑒定苦蕎（L. Gaertn.）VQ（FtVQ）基因家族，分析其在苦蕎葉斑病原——互格鏈格孢（）和黑孢霉（）侵染和防御相關激素——水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）處理下的表達模式，為深入解析苦蕎VQ基因家族在植物抗病防御中的功能及機理奠定基礎，同時為優良基因資源發掘及抗病品種改良提供線索。基于VQ保守結構域的隱馬爾可夫文件（PF05678），采用HMMER 3.0對苦蕎平苦一號基因組數據庫進行比對搜索，鑒定VQ基因；通過DNAMAN、MapInspect、MEGA、MEME、OrthoFinder、PLACE等生物信息學工具分析基因結構、染色體分布、啟動子順式元件、蛋白質理化性質、蛋白質保守基序、蛋白質亞細胞定位和蛋白質系統進化關系；采用實時熒光定量PCR（qPCR）方法分析苦蕎葉VQ基因在病原侵染或激素處理下的表達模式。從苦蕎基因組中鑒定獲得28個VQ基因，大小為566—1 454 bp，均無內含子，不均一地分布在8條染色體上。根據它們在染色體上的物理位置，命名為—。每一個FtVQ蛋白含有1個VQ基序——FxxxVQx（L/F/I/V/A/Y）TG（x代表任意氨基酸）。亞細胞定位預測表明，21個FtVQ蛋白定位在細胞核中，其余定位在葉綠體或細胞質中。根據蛋白質氨基酸序列與保守結構基序，FtVQ蛋白歸類于5個亞家族，亞家族內基因結構和蛋白質基序相對保守。基因重復分析表明，苦蕎基因組中有8對VQ旁系同源基因，均為大片段重復基因，提示大片段基因重復在FtVQ基因家族數量擴張中發揮主要作用；它們的非同義突變和同義突變的比值（Ka/Ks）均小于1，提示重復基因在進化中經歷了純化選擇。啟動子順式元件預測表明，所有FtVQ基因啟動子含有BIHD1OS、CGTCA、ERELEA4、W-box和類W-box等病原或SA、JA、ET反應元件，尤其在、、、、、的啟動子區域密集程度更高。qPCR分析顯示，在可檢測的20個FtVQ基因中，有55%—70%的基因為病原或激素處理下的差異表達基因（DEGs），其中72.7%—85.7%的DEGs的表達顯著上調。苦蕎基因組擁有28個VQ基因成員，部分VQ基因可能參與了苦蕎對葉斑病原的抗性反應。

苦蕎；VQ基因家族；互格鏈格孢葉斑病；黑孢霉葉斑病；防御相關激素

0 引言

【研究意義】植物在長期進化過程中，為了實現對各種逆境的柔性適應，形成了復雜的分子、生化和細胞機制。在分子水平上，抗性相關基因在時空表達上重編程是植物適應逆境的關鍵事件，而轉錄因子在其中發揮重要作用。多數情況下，轉錄因子通過蛋白互作與轉錄輔助因子形成復合物，實現對靶基因的精準而有效的調節。研究表明，轉錄輔助因子可影響與其結合的轉錄因子DNA結合能力、轉錄激活或抑制活性、亞細胞定位、蛋白的穩定性等重要的生化特性[1]。VQ蛋白是廣泛存在于單、雙子葉植物的一類轉錄輔助蛋白，因其含有高度保守的VQ基序（FxxhVQxhTG）而得名，其中，x為任一氨基酸殘基，h為疏水性氨基酸殘基。VQ基序外的氨基酸序列呈現多樣性，這與VQ蛋白家族的功能多樣化相適應[2]。VQ蛋白可與WRKY轉錄因子第Ⅰ組的C-末端以及第Ⅱ組的WRKY結構域特異結合[3]，通過與WRKY蛋白或MAP激酶等互作[4]，調節植物生長發育以及對生物或非生物逆境響應等生物學過程。在全基因組尺度上鑒定植物VQ基因家族，對基因結構、染色體分布、保守結構域或模體、系統進化、啟動子順式元件等進行全面的生物信息學分析，研究它們在病害和防御相關激素處理下的表達譜，有利于深入闡明VQ基因在植物抗病防御中的調節功能與機理，同時可為植物抗病育種提供候選的基因材料。苦蕎是一種藥食同源的傳統小雜糧作物，營養全面，富含人體必需氨基酸、抗性淀粉、B族維生素和多種具有生物活性的類黃酮物質（如蘆丁、槲皮素）。苦蕎起源于中國西南地區，有較強的生態適應性，耐貧瘠，抗高寒，在富鋁的酸性土壤中也能很好地生長[5]。【前人研究進展】水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）/乙烯（ET）信號通路是植物抗病防御反應中2條主要的信號通路[6]。許多VQ基因的表達響應SA、JA、乙烯（ET）和環境刺激，在SA和JA抗病信號通路中發揮重要的調節作用。在擬南芥[3]、水稻[7-8]和大豆[9]中，經SA、JA、ET或病原侵染，多數VQ基因轉錄水平發生顯著變化。Liu等[10]發現在接種青枯病細菌（）時，51%的煙草VQ基因表達顯著上調，其中部分VQ基因不同程度地受到SA、JA和ET的誘導。直接的生化與遺傳學證據表明，VQ基因參與了植物對病害的防御反應。Lai等[11]發現結構相近的SIB1/VQ23和SIB2/VQ16為WRKY33的共激活子（co-activators），在擬南芥對的抗性中發揮正調節作用。WANG等[12]發現擬南芥VQ22、VQ12和VQ29在JA介導的對死體營養型病原的抗性中起負調控作用。Ali等[13]發現，JAV1/VQ22與JAV1的結合蛋白JUL1（一種泛素連接酶）互作，導致VQ22在細胞核中被降解，引發表達上調，從而賦予擬南芥對生物脅迫的抗性。近年，苦蕎基因組序列已公布[5]，為VQ基因家族的全面系統鑒定與功能基因組研究提供了極大便利。【本研究切入點】目前，在全基因組范圍內，擬南芥[3]、水稻[7-8]、楊樹[14]、玉米[15]、大白菜[16]、葡萄[17]、棉花[18]、草莓[19]、毛竹[20]、蒺藜苜蓿[21]、煙草[10]等植物的VQ基因家族已被鑒定，但未見苦蕎VQ基因家族全面鑒定與表達譜分析的報道。苦蕎容易遭受真菌病害，嚴重影響產量和品質。隨著種植規模的擴大和管理的粗放，病害發生愈發嚴重。最近，SHEN等[22]在湖南苦蕎種植基地發現2種葉斑病，分別由互格鏈格孢（）和黑孢霉（）引起，發生率為40%—60%。【擬解決的關鍵問題】本研究采用生物信息學方法，在全基因組范圍內對苦蕎VQ基因家族進行鑒定，分析VQ基因數量、序列特征、染色體定位、蛋白結構特征、啟動子順式元件和系統進化關系，并采用實時熒光定量PCR技術分析苦蕎VQ基因在上述2種葉斑病原和防御相關激素SA/JA/ET處理下的表達模式，為深入解析苦蕎VQ基因家族在植物抗病防御中的功能及機理奠定基礎，同時為優良基因資源發掘及抗病品種改良提供線索。

1 材料與方法

1.1 苦蕎VQ基因家族成員的鑒定

從Pfam數據庫（https://pfam.xfam.org/）下載獲得VQ保守結構域的隱馬爾可夫（HMM）文件（PF05678），基于VQ結構域文件的HMM文件，通過HMMER 3.0（http://hmmer.janelia.org/）對苦蕎基因組數據（http://mbkbase.org/Pinku1/）進行比對搜索和鑒定，參數為默認設置，并通過NCBI保守結構域數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd. shtml）和SMART數據庫（https://smart.embl-heidelberg. de/）對候選基因進行確證，剔除無VQ保守結構域的蛋白和重復的序列。擬南芥VQ蛋白序列從TAIR（http://www.Arabidopsis.org/）下載獲得，水稻VQ蛋白序列從Rice Genome Annotation Project Database（http://rice.plantbiology.msu.edu/）下載獲得。采用DNAMAN9軟件，對苦蕎VQ基因的開放讀碼框長度、蛋白質長度、分子量、等電點（）等理化性質進行預測。利用WOLF PSORT（http://www.genscript.com/ psort/wolf_psort.html）預測蛋白的亞細胞定位。

1.2 多重序列比對與進化樹分析

采用DNAMAN9軟件進行多重序列比對。基于鄰接法，采用MEGA7.0軟件構建苦蕎VQ蛋白系統進化樹以及苦蕎、水稻與擬南芥VQ蛋白的系統進化樹，Bootstrap校驗重復1 000次。

1.3 保守基序搜索與基因結構分析

利用MEME網站（http://meme-suite.org/tools/ meme-chip）分析VQ蛋白的保守基序，參數設定為：基序數3，基序長度范圍為10—50。將VQ基因序列及其編碼序列遞交至Gene Structure Display Server（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php），解析VQ基因結構，如內含子、外顯子與上、下游非翻譯序列。

1.4 染色體定位與基因重復分析

下載苦蕎染色體序列（http://mbkbase.org/Pinku1/），建立本地數據庫，以苦蕎VQ基因序列執行本地BLAST操作，獲取苦蕎VQ基因在染色體上的物理位置，并使用MapInspect軟件（http://www.plantbreeding. wur.nl/UK/software_mapinspect/）繪制染色體定位圖。若2個或以上基因在進化樹中處于同一進化分枝的最末端、且位于同一染色體小于100 kb的區域內，則視為串聯重復基因；如處于不同染色體的大片段重復區域，則視為片段重復基因。大片段重復信息源自Plant Genome Duplication Database（http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/）。

1.5 旁系同源與直系同源基因的鑒定

使用OrthoFinder工具鑒定苦蕎VQ旁系同源基因和苦蕎與擬南芥、水稻的直系同源基因。先在MEGA7.0中基于MUSCLE（CODONS）算法比對目標序列，然后利用KaKs_Calculator2.0生成非同義替換（Ka）值與同義替換（Ks）值。同源基因對之間的分歧時間（T）按T=Ks/（2×9.1）×10-9×10-6百萬年（Mya）計算[23]。

1.6 啟動子順式元件分析

從NCBI下載苦蕎VQ基因的啟動子序列（起始密碼子前1 500 bp），遞交至PLACE（https://www.dna. affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace）網站分析啟動子順式元件。

1.7 植物材料與處理

苦蕎平苦一號由山西農業大學農學院孫朝霞博士惠贈，種植于人工氣候室，培養條件為光照16 h/黑暗8 h，溫度（22±4）℃，光強100 μmol·m-2·s-1，相對濕度為60%。分別用0.2 mmol·L-1SA、0.1 mmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）、0.1 mmol·L-1乙烯利（ETH）對四葉期（約20 d）植株進行葉面噴施。苦蕎葉斑病原LS-1、BLS-1為經濟作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點實驗室保存。參照Shen等[22]方法培養和接種病原菌，于四葉期接種，在0、12、24和48 h取樣，-80℃保存備用。

1.8 總RNA提取、cDNA合成和qPCR分析

采用Plant Total RNA Extraction Kit試劑盒（Biospin）提取葉片總RNA。采用PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（Takara）說明書合成cDNA。在CFX96 PCR系統（Bio-Rad）上進行qPCR。反應體系總體積20 μL：正/反引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL、2×SuperReal PreMix Plus（Biospin）10 μL、cDNA模板（100 nmol·L-1）1 μL，用RNase-free的雙蒸水補齊體積。反應程序為95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，35個循環。溶解曲線：95℃ 1 min；65℃ 1 min；95℃ 20 s（步進0.5℃·s-1）；30℃ 1 min。以（FtPinG0006499300.01）為內參，設陰性對照和3次生物學重復，采用2-DDCT法計算基因相對表達量。與0 h比較，如果某一VQ基因在激素處理或病原接種12、24和48 h后，1個或以上時間點發生了4倍或以上的表達變化，則該基因定義為差異表達基因。采用SPSS21.0軟件進行數據處理與統計分析。引物見電子附表1。

2 結果

2.1 苦蕎VQ基因的鑒定

利用擬南芥VQ蛋白作為參考序列，對苦蕎基因組數據庫進行BLASTP搜索，經過HMM和SMART分析，最終鑒定獲得28個苦蕎VQ基因，并按其在染色體上的物理位置進行命名。基因大小為566—1 454 bp，CDS長度為249—1 083 bp（表1）。通過基因序列與全長CDS序列的比對，發現所有苦蕎VQ基因均不含內含子（圖1）。根據VQ保守基序的pfam（0678），在苦蕎基因組注釋[5]中搜索發現有27個VQ基因，除了（FtPinG0003287200）外，均與鑒定結果相對應。

2.2 苦蕎VQ蛋白結構分析

苦蕎VQ蛋白序列長度為82—360 aa，平均分子量為20.88 kD，除FtVQ19外，其余27個VQ蛋白的氨基酸數目均小于300；蛋白等電點（）為4.48— 11.09，71.4%（20/28）的苦蕎VQ蛋白的在7.0以上。亞細胞定位預測表明，21個苦蕎VQ蛋白定位在細胞核中，6個（FtVQ6、FtVQ9、FtVQ15、FtVQ18、FtVQ26和FtVQ28）定位在葉綠體中，1個（FtVQ14）定位在細胞質中（表1）。基于VQ保守結構域，進行多重序列比對（圖2）。所有苦蕎VQ蛋白的VQ基序為FxxxVQx（L/F/I/V/A/Y）TG結構，其中，LTG類17個，FTG類4個，YTG類2個，VTG和ATG類各1個。

基于全蛋白序列，構建系統進化樹，結果表明，苦蕎VQ蛋白分成5個亞家族（圖1），第Ⅰ組和第Ⅳ數量最多，均為8個，第Ⅲ組最少（2個）。FtVQ16在第Ⅲ組中單獨成枝，處于第Ⅲ組與第Ⅰ組之間；FtVQ13在第Ⅱ組中單獨成枝，處于第Ⅱ組與第Ⅰ組之間，表明這兩個VQ蛋白屬于相應組別之間的進化過渡類型。在同一進化末枝的VQ蛋白具有較高的序列保守性和較近的進化關系。

為進一步了解苦蕎VQ蛋白的結構多樣性，首先采用MEME軟件對苦蕎28個VQ蛋白的保守基序進行了分析，然后對每一個可能的基序再通過Pfam和SMART進行注釋，以確保預測的準確性。圖3顯示，在苦蕎VQ蛋白中發現3種基序，所有蛋白均含Motif 1，即VQ基序。除個別例外，同一亞家族或亞組的VQ蛋白所含的基序相似，如Ⅰ、Ⅱ（FtVQ14除外）、Ⅳ（FtVQ5除外）和Ⅴ只含Motif 1。Ⅲc和Ⅳa亞組含有3種基序。苦蕎VQ蛋白在保守基序種類和數量上的差異，反映這些蛋白在結構上的多樣性，預示它們具有不同的生物學功能。

2.3 苦蕎VQ基因在染色體上的分布與基因重復

苦蕎VQ基因不均勻地分布在8條染色體上，位于同一亞家族或進化分枝的VQ基因在染色體上也呈隨機分布（圖4）。第6染色體數量最多（7個），多數在其長臂的末端聚集；其次是第1染色體，有5個基因；第7染色體最少，僅有1個基因（）。

表1 苦蕎VQ基因及其序列特征

右圖黑色矩形表示編碼序列（CDS）；灰色矩形表示上、下游序列

FxxxVQxxTG基序高度保守。根據該保守基序的“TG”前面的第一個氨基酸將苦蕎VQ蛋白細分為LTG、FTG、ITG、VTG、ATG和YTG 6種類型

圖左為苦蕎VQ蛋白的進化樹。苦蕎蛋白劃分為5組，各組又劃分不同亞組。圖右為基于MEME分析得出的苦蕎VQ蛋白的3種主要的保守基序，每一保守基序分別用不同顏色的矩形框表示，未按比例繪制

重復的旁系同源VQ基因對用虛線連接The duplicated paralogous pairs of VQ genes are connected with gray-dotted lines

基因重復分析表明，苦蕎基因組有8對VQ旁系同源基因（表2）它們源于大片段重復（segmental duplication），位于不同染色體上的大片段重復區域的保守位置，提示大片段重復在苦蕎VQ基因數量擴張中發揮重要作用。

根據基因非同義突變和同義突變的比值（Ka/Ks），可以推測基因在進化過程經受何種選擇壓力[24]。一般情況下，如果Ka/Ks＞1，則認為有正選擇效應；Ka/Ks=1，則認為存在中性選擇；Ka/Ks＜1，則認為有純化選擇作用或負選擇。8對苦蕎VQ旁系同源基因的Ka/Ks為0.0260—0.7986（表2），提示這些基因對經歷了純化選擇作用或負選擇，估算它們發生重復的年代為45.77—278.83百萬年（Mya）。

2.4 苦蕎、擬南芥和水稻VQ蛋白的系統進化樹

為了分析苦蕎、擬南芥和水稻VQ蛋白之間的進化關系，將28個苦蕎VQ、34個擬南芥VQ和40個水稻VQ的蛋白序列，采用Mega7.0基于鄰接法構建了系統進化樹。圖5顯示，這些VQ蛋白可分為6個亞家族（Ⅰ—Ⅵ），其中第Ⅱ組成員最多（25個），第VI組成員最少（5個），每組都含有單子葉植物和雙子葉植物VQ蛋白，提示VQ蛋白的結構特征在單、雙子葉植物分開之前就已進化完成；然而第Ⅵ組不含苦蕎VQ蛋白，提示苦蕎VQ蛋白在結構上的多樣性不如擬南芥和水稻。在同一亞家族內，種內的VQ蛋白比種間更容易聚類在一起。苦蕎和擬南芥的VQ蛋白比水稻更容易聚類在一起。在進化樹末端，兩兩相聚的有6對苦蕎與擬南芥VQ蛋白：FtVQ25和AtVQ9、FtVQ26和AtVQ4、FtVQ5和AtVQ11、FtVQ19和AtVQ30、FtVQ7和AtVQ7、FtVQ22和AtVQ28，然而沒有一對苦蕎與水稻VQ蛋白，這與單、雙子葉植物的進化關系一致，同時暗示VQ蛋白在單、雙子葉植物分開后產生了進化上的分歧。

紅、綠和藍顏色分別表示擬南芥、水稻和苦蕎的VQ蛋白

表2 苦蕎旁系同源VQ基因

2.5 苦蕎VQ基因啟動子順式元件分析

選取苦蕎VQ基因起始密碼子上游1 500 bp作為啟動子序列，通過PLACE和PlantCARE，在線預測基因啟動子區域中的順式作用元件，主要考察病原和防御相關激素反應元件，包括病原響應元件BIHD1OS（TGTCA）、WBBOXPCWRKY1（TTTGACY），SA和病原響應元件WBOXATNPR1（TTGAC），JA、ET和H2O2響應元件CGCGBOXAT（(A/C/G)CGCG(G/T/C)），JA反應元件CGTCA，以及ET反應元件ERELEA4（AWTTCAAA）。結果表明，W-box類似元件—— WBOXATNPR1在28個苦蕎VQ基因的啟動子區域均有不同程度的分布；其次是BIHD1OS、CGTCA和ERELEA4，在28個苦蕎VQ基因啟動子中的分布數量分別為20、18和17；W-box——WBBOXPCWRKY1在12個苦蕎VQ基因啟動子中均有分布（圖6）。其中、、、、、等基因擁有較多且局部相對密集的病原或激素響應元件。病原與防御激素反應元件在苦蕎VQ基因啟動子區域中富集，提示苦蕎VQ基因的表達可能響應病原侵染和這些激素信號的刺激。

圖6 苦蕎VQ基因啟動子順式元件分析

2.6 苦蕎VQ基因在葉斑病原侵染和激素處理下的表達分析

采用qPCR技術分析苦蕎VQ基因家族成員在、侵染和SA、MeJA、ETH處理下的表達情況（圖7）。結果表明，在28個苦蕎VQ基因中，20個基因可以檢測到不同程度的表達，而其他8個基因（、、、、、、和）的表達未能被檢測到。

在侵染下，55%（11/20）的VQ基因為差異表達基因，其中8個基因表現為上調，以、、和上調程度最為顯著。3個基因（、和）的表達受到抑制，以最為顯著。在接種后，11個苦蕎VQ基因的表達上調，以誘導程度最高；其次是、、和。2個基因（和）的表達下調。有趣的是，在和侵染下，有7個基因（、、、、、和）表達上調趨勢相同，推測它們在對這兩種葉斑病原的防御反應中均可能起作用。

SA、JA和ET是植物抗病防御相關的3種重要的激素信號分子，它們廣泛介導植物對各種生物脅迫的響應[6]。75%（15/20）的苦蕎VQ基因響應SA處理，其中，10個基因表達上調。是上調最顯著的基因其次是和。在MeJA處理下，65%（13/20）的苦蕎VQ基因的表達被誘導，以、和的誘導最為顯著，其次是、、和。13個苦蕎VQ基因響應ETH處理，其中12個基因的表達為上調，其中、、和的表達上調幅度較大。有趣的是，在被ETH誘導的VQ基因中，有8個（、、、、、、和）與MeJA是相同的。上述發現進一步提示，部分苦蕎VQ基因可能介導了苦蕎對葉斑病原的抗性反應。

A：互格鏈格孢（Aa）；B：黑孢霉（No）；C：水楊酸（SA）；D：茉莉酸甲酯（MeJA）；E：乙烯利（ETH）。圖上部的顏色尺表示不同表達數值的log2值，藍色表示低表達水平，紅色表示高表達水平

3 討論

3.1 苦蕎VQ基因數量與基因重復

本研究利用生物信息學工具對苦蕎VQ基因家族進行了全面系統鑒定，共鑒定獲得了28個苦蕎VQ基因。Zhang等[5]未將FtPinG0003287200（）注釋為VQ基因，疑為漏注，因為FtVQ27的確含有典型的VQ基序（圖3）苦蕎基因組（489 Mb）比擬南芥（125 Mb）和水稻（389 Mb）大，然而其VQ基因家族成員卻比擬南芥（34個）[3]和水稻（40個）[8]少，因此，植物中VQ基因數量與基因組大小無簡單的線性關系。葡萄基因組475 Mb，其VQ基因僅18個[17]；大豆基因組比玉米基因組小，然而其VQ基因數量（74個）[9]卻比玉米（61個）[15]多。可能是遠古時代的植物基因組重復事件造成的。例如，大豆在接近14和42 mya前經歷了2次大規模的基因組重復事件。事實上75%的大豆VQ基因有一個或多個在結構上十分類似的旁系同源物[8]。盡管苦蕎基因組為64.42—70.77 mya同樣經歷了全基因組重復事件，然而在其后頻繁的染色體區域的重排過程中，重復的基因拷貝多數丟失或移至新的位點[5]。基因重復分析的結果證明了這一點，在苦蕎VQ基因家族中，有8對旁系同源基因，其中無一串聯重復（表2）。包括串聯和大片段重復在內的基因重復事件是基因家族成員數量擴張的重要原因[25]，由于重復基因在染色體上所處微環境的進化壓力不同，在進化過程中產生分歧，形成新的基因；或者失去功能，導致假基因的產生；或者在染色體重排中丟失。在陸地棉的At和Dt亞基因組中，分別有60.5%和63.0%的VQ基因是重復基因[18]。因此，可以推測，大片段基因重復在苦蕎VQ基因進化和數量擴張中扮演了重要角色。在楊樹[14]、蒺藜苜蓿[21]和甜瓜[26]VQ基因家族的進化分析中也有類似結論。Ka/Ks是分析基因重復事件中選擇壓力的基礎[24]。所有的8對苦蕎VQ旁系同源基因的Ka/Ks值小于1（表2），提示它們在進化中承受了純化選擇或負選擇。

3.2 苦蕎VQ蛋白家族的系統進化

VQ蛋白的結構保守性在單、雙子葉植物產生分歧之前就已經建立。一些真菌中也發現了VQ基因[27]。苦蕎、擬南芥和水稻VQ蛋白家族的系統進化分析表明，VQ蛋白分為6個亞家族，單、雙子葉植物的VQ基因在各個亞家族中均有不同數量的分布（圖5），一方面說明VQ基因在進化上的保守性，另一方面也反映了不同物種的VQ基因沿著多樣化進化路線發展，造成了除VQ結構域以外的結構多樣化，這與VQ基因在功能上的多樣性相適應。在苦蕎和擬南芥基因組中發現了5對直系同源基因，在苦蕎和水稻基因組中發現了3對直系同源基因（電子附表2），提示這些存在于不同物種中的直系同源基因來自于共同的祖先基因；它們之間的Ka/Ks均小于1（表2），表明它們經歷了純化選擇或負選擇。苦蕎與擬南芥的VQ蛋白，以及種內（特別是水稻）的VQ蛋白傾向于聚類在一起，表明祖先VQ基因在單、雙子葉植物中發生了進化分歧。有趣的是，苦蕎VQ蛋白在結構上的多樣性似乎不如擬南芥和水稻。這可以從以下3個方面加以說明。首先，在3個物種的VQ蛋白進化樹中，第Ⅳ組包含擬南芥和水稻VQ蛋白，而不含苦蕎VQ蛋白（圖5）。其次，無內含子是植物中大多數VQ基因的共同特征[2]，在已鑒定的植物VQ基因家族中或多或少存在含內含子的VQ基因。然而苦蕎VQ基因均不含內含子，提示在苦蕎VQ基因的進化過程中，發生了內含子的丟失現象。Song等[15]根據玉米中6個含有內含子的VQ基因在與擬南芥和水稻VQ基因的進化樹中分散分布，提出在玉米、擬南芥和水稻中VQ基因內含子是最近且相對獨立地獲得的觀點。苦蕎VQ基因無內含子的結果不支持這種假設。

3.3 部分苦蕎VQ基因在病原及激素處理下的表達上調

一些植物的VQ基因在病原侵染下被誘導表達。Li等[8]證實，部分水稻VQ基因的表達受白葉枯病菌（pv.）、條斑病菌（.pv.）和稻瘟病菌（）誘導。在25個草莓VQ基因中，有14個基因的轉錄水平在炭疽病菌（spp.）自然侵染的組織中明顯上調[19]。生化和遺傳分析表明，VQ蛋白是植物防御過程中的重要調節者[2]。Uji等[28]證明，OsVQ13在水稻對白葉枯病的抗性中發揮正調節子的功能。本研究中，分別有8和11個苦蕎VQ基因在和的侵染下轉錄水平顯著提升，其中有7個基因是相同的，提示這些VQ基因可能參與了苦蕎對葉斑病的抗病反應。、和的表達上調程度最為明顯，這些基因在苦蕎對葉斑病的抗性反應中的作用值得關注。

植物VQ基因參與抗病防御往往與SA、JA與ET激素信號密切關聯。在楊樹中，部分VQ基因響應SA處理[14]。在大豆中，大部分的VQ基因至少在一個處理時間點受SA 2倍以上的誘導，一些VQ基因響應JA和ET[9]。類似的結果在擬南芥[3]和草莓[19]中也有發現。本研究中，分別有55%、60%和55%的苦蕎VQ基因在SA、MeJA和ETH處理下表達上調（圖7）。SA和JA信號通路間通常拮抗，JA和ET信號通路往往協同[6]。本研究表明，多個VQ基因的表達單獨受SA、JA或ET的影響，也有成員受2種甚至3種激素的共同影響，從側面也印證了這些激素之間的協同或拮抗關系。例如，受SA和ETH誘導，受SA和MeJA誘導，受MeJA和ETH誘導，提示這些基因可能通過相應的激素信號或組合參與對葉斑病的抗性反應。值得注意的是，和同時在2種病原和3種激素的處理下顯著上調，至于它們是否通過SA、JA/ET信號的協同作用參與對葉斑病原的防御反應有待進一步的研究。

在苦蕎旁系同源的VQ基因對中，表達不盡相同。例如，在SA處理下，的表達上調，而其旁系同源基因的表達卻下調。在和侵染下，的表達被顯著誘導，而其旁系同源基因的表達則無明顯變化（圖7）。這可能是因為它們所處的啟動子環境不同有關。在楊樹[14]和大白菜[16]VQ基因中，一些旁系同源基因有相似的表達特征，也有一些基因的表達存在明顯差異。

3.4 響應葉斑病原的苦蕎VQ基因啟動子中富集W-box

基因對多種環境刺激的響應與其啟動子區域的順式元件類型與排列密切相關。本研究中，苦蕎VQ基因啟動子順式元件預測從側面印證了基因表達分析的結果，盡管這些元件的數量與基因的表達強度之間不存在很好的對應關系。在響應激素或病原處理的苦蕎基因中含有相當數量的激素或病原反應元件，如受顯著誘導的、含有15個這樣的反應元件（圖6）。值得指出的是，在響應和的14個苦蕎VQ基因的啟動子中，存在相當數量的W-box及類似元件（WBBOXPCWRKY1和WBOXATNPR1），平均每個啟動子達4.9個（圖6）。資料表明，在受SA和病原誘導的擬南芥VQ基因的啟動子序列中，W-box元件平均接近3.8，高于統計學預期[3]。已知，W-box及類似元件是WRKY轉錄因子特異性的結合位點[29]。VQ蛋白可與第Ⅰ組WRKY或第Ⅱ組WRKY的C端WRKY結構域互作[3]。該類元件在響應病原的苦蕎VQ基因的啟動區域富集，一方面印證了這些基因在病原侵染下的表達特征（圖7）；另一方面也暗示某些未知的WRKY蛋白可能通過結合這些VQ基因啟動子中的W-box及類似元件，從而調節VQ基因的表達。有關苦蕎VQ基因在葉斑病抗性反應中的詳盡功能尚待研究。

4 結論

從最近公布的苦蕎基因組中鑒定了28個VQ基因，歸類于3個亞家族（Ⅰ—Ⅲ）。它們均不含內含子，編碼蛋白也不含VH變異類型。大片段基因重復是苦蕎VQ基因數量擴張的重要原因，旁系同源VQ基因的進化經歷了純化選擇。55%—75%苦蕎VQ基因響應SA、JA、ET或葉斑病原，其中大多數的表達顯著上調，表明它們可能在苦蕎對葉斑病原的防御反應中發揮重要的調節功能。

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Genome-Wide Identification of VQ Gene Family inand its Expression Profiles in Response to Leaf Spot Pathogens

ZHENG Fengsheng1, WANG Haihua1,2, WU Qingtao1, SHEN Quan1,2, TIAN Jianhong1, PENG Xixu1,3, TANG Xinke1,3

1School of Life Science, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, Hunan;2Key Laboratory of Genetic Improvement and Multiple Utilization of Economic Crops in Hunan Province, Xiangtan 411201, Hunan;3Key Laboratory of Ecological Remediation and Safe Utilization of Heavy Metal-polluted Soils, College of Hunan Province, Xiangtan 411201, Hunan

【】VQ gene family plays important roles in plant growth, development and responses to biotic or abiotic stress. The aim of this study is to comprehensively identifyL. Gaertn. VQ (FtVQ) gene family on genome-wide scale and analyze its expression profiles under challenge of leaf spot pathogensand,and treatment of defense-related hormones, such as salicylic acid (SA), jasmonic acid (JA) and ethylene (ET), thus providing a solid foundation not only for further elucidation possible roles of members of the VQ genes in defense response to leaf spot pathogens and underlying mechanisms in tartary buckwheat, but also for mining gene resources of breeding for crop disease resistance. 【】Based on the Hidden Markov Model profile of the conserved VQ domain (PF05678), HMMER 3.0 software was used to identify FtVQ genes fromcv. Pinku1 genome database. Bioinformatic tools such as DNAMAN, MapInspect, MEGA, MEME, OrthoFinder and PLACE were used to analyze gene structure, chromosomal location of genes,-elements of gene promoters, physicochemical properties of proteins, conserved motifs of proteins, subcellular localization of proteins, and phylogenetic relationships. Quantitative real-time PCR (qPCR) was employed to analyze the expression profiles of leaf FtVQ genes of tartary buckwheat plants under infection of the pathogens and treatment of the hormones. 【】A total of 28 VQgenes were identified in the genomes of tartary buckwheat, with the gene size ranging from 566 to 1454 bp. The FtVQ genes contain no introns, and distribute unevenly on chromosomes 1-8. According to their physical locations on the chromosomes, the FtVQ genes were named fromto. Each of the FtVQ proteins has a highly conserved VQ motif FxxxVQx (L/F/I/V/A/Y) TG, where x represents any amino acid. Analysis of subcellular localization showed that 21 FtVQ proteins were predicted to the nucleus, and the others to the chloroplasts or cytoplasm. Based upon their amino acid sequence and presence of various conserved motifs, the FtVQ proteins were classified into five subfamilies (Ⅰ-Ⅴ). Each subfamily shared relatively conserved gene structures and protein motifs. The analysis of gene duplication revealed thatgenome had 8 pairs of paralogous pairs, all of which were segmental duplicated genes, suggesting that segmental duplication played major roles in FtVQ gene expansion. The ratio of nonsynonymous to synonymous substitutions (Ka/Ks) of paralogous pairs was less than 1, suggesting that they underwent purifying pressure during the evolution process. Prediction of-elements showed that pathogen-, SA-, JA-, or ET-responsive elements, such as BIHD1OS, CGTCA, ERELEA4, W-box and W-box-like sequences, were present within the promoters of all the FtVQ genes. Especially,,,,,andcontained more elements in their promoter regions. 55% to 70% of the detectablegenes were differentially expressed genes (DEGs), and 72.7% to 85.7% of the DEGs were significantly induced on the level of transcription under the infection of leaf spot fungiand, or the treatment of SA, methyl jasmonate and ethephon. 【】The tartary buckwheat genome contains 28 members of VQ gene family. Some FtVQ genes may be involved tartary buckwheat defense response to leaf spot pathogens.

tartary buckwheat ((L.) Gaertn.); VQ gene family;leaf spot;leaf spot; defense-related hormones

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.19.002

2021-02-25；

2021-06-07

國家重點研發計劃（2017YFE0117600）、湖南省教育廳重點科研項目（19A176）

鄭逢盛，E-mail：13647321087@163.com。通信作者王海華，Tel：0731-58291524；E-mail：hhwang@hnust.edu.cn。通信作者唐新科，Tel：0731-58290476；E-mail：xinketang@126.com

（責任編輯 李莉）