伏核神經細胞GalR2介導針刀干預神經病理性痛大鼠的鎮痛作用

劉亞南 ，楊 雙 ，董 瑋 ，李崇陽 ，徐世蓮

（1）昆明醫科大學基礎醫學院生理學系，云南 昆明 650500；2）云南中醫藥大學第三附屬醫院骨傷科，云南 昆明 650041；3）云南省第二人民醫院腫瘤科，云南 昆明 650021）

國際疼痛研究會2011年將由軀體感覺神經系統的損傷或疾病而直接造成的疼痛定義為神經病理性痛[1]。目前臨床治療神經痛的藥物主要包括阿片類鎮痛劑、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-Daspartic acid，NMDA）受體阻斷劑、鈉離子通道阻斷劑等。這些藥物對某些病人能產生短時的鎮痛作用，但其副作用也是十分明顯的，如鎮靜、惡心、腹瀉、眩暈以及阿片類鎮痛劑長期應用可發生耐受、心理/生理依賴、戒斷綜合征和自身覓藥行為。

小針刀（Small needle knife）療法是我國朱漢章教授在1976年總結實踐經驗，在中醫基礎理論指導下，吸收現代科學技術及西醫學的新成果，將手術刀的“刀”與針灸的“針”巧妙融為一體的先進治療方法[2]。該療法將小針刀刺入到病變組織進行松解、切割和剝離，以達到止痛祛病的目的[3]，具有見效快、方法簡便、療程短、痛苦小、價格低、無毒副作用等優點，因此在臨床應用越來越廣泛。與其臨床應用蓬勃發展的良好態勢相比，針刀療法的實驗研究相對滯后。研究報道針刀治療可促進內源性阿片肽、β-內啡呔、亮氨酸-腦腓呔釋放[4-5]，從而參與內源性鎮痛。

甘丙肽（Galanin）是一種由29個（人類為30個）氨基酸組成的神經活性肽，廣泛分布于中樞神經系統和外周組織。甘丙肽通過激活其受體，具有神經內分泌調節、攝食和代謝、認知等多種生物學作用。甘丙肽受體（galanin receptors，GalRs）有3種：GalR1、GalR2、GalR3。筆者所在實驗室前期的研究表明：在伏核，甘丙肽通過激活其受體對神經病理性痛具有明顯的鎮痛作用[6-7]。本實驗研究針刀治療神經痛是否通過促進伏核神經細胞甘丙肽的釋放，轉而激活其受體來完成。

伏隔核（nucleus accumbens，NAc），也稱為伏核，位于尾狀核頭部、殼核的前部，側面與透明隔相接，左右對稱，在大腦獎賞效應、藥物成癮、認知等功能活動中起重要作用[8-9]。越來越多的研究表明，伏核在痛覺調制中具有重要作用[10-11]。本研究通過坐骨神經痛大鼠模型，檢測針刀治療對神經痛大鼠伏核神經細胞GalR2的表達的影響，并于伏核內注射甘丙肽受體的非特異性阻斷劑Galantide及GalR2的特異性阻斷劑M871，研究甘丙肽及GalR2介導針刀療法對神經痛的鎮痛作用，為針刀治療神經痛的作用機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物實驗使用體重（180～220）g的SD雄性大鼠，體重：（180～250）g年齡：（1.5～2）月。購于昆明醫科大學實驗動物中心。實驗期間大鼠分籠飼養，自由取食和飲水，自然光照，室溫維持在適宜溫度（22±1）℃。所有動物實驗步驟均遵循國際疼痛研究協會以及昆明醫科大學實驗動物倫理委員會管理規定。

1.1.2 實驗藥品M871（[galanin（2-13）-Glu-His-（Pro）3-（Ala-Leu）2-Ala-amide]，Tocris，美國）；Galantide（[galanin（1-13）-substrate P（5-11）amide]，MCE，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 行為學測試方法使用智能熱板儀（YLS-6B，濟南益延科技有限公司）測試大鼠對傷害性熱刺激誘導的后爪縮爪潛伏期（hind paw withdrawal latency，HWL）。熱板溫度維持在（52±0.2）℃。使用Randall-Siletto痛覺測試儀（37 215，意大利UGO Basil 公司）測試大鼠對傷害性機械壓力刺激誘導的后爪縮爪閾值（hind paw withdrawal threshold，HWT）。

實驗前對大鼠進行5 d的行為學測試訓練。每天訓練3輪，每輪3次。訓練后大鼠HWL保持在3～6 s之間，HWT保持在4～7 g之間。每次測試要求不超過15 s或15 g，以防止造成大鼠后爪組織損傷。

1.2.2 神經病理性痛動物模型的構建采用坐骨神經部分結扎（chronic constriction injury，CCI）制作神經病理性痛動物模型[12]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進行麻醉，在其左側大腿中部暴露（8～10）mm長的一段坐骨神經，用4號羊腸線每隔（1.0～1.5）mm輕度結扎神經，共結扎4圈。結扎時看見后肢抽動，神經輕度凹陷即可，最后用4號絲線縫合皮膚。

1.2.3 伏核埋管及微量注射CCI大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，將其固定于腦立體定位儀，根據大鼠腦定位圖譜確定伏核定位點（B：+1.7 mm，L or R：1.6 mm，V：7.0 mm。B：前囟向前（+）或向后（-），L or R：中線旁開，V：顱骨平面向下）。標記位點，用骨鉆在標記點鉆孔，將外徑0.8 mm的不銹鋼套管垂直插入，并用牙科水泥固定套管。

術后大鼠恢復2～3 d后進行伏核內微量注射。注射前，每只后爪分別測量3次HWL和HWT，取平均值作為基礎值，伏核內注射15，30，45，60 min后分別測量雙側HWL和HWT，將給藥后不同時間點的HWL和HWT換算成變化百分率，即：

實驗結束后，對伏核注射位點進行鑒定，經鑒定注射位點在大鼠伏核組織內的數據方可納入統計，見圖1。

圖1 伏核定位圖Fig.1 Illustration of the location of the injection needle tips

1.2.4 小針刀療法為了將CCI大鼠隨機分為3組，針刀治療后分別進行伏核內注射1 μL：（1）生理鹽水作為對照組（n=7）；（2）1 nmoL的甘丙肽非特異性阻斷劑Galantide（n=6）；（3）2 nmoL的Galantide（n=6）。研究CCI大鼠伏核神經細胞的甘丙肽及其受體是否介導針刀療法對神經痛的鎮痛作用。隨后，為了進一步研究GalR2的激活是否介導了針刀干預神經痛的作用，將CCI大鼠隨機分為2組，針刀治療后分別進行伏核內注射（1）1 μL乙腈（6%）作為對照組（n=8）；（2）2 nmoL的 GalR2特異性阻斷劑M871（n=8）。

針刀治療時對大鼠進行觸診，在其坐骨神經結扎周圍找到條索狀物并用龍膽紫定點，每次選1～2個點，常規備皮、消毒，用針刀縱向疏通及橫向剝離周圍組織，出針后以消毒棉簽按壓針眼孔片刻后，在腿部肌肉注射 0.2 mL 青霉素鈉（80萬U），以預防感染。每周治療1次，共3次。

1.2.5 蛋白質印跡法將CCI大鼠隨機分為3組：治療組（n=3），CCI大鼠在造模第10天行針刀干預治療，每周1次，連續3次；模型組（n=3），僅左側坐骨神經結扎造模，不進行針刀干預治療；對照組（n=3），CCI大鼠在造模第10天僅針刀插入，不行縱向疏通及橫向剝離。在第3次針刀干預術后取各組大鼠雙側伏核組織，Western blot（WB）法檢測伏核神經細胞GalR2（兔多克隆抗體，1∶2 000，Abcam，英國）的表達水平，并且以 GAPDH（鼠單克隆抗體，1∶10 000，CST，美國）為內參作為對照，用 Image J 軟件分析條帶，表達結果重復3次以上。數據采用單因素方差分析進行統計，

1.3 統計學處理

數據以均數±標準誤（mean ± S.E.M.）表示，應用GraphPad Prism 5 軟件進行統計分析。組間差異采用雙因素方差分析（Two-way analysis of variance）或單因素方差分析（One-way analysis of variance）進行組間比較。檢驗水準為α=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCI大鼠伏核內注射甘丙肽非特異性阻斷劑Galantide對針刀療法鎮痛作用的影響

與“針刀治療+生理鹽水”對照組相比，CCI大鼠伏核內注射2 nmoL的Galantide可明顯減弱針刀治療引起的HWL（左側：P＜ 0.001；右側：P＜ 0.05）和HWT（左側：P＜ 0.01；右側：P＜0.05）的延長，但注射1 nmoL的Galantide差異沒有顯著性（P＞ 0.05）。如圖2所示，組間比較采用雙因素方差分析方法比較。該結果表明CCI大鼠伏核甘丙肽受體的激活可能介導針刀干預神經痛的鎮痛作用。

2.2 針刀干預對CCI大鼠伏核神經細胞GalR2表達的影響

如圖3所示，與模型組及對照組相比，針刀治療組大鼠伏核神經細胞GalR2的表達增加（P＜0.01），但比較模型組和對照組GalR2的表達，差異沒有顯著性（P＞ 0.05）。數據采用單因素方差分析進行統計。以上實驗結果提示提示針刀治療神經痛可能通過激活伏核神經細胞GalR2來介導完成。

圖3 針刀干預對CCI大鼠伏核神經細胞GalR2表達的影響Fig.3 Effect of needle knife therapy on GalR2 expression in NAc of CCI rats

2.3 CCI大鼠伏核內注射GalR2的特異性阻斷劑M871對針刀鎮痛作用的影響

與“針刀治療+乙腈”對照組相比，CCI大鼠伏核內注射2 nmoL的 M871可明顯減弱針刀治療引起的HWL（左側：P＜ 0.001；右側：P＜ 0.001）和HWT（左側：P＜ 0.001；右側：P＜ 0.01）的延長，如圖4所示，差異采用雙因素方差分析方法比較。該結果進一步表明CCI大鼠伏核神經細胞GalR2的激活介導針刀干預對神經痛的鎮痛作用。

圖4 CCI大鼠伏核內注射M871對針刀鎮痛作用的影響Fig.4 Effects of intra-NAc injection of M871 on the analgesia of needle knife in CCI rats

3 討論

目前臨床治療神經病理性疼痛的藥物副作用明顯，因而大大限制了它們的應用。尋找持續有效且具有臨床應用前景的治療手段或藥物，闡明其作用機制，已成為目前亟待解決的問題。

小針刀療法是中西醫結合的一種療法，它既保留了傳統醫學的優勢，又采用了現代醫學的優點，可以起到某些切開手術和針灸難以單獨達到的治療效果。大量的臨床研究資料表明小針刀治療對改善諸如椎管狹窄、椎間盤突出癥、帶狀皰疹后神經痛等所致的疼痛癥狀和功能障礙療效顯著[13-19]。但有關小針刀療法的實驗研究尚處于起步階段，小針刀療法對神經病理性痛的鎮痛作用及其作用機制尚未得到明確的闡釋。因而限制了其在臨床的推廣和應用。研究顯示針刀治療能使第3腰椎橫突綜合征動物模型局部組織中的白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β等炎性細胞因子產生，從而改善局部炎癥反應[20]。郭長青等[5]報道針刀治療可促進內源性阿片肽前體基因的表達，從而合成和釋放更多的內源性阿片肽，參與針刀治療的中樞鎮痛作用。針刀松解法在治療坐骨神經結扎大鼠過程中，能促進中樞β-內啡呔、亮氨酸-腦腓呔釋放[5]。這些研究提示，針刀療法可能通過促進內源性鎮痛物質的釋放，從而參與鎮痛。

甘丙肽是一種重要的神經肽，越來越多的研究表明甘丙肽在痛覺調制中具有重要作用。筆者所在實驗室前期的研究發現在正常大鼠、炎癥痛大鼠及CCI大鼠伏核內注射甘丙肽具有明顯的鎮痛作用[7,21-22]。本實驗研究探索針刀療法是否通過促進伏核神經細胞甘丙肽的釋放來干預神經痛。

甘丙肽在痛覺調制中的作用可能和甘丙肽作用于不同的GalR有關。研究報道與正常大鼠比較，在鹿角菜堿所致炎癥痛大鼠與CCI大鼠，伏核神經細胞甘丙肽、GalR1和GalR2的表達都上調[6,7,22-23]，表明伏核神經細胞甘丙肽及其受體在痛覺調制中具有重要作用。本實驗研究結果首先發現，與“針刀治療+生理鹽水”對照組比較，CCI大鼠針刀治療后伏核內注射GalRs的共同阻斷劑Galantide（“針刀治療+Galantide”）明顯減弱針刀對CCI大鼠的鎮痛作用，且呈劑量依賴性（圖2）。先前的研究報道在CCI大鼠伏核內注射GalR2的特異性激動劑M1145具有鎮痛作用，而注射M1145后再注射GalR2的特異性拮抗劑M871則能逆轉M1145引起的鎮痛作用，表明伏核神經細胞GalR2的激活對CCI大鼠具有鎮痛作用[23]。本實驗研究發現CCI大鼠行針刀治療后伏核神經細胞GalR2的表達增加（圖3），并且在對CCI大鼠行針刀干預治療后，于伏核內注射M871（針刀治療+M871）阻斷GalR2的激活，結果發現與“針刀治療+乙腈”對照組比較，針刀治療后伏核內注射M871削弱了針刀對CCI大鼠的鎮痛作用（圖4），這些結果提示伏核神經細胞GalR2的激活在針刀干預神經痛中具有重要作用。

綜上所述，CCI大鼠伏核內注射Galantide阻斷甘丙肽受體后能削弱針刀治療神經痛的作用；且針刀治療引起CCI大鼠伏核神經細胞GalR2的表達上調，CCI大鼠伏核內注射GalR2的特異性阻斷劑M817明顯減弱了針刀療法對神經痛的鎮痛作用，這些研究都提示在CCI大鼠，針刀干預可能通過促進伏核神經細胞甘丙肽的釋放，進而激活GalR2介導來針刀對神經痛的鎮痛作用，但有關GalRs的激活介導針刀對神經痛的鎮痛作用機制，有待進一步深入研究。