1 800 MHz射頻電磁場(chǎng)暴露對(duì)大鼠海馬GFAP、NCAM和GABA受體表達(dá)的影響

張盛慶宇 ，舒 逍 ，吳錫南 ，李志強(qiáng) ，武慧欣 ，張 媛 ，蔣玉融 ，楊思佳 ，木云珍

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；2）研究生院；3）生物醫(yī)學(xué)工程研究中心；4）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

射頻電磁場(chǎng)（radiofrequency electromagnetic field，RF）是指頻率在100 kHz～300 GHz的電磁場(chǎng)，主要由手機(jī)、基站等通訊設(shè)備產(chǎn)生[1]。相關(guān)研究報(bào)道，長(zhǎng)期的射頻電磁場(chǎng)暴露可能對(duì)生物體的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等方面均有不同程度的影響[2]。機(jī)體大腦是對(duì)射頻電磁場(chǎng)敏感的器官之一[3]，腦組織受到射頻電磁場(chǎng)后，會(huì)出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能的改變，這是射頻電磁場(chǎng)生物學(xué)效應(yīng)的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。膠原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異性的中間絲蛋白，隨著生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程發(fā)生變化，并在神經(jīng)退行性病變過(guò)程中發(fā)生相應(yīng)改變[4]。神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）是成人神經(jīng)可塑性的主要貢獻(xiàn)者，可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)、神經(jīng)發(fā)育以及與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能下降等過(guò)程[5-6]。γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，許多研究都已經(jīng)證實(shí)GABA與認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[7-8]。本研究通過(guò)觀察SD大鼠暴露后的體重及其海馬內(nèi)的GFAP、NCAM和GABA受體的變化，評(píng)估射頻電磁場(chǎng)對(duì)大鼠的生理發(fā)育指標(biāo)和海馬體的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

14只7周齡SPF級(jí)SD大鼠，雄鼠體重均在250～270 g，雌鼠體重均在200～220 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供［動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005］。適應(yīng)環(huán)境1周后，分為暴露組和對(duì)照組，每組7只。暴露組雌雄比例3∶4，對(duì)照組雌雄比例4∶3。每天暴露時(shí)間固定12 h（20:00～8:00），持續(xù)3周。

1.2 暴露裝置

射頻電磁場(chǎng)暴露裝置如之前研究所描述[9]，由惠普公司生產(chǎn)的信號(hào)發(fā)生裝置（8614A Signal Generator 0.8～2.4 GHz）連接1個(gè)放大器（SCD Amplificateur Lineaire 1.3～2.6 GHz Made France）產(chǎn)生頻率1 800 MHz微波，功率密度為0.5 mW/cm2。

1.3 主要儀器與試劑

兔抗鼠GFAP多克隆抗體（武漢博士德公司），山羊抗兔SP免疫組化試劑盒和DAB染色劑（福州邁新公司），多聚甲醛、明膠等免疫組化實(shí)驗(yàn)常規(guī)試劑均為分析純，8592C頻譜分析儀（惠普，美國(guó)），Model7620微波輻射測(cè)試儀（Narda，美國(guó)），8614A信號(hào)發(fā)生裝置、信號(hào)放大器（惠普，美國(guó)），TX-B8H WiFi 2 400 MHz 發(fā)射裝置（深圳市特信電子有限公司，中國(guó)），CM1900冰凍切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司），90i攝影生物顯微鏡（日本尼康公司），Image Pro Plus 6.0病理圖像分析系統(tǒng)（美國(guó) Media Cybernetics 公司）。

1.4 大鼠海馬組織CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)GFAP表達(dá)的測(cè)定

1.4.1 取材大鼠用戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，解剖后經(jīng)主動(dòng)脈插管，用4%多聚甲醇溶液（pH=7.4）灌流固定，斷頭取腦，浸入裝有多聚甲醇溶液的容器中，放在4 ℃冰箱中后固定

1.4.2 組織切片將固定好的腦組織塊應(yīng)用梯度蔗糖溶液脫水至腦組織沉底，隨后將大鼠海馬組織從腦組織中分離，再用冰凍切片機(jī)將海馬組織沿長(zhǎng)軸方向行20 μm厚的連續(xù)冠狀切片，每個(gè)海馬組織取20～30張切片，將切片放入0.01 ml/L磷酸鹽緩沖液中孵育保存并盡快測(cè)定。

1.4.3 免疫組化染色使用免疫組化反應(yīng)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法（streptavidin-peroxidase method，SP法）進(jìn)行染色，按說(shuō)明書操作。用PBS沖洗，加一抗（1∶4 000）4 ℃過(guò)夜。再次用PBS沖洗，二抗37 ℃ 2 h。常規(guī)脫水，透明，封片。

1.4.4 圖像及分折每張切片分別在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、DG區(qū)隨機(jī)選取2個(gè)視野攝片，每張切片拍攝6次。拍片時(shí)均使用研究級(jí)顯微鏡，預(yù)實(shí)驗(yàn)找到最佳拍攝條件后，所有標(biāo)本均按此條件進(jìn)行拍片。拍攝完成后用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖片分析，測(cè)定GFAP、NCAM、GABA陽(yáng)性染色平均光密度值（mean optical density，MOD），然后求6個(gè)視野所測(cè)MOD值的平均值，此平均值即為該區(qū)域的最終MOD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0錄入數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。如數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜ 0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般結(jié)果

各組未發(fā)現(xiàn)老鼠出現(xiàn)死亡和其他異常情況，外觀正常。各組體重指標(biāo)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞ 0.05），2組大鼠的體重?zé)o明顯不同，見表1。

表1 大鼠一般情況分析（）Tab.1 General situation analysis of rat（）

表1 大鼠一般情況分析（）Tab.1 General situation analysis of rat（）

2.2 GFAP在大鼠海馬各區(qū)的表達(dá)

GAFP在大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)均有表達(dá)，陽(yáng)性免疫組化染色結(jié)果呈褐色或棕褐色，形似蜘蛛，見圖1。

圖1 GFAP在大鼠海馬各區(qū)的表達(dá)（SP法染色，×400）Fig.1 Expression of GFAP in rat hippocampus（SP，×400）

2.2.1 GFAP在大鼠海馬各區(qū)MOD結(jié)果比較海馬各區(qū)GFAP經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組相比，CA1區(qū)、DG區(qū)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），CA3區(qū)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。經(jīng)射頻電磁輻射21 d，暴露組大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)GFAP的表達(dá)下降，見表2。

表2 大鼠海馬不同區(qū)域的GFAP表達(dá)MOD值（）Tab.2 MOD value of GFAP expression in different regions of rat hippocampus（）

表2 大鼠海馬不同區(qū)域的GFAP表達(dá)MOD值（）Tab.2 MOD value of GFAP expression in different regions of rat hippocampus（）

與對(duì)照組相比，*P ＜ 0.05。

2.3 NCAM在大鼠海馬各區(qū)的表達(dá)

NCAM受體在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)均有表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)免疫組化呈棕色或棕褐色，形狀為顆粒狀，見圖2。

2.3.1 NCAM免疫組織MOD結(jié)果比較NCAM表達(dá)的海馬各區(qū)MOD值經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。經(jīng)射頻電磁輻射21 d，暴露組大鼠海馬各區(qū)NCAM的表達(dá)無(wú)改變，見表3。

表3 大鼠海馬不同區(qū)域的NCAM表達(dá)MOD值（）Tab.3 MOD value of NCAM expression in different regions of rat hippocampus（）

表3 大鼠海馬不同區(qū)域的NCAM表達(dá)MOD值（）Tab.3 MOD value of NCAM expression in different regions of rat hippocampus（）

2.4 GABA在海馬各區(qū)的表達(dá)

GABA 受體在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)均有表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)免疫組化呈棕色或棕褐色，形狀為顆粒狀，見圖3。

圖3 GABA在大鼠海馬各區(qū)表達(dá)（免疫組化SP法染色，×400）Fig.3 The expression of GABA in rat hippocampus（SP，×400）

2.4.1 GABA免疫組織MOD值比較結(jié)果GABA表達(dá)的海馬各區(qū)MOD值經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如下，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。經(jīng)射頻電磁輻射21 d，暴露組大鼠海馬各區(qū)NCAM的表達(dá)無(wú)改變，見表4。

表4 大鼠海馬不同區(qū)域的GABA表達(dá)MOD值（）Tab.4 MOD value of GABA expression in different regions of rat hippocampus（）

表4 大鼠海馬不同區(qū)域的GABA表達(dá)MOD值（）Tab.4 MOD value of GABA expression in different regions of rat hippocampus（）

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)選擇的GFAP、NCAM、GABA受體變化可反應(yīng)RF-EMF對(duì)腦部的損傷程度暴露條件，模擬人群所處的1 800 MHz射頻電磁場(chǎng)環(huán)境，進(jìn)行全身暴露。經(jīng)過(guò)3周，12 h/d的暴露后，2組大鼠的形態(tài)學(xué)未發(fā)現(xiàn)改變，大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)GFAP的表達(dá)下降。

海馬體是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，是學(xué)習(xí)記憶功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[10-14]。Maskey等[15]將大鼠暴露于835 MHz射頻電磁場(chǎng)中，暴露1個(gè)月后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)變性。在Altum等[16]的報(bào)告中，在射頻電磁場(chǎng)暴露15 d，海馬CA1區(qū)和CA2區(qū)神經(jīng)元明顯減少，而CA3區(qū)無(wú)明顯差異。有報(bào)道，每天通過(guò)手機(jī)產(chǎn)生的900 MHz射頻電磁場(chǎng)，動(dòng)物暴露此環(huán)境15 d后，在海馬CA1、CA3和齒狀回亞區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)變性[17]。由此，筆者推測(cè)射頻電磁場(chǎng)可能海馬的CA1、CA3和DG區(qū)有所影響。

星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)腦內(nèi)的離子和神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，具有代謝功能，并在腦損傷時(shí)做出反應(yīng)[18]。GFAP與阿爾茨海默病（alzheimer’s disease，AD）、抑郁癥、中風(fēng)和腦缺血等腦部疾病有關(guān)[19-21]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠暴露于高強(qiáng)度射頻電磁場(chǎng)后發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)GFAP含量增加并對(duì)記憶功能有所影響[22]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，將50只雄性大鼠暴露在高功率的射頻電磁場(chǎng)后發(fā)現(xiàn)，大鼠的學(xué)習(xí)記憶明顯降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的GFAP含量增加[23]。因此，GFAP含量的增多可能會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能下降。NCAM與膠質(zhì)細(xì)胞瘤、一氧化碳中毒后遲發(fā)性腦病和癡呆等疾病有關(guān)[24-26]，同時(shí)也參與了學(xué)習(xí)記憶的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，1 800 MHz電磁波，度值為0.5 m W/cm2的暴露下可致出生后SD大鼠海馬NCAM表達(dá)下調(diào)，并且NCAM的下調(diào)可能是低劑量電磁波影響學(xué)習(xí)記憶的原因之一[27-28]。γ-氨基丁酸是一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，具有極重要的功能，與認(rèn)知功能存在一定的關(guān)系。早期便有研究者證明了在一定條件的電磁輻射暴露下，GABA受體表達(dá)較對(duì)照組增高進(jìn)而可能影響人的神經(jīng)行為[29]。另外，在強(qiáng)度為2 450 MHz，功率密度為為5.0、10.0 mW/cm2的條件下，研究者發(fā)現(xiàn)昆明小鼠的GABA含量增高，學(xué)習(xí)記憶損傷逐漸加重[30]。在其他領(lǐng)域也證實(shí)，低功率密度微波輻射可以通過(guò)增加GABA、降低谷氨酸對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生損害[31]。

本研究結(jié)果表明，大鼠暴露于射頻電磁場(chǎng)21 d后，大鼠海馬CA1區(qū)、DG區(qū)GFAP的表達(dá)下降。根據(jù)相關(guān)的研究，筆者認(rèn)為，在本實(shí)驗(yàn)條件下，1 800 MHz射頻電磁場(chǎng)暴露可對(duì)海馬CA1和DG區(qū)的GFAP表達(dá)有影響，本實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了初步探索，在同樣條件是否對(duì)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)以及DG區(qū)的GFAP、NCAM和GABA受體表達(dá)產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步的研究。